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重构抗体

发表时间:2019-08-07 12:29作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

重构抗体


重构抗体(reshaped antibody,RAb)   RAb是指利用基因工程技术,将人抗体可变区(V)中互补决定簇(complementarity determinative region,CDR)序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“改型抗体”,因其主要涉及CDR的“移植”,又可称为“CDR”移植抗体(CDR grafting antibody)”。RAb的产生和发展,使得多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗,包括通过人体免疫难以诱生的特异性的抗人抗原抗体,因而有诱人的前景。


尽管鼠人嵌合抗体有一些优点,但该类抗体中仍有近50%的成分来源于小鼠,在人体内应用时,仍有可能诱导产生HAMA。从而限制嵌合抗体的反复使用。为此许多学者都在试图减少鼠源蛋白在嵌合抗体内的含量。Riechmann等将大鼠抗人淋巴细胞单抗CAMPATH-1的超变区基因置入单抗(IgG)的重链和轻链基因中,这种重构型单抗在人抗体可变区基因序列内嵌入了鼠源抗体超变区基因序列,通过置换3个发夹状环(loops)的鼠抗体超变区,为人类抗体提供了一个新的抗原结合部位。为提高该重构型抗体与靶抗体的亲和力,作者还用苯丙氨酸(Phe)替换了第一个超变区中第27位的丝氨酸(Ser27→Phe)。增加了该突变型单抗与CAMPATH-1抗原的结合力。在人补体存在时,溶解人淋巴细胞的能力也增强。


1.重构抗体的分子设计运用序列分析及X线晶体衍射方法显示,抗体分子的V区是由CDR和骨架区(framework region,FR)两部分构成。重链V区(VH)和轻链V区(VL)各有3个CDR和4个FR。6个CDR折叠成环,从V区的一端有外突出形成抗原结合位点,抗体的特异性和亲和力主要由其决定的,尤其是VH。FR序列基本保守,在不同抗体间具有较高的同源性,同一抗体的FR可适用于不同抗原结合位点的移植。抗体分子的上述结构特性提供了设计和构建RAb的基础。

众多研究表明,仅仅保留鼠源McAb的CDR是远远不够的,常常会导致人源化改形抗体亲和力急剧下降。鼠源McAb的FR中存在一些重要的残基,它们对于正确有效形成抗原结合部位是有重要的作用,因此也应被保留以确保改形抗体最大限度地保留原抗体的亲和力,正确解决骨架区对其影响是成功的关键。一般来说,首先应选择人源化改形抗体的FR模板,确定模板之后,应尽可能地确定FR中影响抗原结合特性的,而要保留重要的鼠源残基;随后根据FR模板,鼠源McAb的CDR和需要保留的重要鼠源残基来确定人源化改形抗体的氨基酸顺序并构建该基因,将该基因连接到合适的表达载体上,并表达人源化改形抗体分子。

设计RAb V区的关键在于选择合适的人抗体重链和轻链作为鼠CDR的移植框架,到目前为止有两种策略。一种是选择并固定一种V区结构已知的人Ig作为RAb的通用FR,在构建V区时将鼠单抗FR中的某些特殊氨基酸残基置换人FR相应残基,通过反复调换直至亲和力恢复。该策略费时,且选择鼠源单抗CDR移植时受到同源程度的限制,仅适合于未建立人抗体基因库时运用。另一种策略是运用计算机分析比较人和鼠抗体V区核苷酸序列:从已知抗体序列的数据库中选出与鼠抗体FR有最大同源性的人抗体FR,作为RAb的FR,并用计算机模拟分析人和鼠抗体V区的空间构象,确定特殊的氨基酸残基,将这些残基与CDR一起移植到人抗体FR上,这是目前常用的策略。

无论何种策略,均是充分利用FR序列在进化上的保守性,通过某些特殊氨基酸残基的“突变”来减少免疫原性,提高抗体亲和力之目的。下面总结一下在选择正确的骨架区应遵循以下几点原则:①从已知的人可变区数据库选择与亲本抗体同源性最高的序列,以最大可能维持原有的构象;②将骨架区内可影响抗原结合部位的氨基酸改为亲本鼠单抗的残基,这包括:在立体构象中与CDR有接触的残基,它们涉及到抗原结合部位结构的形成;参与了VH-VL相互接触的残基,它们可影响CDR的相互位置;以及埋在功能区内部和外界接触很少的残基;③紧邻CDR两侧的骨架区序列往往比较重要。另外,可变区N端数个残基,可能涉及与抗原结合。


2.抗体新的“人源化”方法近年来又提出了其他的一些可变区人源化的设计方案,包括:表面残基人源化(resurfacing)和表位导向选择法(epitope guided selection)的表面残基人源化。

对已有抗体结构和序列的系统分析发现,人和鼠可变区的氨基酸残基的立体构象位置有98%是保守的,将一个表面残基改为一个相近的人的模式,不一定要改动很多氨基酸残基,鉴于抗原抗体反应仅涉及分子表面,因此有人提出将鼠单抗的可变区表面氨基酸残基人源化的构思。有研究在构建N901(anti-CD56)时,发现人-鼠之间,在轻链仅有3个氨基酸不同,在重链边仅有7个氨基酸区别;而在构建Anti-B4时,发现人-鼠之间轻重链分别仅有6个和10个氨基酸残基区别,而在这16个残基中,仅发现有3个可影响CDR构型。分别对这些残基进行修饰,就可以很好地维持改形抗体的亲和力。但这方面报道尚不多。对鼠单抗可变区基因序列进行较小变动,这样更有利于维持抗原结合功能,而对其人源化效果尚需进一步观察。

表位导向选择法:以鼠单抗为模板,将鼠单抗轻链或重链可变区基因与人重链或轻链可变区基因库配对,形成杂合抗体库,用相应抗原进行筛选,选出能和鼠源配对并保留其结合活性的人重链或轻链可变区基因,再用所获人可变区基因与另一条链的人可变区基因库配对,筛选出完整的人可变区基因,这个方法的优点可得到完全人源化抗体。


3.重构抗体的基因构建在确定了需要保留的鼠源残基后,根据所选定的模板和原抗体可变区的氨基酸顺序就可设计出人源化改形抗体可变区的氨基酸顺序。再根据氨基酸顺序,参照人抗体中各氨基酸使用的最大频率的密码子就可确定改形抗体可变区基因的核苷酸序列。

早期的研究在构建人源化改形抗体可变区基因时多采用寡核苷酸定点诱变技术,甚至全部化学合成该基因,这些方法费时费力成功率低,费用昂贵且需要所选作模板的人抗体基因。现在均采用长引物重叠PCR技术合成人源化改形抗体可变区基因。这样不仅使构建变得迅速、经济、简便和成功率高,而且可方便地在基因两端引入合适的酶切位点或其他核苷酸序列以便以后的克隆和表达。


4.改形抗体的特点和应用前景与嵌合抗体相比,改形抗体的免疫原性显著减少,这是因为改形抗体依据同源性原理选择FR后,减少了异源性蛋白质的部分,同时在将鼠源CDR移植于人FR的过程中丢失了许多抗独特型抗体能够识别的独特型结构,后者很可能在体内诱导人抗鼠抗体(HAMA)产生的那些抗原决定簇。由于在构建RAb时联合应用了骨架修饰方法,使RAb亲和力明显提高,还可通过重构选择活性较高的Ig C区而改善其效应功能。目前已构建30余种针对不同抗原的RAb,有些已用于临床诊治并取得令人满意的效果,如消除肿瘤,延长器官移植的生存期,改善类风湿性关节炎,全身性脉管炎,感染性疾病及免疫紊乱性疾病的临床症状等。


虽然目前人源化改形抗体取得了这些成功,但还应该看到,想要达到最小的免疫原性,即最小限度地保留鼠源残基的问题还没有妥善解决;而且改形抗体主要存在亲和力下降问题,这些问题的解决均有待于对CDR、FR及抗原与抗体结合位点之间复杂的相互作用进一步深入研究。


文章分类: 抗体技术资料
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