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重组单链抗体

发表时间:2019-08-07 12:30作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

重组单链抗体


重组单链抗体(ScFv)   又称Fv分子,因抗体分子量较大,在体内的穿透力差,不易进入组织中发挥作用,而用基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段(Fv分子或单链蛋白),可避免这一限制。结合抗原的单链蛋白由抗体VL区氨基酸序列和VH区序列经肽连接物(linker)连接而成。此外,肽链连接物还可将药物、毒素或放射性核素与单链抗体蛋白相融合,可用于临床诊断(成像检查)和治疗。最近,Chaudhary等成功地将抗TacFc基因与假单胞菌外毒素基因(PE40)重组到一起,经转染大肠杆菌,生产出单链免疫毒素“抗Tac(Fv)-PE40”,该分子可有效地杀伤IL-2Ra+细胞系,而对不表达IL-2Ra+的细胞系则无作用。


1. 单链抗体的基因构建   单链抗体与IgG不同,是通过连接肽将VL和CH连接而成的分子。鼠源抗体的VH和VL的基因分别由4个相对恒定的骨架区(FR)和3个高度可变的抗原互补决定区(CDR),共同构成抗原结合位点,它决定了每一种抗体的特异性。制备ScFv的关键是得到可变区基因,引物的设计非常重要,因此可以根据FR-1和FR-4的碱基组成和顺序分别合成扩增VH和VL基因的PCR引物。用PCR技术从杂交瘤细胞的基因组DNA或其RNA逆转录后的cDNA中扩增出VH和VL基因,用编码寡核苷酸接头(linker)将两者连接成ScFv基因。目前有两种拼接方法,一种是将接头设计在表达载体上,两端各有限制内切酶供VH和VL的插入。另一种拼接方法是通过将接头的编码序列分别设计在扩增VH和VL引物中,用PCR直接合成ScFv基因,此方法被称为重叠延伸拼接法,这种方法简单易行,而且不必因第一种拼接法中设计内切酶位点而引入不必要的氨基酸残基。将构建基因导入原核或真核表达载体中表达。目前常用的接头为(Gly4Ser)3。在ScFv中,接头承担了与CL和CH1稳定作用相同的功能,维持VH和VL间的构象。接头必须使重、轻链可变区自由折叠,使抗原结合位点处于适当的构型。在单链抗体基因构建中,单链抗体基因C末端可引入C-myc尾、组氨酸尾、脂类标签等,使表达产物更易于检测和纯化。如引入亮氨酸拉链、半胱氨酸等结构可用于构建双价抗体分子与双特异抗体(bispecific antibody,BsAb)或双功能抗体。单链抗体基因与其它基因如蛋白A、蛋白激酶、毒素等基因结合,还可构建成有新功能的抗体融合蛋白基因。


2. 重组单链抗体的表达

(1) 在大肠杆菌中表达:目前重组单链抗体大多在大肠杆菌中表达,与真核表达系统相比,大肠杆菌不能对表达产物进行糖基化修饰,但目前尚无证据表明糖基化与抗原结合能力有直接关系。尽管完整Ig已在大肠杆菌中获得表达,但活性抗体产量低。相反,微生物系统适合抗体片段的产生,特别是Fab、Fv和ScFv。

重组单链抗体在大肠杆菌中的表达主要有三种形式:①直接在细胞质中表达;②与其他菌体蛋白融合,表达融合蛋白;③分泌表达具有功能的单链抗体。近来重组单链抗体的表达主要采用分泌表达方式。重组单链抗体基因与引导分泌的信号肽Mel,OmpA,PelB,PheA等基因相连接,使表达产物分泌至大肠杆菌外周或培养液中,获得有活性的可溶性表达产物。分泌型表达系统的优点在于:直接产生功能性产物;细菌蛋白酶对产物降解大大降低。重组单链抗体表达与其它外源基因表达一样,受到基因拷贝数、mRNA的产生速率、mRNA的稳定性和翻译效果、启动子类型、基因结构、诱导条件、宿主环境等因素的影响。

(2) 在噬菌体内表达:一种含有信号肽序列的噬菌体显示系统能用于克隆ScFv,并在大肠杆菌中,使ScFv基因与gpⅢ融合,以融合蛋白的形式表达于丝状噬菌体表面。通过噬菌体呈现技术(phage display)产生亲和力和特异性更强的ScFv。


3. 重组单链抗体的应用  

具有结合特异性抗原作用的单链抗体蛋白分子量很小,便于连接其他辅助性物质,临床应用时有许多优点:①在血清中比完整单抗或F(ab′)2片段能更快地被清除;②作为外源性白的免疫原性较低;③没有Fc段,不能与细胞(Fc受体阳性细胞)结合,在体内治疗时避免非特异性杀伤,成像定位检查时,能使图像更清晰;④能进入实体瘤周围的微循环,因而治疗实体瘤的效果优于完整抗体。由于ScFv分子量小,免疫原性小,且易穿透致密的肿瘤屏障,进入实体瘤周围的微循环,缺乏Fc片段,去除Fc介导的受体结合,使得其快速地向肿瘤集中,因此通过与毒素基因重组,抗体将毒素定位于靶细胞,对靶细胞进行特异杀伤。通过重组技术在抗体分子上联接毒素、酶以及细胞因子等,这些复合物对肿瘤细胞有特异杀伤作用,被称为免疫毒素,常用的毒素为绿脓杆菌外毒素,蓖麻毒素及白喉毒素,细胞因子中IL-2和TNF都显示了较好的效果。单链抗体免疫毒素易于大量生产以满足临床治疗需要。


单链抗体在组织中清除速度快,去除Fc介导的受体结合,本底低,图像清晰,用于肿瘤的影像研究明显优于完整的抗体。①“细胞内免疫”(intercellular immunization)是在细胞内表达特异性识别某一蛋白抗体,干扰特定基因产物活性,例如,抗癌基因ras的单链抗体,在细胞浆表达后可阻断ras功能;抗艾滋病病毒外壳蛋白的ScFv可抑制HIV细胞内复制等;②在基础研究中,应用于抗原结合位点的高分辨率X射线晶体图研究,同时由于ScFv基因易于操作,也是研究基因结构与功能关系的理想系统,ScFv基因与编码一些已用于免疫试验的酶基因融合,可以大大提高检测的灵敏度。另外,设计一段“亲和臂”与抗体片段共表达,是纯化抗体蛋白的一种非常有用的方法。例如将5个组氨酸残基连到VH的C末端,进行固相金属离子亲和层析,或在抗体C末端融合葡萄球菌蛋白A,进行抗体的亲和层析等。


文章分类: 抗体技术资料
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