Moki(C15ORF 48)的编码和非编码作用在调节宿主炎症和免疫中的作用

Mito-SEPs是一种小的开放阅读框编码肽，定位于线粒体以调节新陈代谢。由于mito-SEPs与炎症之间存在着一种有趣的负相关关系，我们在这里筛选出一种改变炎症结果的mito-SEP，并报告了一种名为“炎症过程中细胞色素C氧化酶的调节因子”(MOCCI)的mito-SEP，它在炎症和感染过程中被上调，以促进宿主保护的解决。细胞色素C氧化酶(CompactIV)NDUFA 4亚基的类似物摩奇在炎症过程中取代了复合物IV中的NDUFA 4，从而降低线粒体膜电位，降低活性氧生成，导致细胞保护和免疫应答减弱。这个莫奇转录本还生成miR-147 b，其目标是NDUFA 4MRNA具有类似的免疫抑制作用，但同时增强了钻机-I/MDA-5介导的病毒免疫。我们的工作揭示了莫奇(C15ORF 48)对宿主炎症和免疫的双向调节作用，以保护宿主在感染和炎症过程中的免疫功能。

炎症触发器激活内皮细胞，启动一系列的信号通路，目的是清除危险信号并解决炎症反应，最终使内皮恢复到其基础状态。1。如果不这样做，就会导致过度的血管炎症，导致急性环境下的组织损伤，并导致心血管疾病，如动脉粥样硬化和慢性纤维化。虽然肿瘤坏死因子-α(α)、白细胞介素-1β(IL-1β)或白细胞介素-6(IL-6)等广泛的免疫抑制策略被中和抗体阻断，但在减少血管炎症的临床试验中已经取得了很好的效果。2其相当大的副作用和有限的疗效表明，需要替代的，更具体的靶点，可能下游这些细胞因子，最好是特定于内皮。

线粒体是多方面的细胞器，最著名的是它们通过氧化磷酸化和细胞色素c释放在细胞能量产生中的作用。除了能量动态平衡外，线粒体在调节炎症的发生和结果中的作用也越来越受到人们的重视。3。一个典型的例子是从呼吸链产生活性氧(ROS)。曾经被认为是纯致病的，现在人们认识到低水平或生理水平的ros在促炎和促分解信号通路中都起着规范的作用，而过量的ros会导致促炎机制的慢性激活，从而导致组织损伤。4。线粒体也是通过MAVS定位激活干扰素反应(IR)的近端位点。5或通过心磷脂的挤压激活炎症6。线粒体dna的泄漏还可通过c-气/刺途径触发IR或炎症细胞死亡。7。此外，克雷布斯周期的代谢物如琥珀酸和衣康酸被越来越多地认为是炎症的调节剂；例如，通过调节NLRP 3炎症体和IR途径。8,9。虽然线粒体功能障碍在心血管疾病的发病机制中有着广泛的意义，但线粒体在内皮健康和功能障碍中的特异性功能受到的关注相对较少。特别是，内皮细胞线粒体是如何对炎症反应作出反应和调节的，人们对此了解甚少。

在此之前，我们的实验室报告了一种优势的小开放阅读框架(SORF)编码肽，定义为小于100个残基的蛋白质，定位于线粒体(mito-seps)。10。这些肽在线粒体的不同过程中具有功能，包括电子传递、脂质代谢和钙稳态。我们问的问题是，mito-SEPs是否在调节炎症方面发挥了迄今未被重视的作用。例如，Fitzgerald和他的同事最近发现了一种线粒体肽Mm 47，它是激活NLRP 3炎症体所必需的。11.

在本研究中，我们进行了一个蛋白质组学筛选，以发现mito-SEPs在原代人主动脉内皮细胞(HAECs)中，可以促进炎症的解决。我们报告了细胞色素C氧化酶在炎症过程中的调节因子(Mocii)的发现，这是一种mito-sep编码的细胞色素C氧化酶。C15ORF 48。的未翻译区域(UTR)中与miR-147 b协同工作。C15ORF 48，在复杂的IV(CIV)中取代其类似的NDUFA 4。这通过减少细胞死亡和细胞因子的产生来抑制CIV的活性，保护宿主组织免受过度的免疫病理。此外，miR-147b通过通过rig-I/MDA 5途径增强IR，发挥了强大的抗病毒作用。类的编码和非编码功能。C15ORF 48协同保护宿主在感染期间，说明小肽如何与其编码转录本协调，以达到最大的生物影响。

蛋白质组学筛选i燃烧-相关Mito-SEPs(我-)识别莫奇，编码由C15ORF 48

Mito-SEPs是从核基因组中的sORF编码的肽，被导入线粒体，用于线粒体功能的各个方面。在描述mito-seps参与代谢调节的同时，我们发现mito-seps与扩张型心肌病患者心脏转录中的炎症通路(如干扰素信号)之间有一种意想不到的负相关关系。12，慢性血管炎症(图1.1A)。这促使我们设计出一种策略来发现迄今尚未被发现的mito-SEPs，它们参与调节炎症，特别是血管系统中的炎症。为此，我们采用了一种基于核糖体谱(ribo-seq)的无偏蛋白质基因组策略(ribo-seq)，并对IL-1β处理的原始HAECs进行了rna序列分析(rna-seq)。1B)。我们选择治疗后45分钟、12小时和24小时捕捉包括解析度在内的炎症反应的全过程，如活化的促炎症标记物NF-κB活性、ICAM-1和VCAM-1的下降趋势(图1)。1B)。我们使用两名健康男性供者的HAEC一式三份，以避免供体特异性的影响，并进行配对的Ribo-seq和RNA-seq。我们的Ribo-seq协议生成了28~30个核苷酸核糖体保护片段(RPFS)，在带注释的蛋白质编码ORF中，平均帧内周期性为81.98%(补充图)。1A，b)。然后我们使用了RiboTaper13从我们的数据集中识别出属于已知一致编码序列(CCDS)区域的所有已表达的ORF。这些筛选只包括编码小于100个氨基酸的多肽的ORF，并排除那些与较大蛋白质重叠的多肽(如图所示)。1C)。只保留那些符合基于已知SEP参数的质量控制指标的标准(参见方法)。其中，我们筛选了那些在IL-1β刺激过程中在rna水平有显著差异表达的人(补充数据)。1)。最后，候选基因和多肽通过我们的线粒体蛋白基序和基于基因标记的mito-sep预测管道传递。10以鉴定线粒体SEPs(图1.1C，d)。如果线粒体基因与有病理或生理炎症的四种组织中的两种或两种以上的MitoCarta基因相关，则一位候选人被指定为线粒体基因标记(图一)。1D表1，以及补充数据1)。我们鉴定出21种可能的炎症mito-seps(我-Mito-SEP)(图1.1C)。最后，我们根据每一个存活的候选基因的差异表达程度，以及它是阳性的线粒体模体，基因标志，还是两者都进行了分类(图一)。1E)。顶我-Mito-sep候选肽是由C15ORF 48基因，又称NME-1，IL-1β处理后最大的上调，两种预测方法均预测为线粒体(图2)。1E)。我们还证实，在IL-1β治疗后，Ribo-seq阅读量增加，表明炎症过程中有更多的翻译(见图)。1F)。帧内P-位点读取也被检测到贯穿整个ORF(图)。1g)。这使得我们能够区分不同的翻译起始点，并准确地确定SEP的起始位置。

基因模块关联判断(G-mad)利用大量的表达数据，根据基因与其他基因的表达模式来预测基因的功能。在人体组织中，C15ORF 48表达与参与调节细胞因子活性的基因有关，特别是IL-10；对微生物感染、干扰素信号和白细胞趋化的反应(补充图)。1C)。值得注意的是，在一些组织，如动脉，C15ORF 48与细胞和病毒mRNA翻译相关的基因呈负相关(补充图)。1C)。这些结果表明C15ORF 48可能在调节对细菌和病毒等病原体的先天免疫反应方面发挥作用。事实上，人类外周血单个核细胞(PBMCs)的单细胞rna-seq(scrna-seq)数据表明，C15ORF 48MRNA在基础和干扰素刺激状态下在单核细胞中高表达(补充图)。2A)。然而，在非免疫细胞中，C15ORF 48健康组织中低表达，在慢性炎症如动脉粥样硬化(附图)中内皮细胞表达上调。2B)。同样，在小鼠感染流感期间，C15ORF 48在粒细胞和单核细胞前体以及淋巴管内皮细胞中被上调(补充图)。2C)。这些数据一起指出了C15ORF 48在单核细胞和内皮细胞及吞噬细胞的诱导作用下，无论是急性致病菌还是慢性无菌炎症。

MOCI是复合物IV的NDUFA 4，第14亚基的类似物。

与我们的调查结果一致C15ORF 48编码一个假定的mito-sep，G-mad在所有组织之间有很强的正相关性。C15ORF 48和基因编码呼吸链CIV(红色)，除了炎症(补充图。1C)。编码的SEPC15ORF 48我们以前曾提到过一项大规模的相互作用研究，目的是与电子传输链(等)的组成部分相互作用，在这种研究中，它被过度表达为一个带标记的诱饵来捕获相互作用，尽管它对蛋白质没有明确的功能。14。摩奇在脊椎动物的进化上是保守的(图一)。2A)但不存在于真菌中。在NDUFA 4和NDUFA4L2的体系结构中，MOQI包含一个唯一的B12D结构域(NADH-泛醌还原酶复合物1 MLRQ亚基)。2A，b和补充图。二维空间)。事实上，莫奇与NDUFA 4/NDUFA4L2蛋白在氨基酸水平上有很强的保守性，而NDUFA 4/NDUFA4L2蛋白在定义上也是SEPs(附图)。二维空间)。NDUFA 4最初被指定为配合物I(CI)的一个辅基(NADH：泛醌氧化还原酶)，但后来被发现是CIV的第14个亚基。15,16,17，我们用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)证实了NDUFA 4和COX 4之间的共迁移。2E)。为了阐明MOQI的功能并验证其与CIV的相关性，我们首先测定了其在过表达的HEK293T细胞中的亚细胞定位，其中线粒体富集组分通过westernblot检测到了MOCi的存在(如图所示)。2C)。对离体线粒体进行的差异提取分析表明，线粒体内膜(IMM)定位于线粒体内膜(图1)。二维空间)，与预测的跨膜结构域的存在相一致，并经蛋白酶K(PK)保护试验证实。2E)。为了验证mocii是etc，特别是cv的一部分，我们过高地表达了of编码鼠标moci。旗子通过AAV 9介导的(AAV-莫奇)传递到心脏，这是一个内皮丰富的器官，并对分离的组织线粒体进行BN-PAGE分析。2F)。免疫印迹法证明了该抗体的存在。旗子与催化亚基MTCO-1共迁移。2F)。这是用一种抗旗标抗体证实的(补充图)。2F)。此外，利用二维BN-SDS PAGE，我们证实了MOQI与MTCO-1的完全共定位，CIV单体和二聚体占据的比例最高，超配合物中存在一些化合物(图1)。2G).

在炎症过程中从NDUFA 4到MOQI的合成开关

除了莫奇ORF，3‘UTRC15ORF 48寄主HSA-miR-147 b(无花果)2A)，一种进化上保守的miRNA，以前曾与目标有牵连。NDUFA 4MRNA通过保守的种子序列在其3‘UTR(图1)。2B)。在HEK293T细胞中，miR-147b的转染模拟下调。NDUFA 4MRNA和NDUFA 4蛋白(附图)3A，b)。这些数据表明C15ORF 48MRNA有两种结果：在CIV和miR-147b介导的MOCCI介导的NDUFA 4的下调，实质上影响CIV中的亚基开关。由于mRNA与其加工成前miRNA是相互排斥的事件，我们首先研究了这两个过程是否发生在HAECs中。根据HAECRibo-seq的数据，在约25.7%的HAECs中翻译出了该多肽，以响应IL-1β(如图1所示)。3A和补充图。3C)，通过与TOMM 20共同定位来判断其对线粒体的明确定位(如图20所示)。3B)。同时，IL-1β处理能明显诱导成熟的miR-147 b的生物发生。3C)。这表明，在IL-1β刺激下，HAECs可同时产生MOCI和miR-147b，两者可能协同作用，加强CIV从NDUFA 4到MOQI的转换。重要的是，HAECs显示NDUFA 4到MOCi开关是由内源性上调介导的。C15ORF 48细胞内流式细胞术对IL-1β的反应。三维空间)。我们在A 549肺上皮细胞中验证了这一NDUFA 4到-MOQI开关(如图所示)。3E)，它们像HAECs一样可以同时上调两者。C15ORF 48成绩单和和平号-147 b对IL-1β治疗的反应(补充图)。三维空间)。相反，CRISPR/Cas9-介导的对MOCICORF的破坏C15ORF 48(“莫奇-KO”，附图。3E)(补充图1。3F)和NDUFA 4下调(补充图1)。第三代)白细胞介素-1(IL-1β)处理的肝细胞。然而，mir-147 b在ko细胞中也被破坏，尽管突变体水平正常。C15ORF 48MRNA(附图)3H)。因此，我们无法使用MOCI-KO HAECs分离出MOQI和miR-147b的影响。为了进一步阐明moci肽和miR-147 b对所观察到的NDUFA-to-moci开关的相对贡献，我们稳定地表达了人毛细胞的ORF(下称“mocii”)和全长。C15ORF 48通过慢病毒途径产生的mRNA(它同时产生Moki和miR-147b，下称“WT-mRNA”)。与MOCI-KOHAECs的结果相一致，我们发现单用MOQI就足以使NDUFA 4蛋白水平降低61.2%，而WT-mRNA使NDUFA 4蛋白水平降低了80.6%，表明MOQI在NDUFA 4衰减方面的作用与miR-147 b相当(如图1所示)。3F和补充图。3I)。实际上，在C15ORF 48MRNA到异亮氨酸(以下简称“ATGmut-mRNA”)，同时保存miR-147b生物发生。第三代)，仅导致NDUFA 4蛋白表达下调31.5%。3F和补充图。3I)。Westernblot也证实了这一点，表明NDUFA 4蛋白水平在MOCI和WT-mRNA HAECs中明显降低，而ATGmut HAECs仅表现为中度下调(图一)。3H)。而wt的miR-147 b和atgmut-mRNA的表达降低。NDUFA 4MRNA约为50%，莫奇未受影响。NDUFA 4MRNA水平(附图)3J)。这些结果共同认为，单是莫奇就足以下调NDUFA 4蛋白水平，而不影响其mRNA水平。MIR-147b通过衰减NDUFA 4MRNA和潜在协同与莫奇降低NDUFA 4蛋白。总之，莫奇和miR-147b对NDUFA 4蛋白和mRNA水平有不同程度的控制(附图)。3K).

为了证实这些体外观察，我们用定量质谱法分析了AAV-MOQI和AAV-GFP注射小鼠线粒体的蛋白质组，发现MOQI在体内足以下调NDUFA 4蛋白水平(图1)。4A和补充数据2)。经PAGE分析，AAV-MOQI线粒体总(SDS-PAGE)和CIV相关(BN-和BN-SDS PAGE)NDUFA 4减少60%。4B，c和补充图。4A)。CIV(由COX 4检测)和其他配合物的水平没有改变(图1)。4A，b和补充图。4B)。这些结果证实，单是Moki就足以下调NDUFA 4蛋白水平，可能是通过将NDUFA 4排除在CIV之外。MIR-147 b与摩奇协同作用，通过靶向调节开关。NDUFA 4mRNA由于莫奇的预测结构和NDUFA 4的结构是叠加的(图一)。4D)，我们假设它们在CIV结构中占据相同的位置，即在MTCO-1附近的配合物表面和靠近血红素-铜双核催化核(图1)。4E)。为了检验莫奇和NDUFA 4在CIV复合物中是否相互排斥，我们在自然非变性条件下免疫共沉淀了莫奇标志。4F)和蔗糖梯度纯化的CIV单体配合物(附图)。4C)AAV-Moki和AAV-GFP心肌线粒体。使MTCO-1富集231%的MOCI不能与NDUFA 4共沉淀(图4)。4F，补充图。4C)。这些数据表明，MOQI和NDUFA 4不存在于相同的CIV复合物中，并支持将NDUFA 4和MOQI结合到CIV或CIV同工酶的交替组装中的模型，这就提出了莫奇相对于含有NDUFA 4的CIV复合物的功能意义的问题。

莫奇降低CIV活性、线粒体膜电位和活性氧生成。

我们最初的目的是确定Moki在THP-1单核细胞及其巨噬细胞衍生物中的分子功能，这是最常用的研究炎症调节机制的方法。然而，尽管C15ORF 48IL-1β处理M1巨噬细胞的转录和成熟miR-147b(补充图)。5A，b在THP-1单核细胞或THP-1衍生的M_1巨噬细胞中，用流式细胞仪检测到的M_c肽不被翻译(附图)。5C)和Westernblotting(附图)。5D)。因此，在体外培养的人单核细胞和巨噬细胞只产生miR-147 b。C15ORF 48轨迹。因此，我们在HAEC和A 549细胞上进行了所有后续实验。首先，我们研究了NDUFA 4到-MOQI开关对CIV活性的影响，CIV活性可以通过加入类似亚基来调节(见讨论)。由于单用Moki就足以使该开关再次发生，我们用TMPD作为电子供体，从AAV-摩奇小鼠中分离出心肌线粒体，测量了CIV的耗氧量和电子流量。本实验利用CIV的耗氧量作为CIV的通量读出，而CIII受抗霉素A的抑制，FCCP解偶联ATP(图1)。5A)。AAV-莫奇线粒体的CIV电子通量明显低于对照线粒体(图1)。5B)，无明显变化的整体不耦合鱼藤酮敏感通量通过CI(补充图)。5E)或耦合呼吸(补充图。5F)。这些结果提示，在不影响呼吸输出的情况下，moci掺入可以降低cv的活性，这可能是由于已知cv在两种分离线粒体中的过量容量和低通量控制系数所致。18完整的组织19。通过对HAECs和A 549的通透性分析，我们发现Moki过表达可导致CIV活性的小幅度降低(图1)。5C)。这也没有导致对丙酮酸的整体耦合呼吸减少(补充图)。5G)不影响完整的HAECs和A 549的基础呼吸或最大呼吸。5H)，表明尽管CIV活性降低，但Moki的表达并不影响呼吸能力。以偶氮敏感的细胞色素c还原动力学测定CIV酶活性的分光光度法(Rca)，证实了CIV在A 549细胞中的衰减活性。20(无花果)5D)。CIV活性的降低伴随着膜电位(∆Ψm)的降低，这是用四甲基罗丹明乙酯测量的。21在HAECs和A 549中的比率计JC-1(图1)。5E)。膜电位降低会降低活性氧的产生。22,23。事实上，我们发现，用2‘，7’-二氯二氢荧光素(DCF)测定的HAECs和A 549的总ROS值较低(图2‘，7’-二氯二氢荧光素(DCF))。5F)和Amplex Red(图1.5G)，线粒体ROS的测定用mitoSOX™红(补充图)。5I)与WT细胞比较。

Mir-147 b降低cIV活性，但不降低膜电位和ros生成。

以前曾报道过NDUFA 4的耗竭会减少CIV的活性。15影响呼吸。由于miR-147 b是针对NDUFA 4的，所以我们询问miR-147 b是否能重复MOCI的作用。转染miR-147b类似于WT-mRNA细胞(补充图)。6A)将CIV活性降低到中间水平(如图所示。6a，b)而不影响呼吸(附图。6B)。相反，siRNA介导的NDUFA 4基因敲除显著降低了CIV活性，影响了完整细胞的基础呼吸(图一)。6a，b和补充图。6B)。同样，ATGmut-mRNA也降低了CIV的活性。6C)而不影响呼吸(附图。6C)。因此，莫奇和miR-147b都能在不影响呼吸链输出的情况下降低CIV活性，而完全去除NDUFA 4而不被莫奇取代(即SiNDUFA 4)会减少呼吸(补充图4)。6B)。令人惊讶的是，miR-147b并没有降低HAECs和A 549(补充图)中的膜电位或ROS生成。6d)。与此相一致的是，无论是WT-mRNA或ATGmut-mRNA HAECs或A 549均未降低膜电位(图1)。6d)或ROS生产(图1.6E，f)。相反，WT-mRNA的表达--它同时产生了莫奇和miR-147b--完全逆转了膜电位的下降和莫奇引起的活性氧生成(见图)。6d，f)。然而，这种拮抗并不是由于miR-147 b在WT和ATGmut-mRNA中的作用，因为miR-147b转染不能使MOCi细胞的膜电位恢复到WT水平(补充图1)。6d)或增加ROS(补充图。6E)，提出了以下可能性：C15ORF 48转录本可能具有额外的非编码作用来调节线粒体膜电位。值得注意的是，NDUFA 4的敲除也没有降低线粒体膜电位，这表明MOCI的掺入会降低膜电位和活性氧的产生，而不是减少NDUFA 4的去除(补充图4)。6d)。这些结果说明了具有以下含义的复杂场景。首先，膜电位的降低和ROS的产生并不仅仅是由于蛋白质过度表达而导致线粒体完整性受损，ASWT-mRNA的表达水平与MOCi ORF相似(图1)。3F)。第二，膜电位和活性氧生成的降低可能不是CIV活性降低的直接原因，因为miR-147b在不降低膜电位和ROS的情况下降低了CIV活性。最后，这些结果表明，MOCI掺入在功能上并不等同于通过miR-147 b或siNDUFA 4去除NDUFA 4，如图所示。6G.这为miR-147 b在3‘UTR中的存在提供了一个概念性的解释。C15ORF 48尽管单是摩奇就足以在蛋白质水平上介导NDUFA 4到-MOQI的转换。同时下调NDUFA 4MiR-147b的mRNA可能有助于加强开关，它可能有额外的作用，莫奇无法履行。接下来，我们将探讨莫奇和miR-147b表达在炎症反应中的作用。

莫奇和miR-147 b降低促炎细胞因子的产生

为了解决这个问题，我们首先研究了一个NDUFA 4到摩奇开关单独介导的影响。C15ORF 48人类细胞中的表达在急性细菌和病毒感染中被上调(附图)。7A和表1)，暗示在免疫应答中扮演一个角色。尽管ECs不是白细胞，但它们是抵御血液传播病原体的第一道防线，而且容易受到感染引发的过度炎症。通过将具有相同表达模式的基因聚类到模块中(见方法)，我们的IL-1β刺激haecrna-seq数据表明C15ORF 48与基因共表达于两个模块(图2模块2和模块3)。7A)。这些模块用于负调控细胞因子的产生和活化的T细胞增殖，以及IL-10的产生，它们代表了旨在通过限制感染期间过度免疫激活来保护宿主的抗炎策略。因此，我们研究了莫奇对病毒攻击后HAECs细胞因子产生和ATGmut-mRNA的影响。我们使用黄病毒登革热(DENV)和寨卡病毒(ZIKV)，因为它们能够在ECs中感染和复制，并诱导。C15ORF 48表达式(图1.7b)。在DENV/ZIKV作用下，HAECs主要分泌IL-6、IL-8、MCP-1(CCL 2)、CXCL 10和精氨酸酶。干扰素和其他常见的促炎细胞因子的水平是无法检测的(补充图)。7b)。莫奇和WT/ATGmut-mRNA显著抑制IL-6和MCP-1的分泌。7C，d而MOCI-KOHAECs则表现为相反的表型(如图所示)。7E)。转染miR-147b模拟物和siNDUFA 4也可减少MCP-1的分泌，证实在WT和ATGmut-mRNA中观察到的作用可归因于miR-147b(补充图)。7C)。这些结果共同表明，Moki和miR-147b对HAECs中促炎性细胞因子的产生有抑制作用。这种效应并不局限于病毒诱导的细胞因子的产生。与DENV/ZIKV感染相比，MOQI、WT和ATGmut-mRNA在细菌内毒素LPS的刺激下，也足以降低IL-6、MCP-1甚至IL-8的分泌，与DENV/ZIKV感染相比，其诱导HAECs分泌细胞因子的能力更强。7F)。因此，我们认为，在培养的HAECs和A 549细胞中，Moki和miR-147b都能在基础和炎症刺激下降低MCP-1和IL-6的产生。

由于莫奇和miR-147b都降低了CIV的活性，我们的研究结果表明CIV的衰减足以抑制MCP-1和IL-6的分泌。这与最近的研究结果一致，即用氰化钾抑制人外周血单个核细胞中的cIV，导致广泛抑制促炎细胞因子的产生。24。我们证实了这些发现在HAECs中使用了一种CIV抑制剂叠氮化钾，它显著减少MCP-1和IL-6的分泌，在24小时的潜伏期内没有任何细胞毒性作用(补充图)。7D)。因此，CIV抑制或衰减抑制了促炎性细胞因子的产生.在MOQI HAECs的情况下，ROS的减少也可能导致MCP-1和IL-6的减少。抗氧化剂对HAECs的治疗作用N-乙酰半胱氨酸(NAC)，它有效地降低了HAECs中的ROS(补充图)。7E)，在基础水平和LPS暴露后，IL-6和MCP-1的产生明显降低，其水平与莫奇HAECs相当(补充图)。7F)。然而，由于miR-147b、WT和ATGmut-mRNA在不降低膜电位和ROS的情况下抑制细胞因子的产生，这不可能是CIV抑制MCP-1和IL-6产生的唯一机制。

莫奇和miR-147 b通过钻机-i/mda 5调节红外信号。

共表达C15ORF 48与I型干扰素相关的基因。7A)促使我们检查C15ORF 48抗病毒免疫表达。有趣的是，摩奇病毒中有一个病毒同源体。25表明它已被进化选择，并被病毒所取代，通过调节IR来逃避免疫。I型IR的典型途径是IFN刺激的基因因子3(ISGF 3)通路.ISGF 3由IFN-调节因子IRF 9诱导，导致STAT 1/STAT 2介导的含有IFN刺激反应元件(Isres)的基因激活，也称为干扰素刺激基因(Isgs)。26。与所观察到的MOQI抗炎作用相一致，感染后48h HAECs的RNA-seq分析表明，Moki HAECs抑制了DENV和ZIKV感染诱导的基因的上调，这些基因对ISG具有高度的富集作用(图1)。8A和补充图。8A)。差异调节的ISGS的富集分析表明，STAT 1/STAT 2/IRF 1/IRF 8/NF-κB靶基因受到MOQI的强化抑制，而受新发现的抗炎转录因子ETV 7和microRNAmiR-146 a(补充图)调控的基因也受到抑制。8A)27,28。这些数据表明，莫奇抑制了病毒感染后的IR。相反，WT-mRNA和ATGmut-mRNA呈相反的增强IR的趋势。8A)。由于IR负责建立抗病毒状态，我们测试了这些观察到的趋势是否导致病毒复制的功能后果，如病毒基因组(VG)拷贝数在感染48小时后的翻倍变化。与观察到的IR和ISGS的趋势一致，MOQI HAECs有较高的VG拷贝数，而C15ORF 48WT-mRNA、HAECs和ATGmut-mRNA在感染后48h VG拷贝数较低，ATGmut-mRNA介导的抑制作用达到统计学意义。8B)。重要的是，我们没有发现感染后2h VG拷贝数的显着性差异(附图)。8B)，认为病毒的进入没有受到明显的影响。在A 549中也观察到类似的趋势，其中MOQI增强，ATGmut-mRNA抑制病毒拷贝数，WT-mRNA呈中间表型(图)。8C)。病毒复制结果与干扰素-βA 549细胞中的mRNA是衡量IR大小的一种方法，它被MOQI抑制，WT-mRNA增强(附图)。8C)。其他ISG由ATGmut-mRNA(补充图)显著增强.8D)。这些数据表明miR-147b通过刺激IR来抑制病毒复制。事实上，转染miR-147 b足以抑制ZIKV的复制。8D和补充图。8E)。重要的是，miR-147b的抗病毒作用通过siNDUFA 4的转染而被重述(见图4)。8D)与miR-147b介导的水平相匹配的水平。NDUFA 4MRNA下调(附图)8F)。这些结果表明miR-147 b通过下调来增强IR。NDUFA 4在没有被莫奇取代的情况下。另一方面，在HAECs和A 549两种病毒感染后，MOCi掺入降低了细胞死亡(如图1所示)。8E)。因此，除了抑制促炎细胞因子的产生外，莫奇还发挥了细胞保护作用，尽管其代价是病毒复制略有增加。

最后，我们试图探讨莫奇和miR-147b对IR的调控机制。由于NDUFA 4到MOQI开关降低了ROS的产量，我们检查了MOCI是否通过ROS还原来抑制IR。与我们的预期相反，NAC对HAECs和A 549的治疗减少了VG拷贝数(补充图)。9A)。MOCI-miR-147b对宿主抗病毒反应的调控不太可能与ROS调控直接相关。因此，我们寻求寻找更多的机制，miR-147b抗病毒免疫。在DENV和ZIKV感染后，病毒的rna基因组由细胞内rna传感器rip-i和mda 5检测。29，导致NF-κB和IRF 3/7的激活，这是IR的转录介质。9A)30。在ZIKV感染后，ATGmutHAECs和A 549都表达了更高水平的Rig-I及其下游适配器MDA 5(图5)。9B)。WT-mRNA水平高于对照，但低于ATGmut(图1)。9B)，与中间抑制病毒复制有关(见图。8B，c)并再次强调莫奇与miR-147b在IR方面的对抗。磷酸化p65测得ATGmut-mRNA细胞的NF-κB活性在RAP-I和MDA 5下游均有增强作用(如图6 5所示)。9B)。尽管钻机-I水平有所提高，WT和ATGmut-mRNA细胞仍能维持其抑制促炎症性MCP-1产生的能力，这是对一种钻机-I激动剂(补充图)的反应。9B)。总之，miR-147b增强了I/MDA 5/NF-κB的活性，增强了IR，并在病毒感染期间提供了宿主保护。另一方面，莫奇抑制了这一反应，防止细胞过度死亡和过度炎症。总之，在一次严重的传染病挑战中，C15ORF 48它的编码和非编码功能，通过结合莫奇的抗炎和细胞保护作用以及miR-147b的抗病毒作用，来改善炎症和宿主保护之间的平衡(图一)。9C)。这两种活动可能导致宿主在病毒感染期间协同保护，一方面控制病毒复制，另一方面控制宿主产生促炎细胞因子和导致组织损伤的细胞死亡。

通过与诸如rlrs和nlrs等危险和损伤的胞浆传感器相交，线粒体完整性和功能是炎症激活的关键决定因素。31。根据我们的观察，线粒体SEPs显示出一种与炎症基因信号有关的程序化的抗关联(如图所示)。1A)，我们进行了一个无偏见的蛋白质组学筛选，以揭示调节炎症的mito-SEPs。这导致了对.C15ORF 48作为最高的炎症mito-SEP或“我-Mito-SEP“。这个C15ORF 48基因也被称为NME-1作为一种功能不明的癌症相关基因32。总之，结果在mito-sep诱发的急性炎症过程中发现了线粒体程序，我们将mito-sep命名为moci，该程序由C15ORF 48基因。该基因在病毒感染或促炎刺激IL-1β后激活，导致CIV第14亚基从NDUFA 4-切换到-MOCi，伴随着miR-147 b在胞浆中的生物发生(图1)。9C)。莫奇能有效抑制CIV活性，降低膜电位，降低活性氧生成。ROS水平的降低反过来有助于抑制促炎细胞因子的产生和IR，但miR-147b的强抗病毒活性减轻了这一作用。在这种方式下，MOQI和miR-147b在HAECs中的协同和互补作用通过抑制宿主炎症和病毒复制，在急性病毒感染后提供最大的宿主保护。

呼吸链由5个多亚基等复合体组成，由位于线粒体(Mt)DNA中的13个基因和核DNA中的80多个基因编码。ETC位于IMM中，负责细胞ATP生产的80%以上。传统上被视为执行内务管理功能的不变机器，越来越明显的是，ETC复合物可以在不同的组织类型和细胞环境中具有不同的组成。例如，CI由45个亚基组成，其中一半以上是发挥非酶作用的辅助亚基，在CI和呼吸链超复合物的组装和稳定性方面具有潜在的潜力。33。某些亚基的表达水平因组织而异，说明不同细胞类型的CI组装不是不变的。同样地，包含14个亚基和20多个组装因子的cv在etc复合物中也是独一无二的，因为它的几个核心亚基具有以特定发育阶段或氧气反应方式表达的异构体。34。这些CIV同工酶的氧化势和质子泵效率不同。35对呼吸控制信号的反应。例如，由于氧气是CIV的一种底物，CIV的活性必须直接与氧的有效性相耦合和调节。这是通过氧调节表达的CIV亚基变体，即COX 4-1和COX 4-2.当cox 4-1的表达普遍存在时，cox 4-2对肺上皮具有较高的特异性，可在低氧胁迫下诱导cIV活性增加，并优化其效率，包括在低氧利用度下降低ros。36。同样地，在低氧压力下，将COX 7A2替换为COX 7A1。37。也有报道说，低氧诱导的higd1A等CIV的组装因子在氧限制时对civ的活性有一定的促进作用。38。因此，文献对CIV同工酶的应用是必要的，因为在不同的细胞环境下，CIV同工酶被用来满足不同细胞环境下的能量需求。由于ETC和OXPHOS与其他细胞生物学领域如细胞死亡和炎症的控制之间存在着显著的相互作用，CIV同工酶是否也参与了这些功能的调控是一个突出的问题。之前，Pagliarini和他的同事在一个高通量的interactome筛选中发现了一种线粒体非特征(X)蛋白(Mxp)，它与etc的成分相互作用。14。在这里，我们证明了MOCI是NDUFA 4的一个相近的类似物。NDUFA 4以前被认为是CI的一个亚基，后来又被重新归类为成熟CIV复合物的第14个亚基。15,16,17。由于它在细菌、真菌和哺乳动物CIV的几个已解决的结构中没有CIV亚基，所以它作为一个完整的CIV亚基而备受争议，这可以用它对胆酸洗涤剂的敏感性来解释。17，将NDUFA 4从复合体的其余部分删除。CIV组装不需要NDUFA 415,16，而是推测通过防止civ单体的二聚来提高civ的活性。17。NDUFA 4的表达是构成性的，且普遍存在，而IL-1β在炎症刺激下转录和翻译诱导了MOCi的表达。我们证明了茂奇与成熟的CIV单体和二聚体结合，并在较小程度上与超配合物结合。此外，它与NDUFA 4的下调同时发生在CIV中，与NDUFA 4具有几乎可叠加的预测二级结构。在此基础上，基于MOQI和NDUFA 4在同一CIV复合物中不存在的发现，我们提出NDUFA 4在我们所说的NDUFA 4到MOQI开关中被MOQI所取代。因此，莫奇是细胞色素C氧化酶第14亚基的变体。目前尚不清楚NDUFA 4是否在现有的CIV配合物中被MOQI所主动取代，或CIV-NDUFA 4被新合成的CIV-莫奇所取代。在编写这篇论文的时候，Kurihara和他的同事们报告了他们的发现，他们把莫奇命名为coxA4L3，在发育的精子细胞中表达，并将它整合到CIV中。39，提供了一个独立的确认莫奇是一个CIV蛋白。

从NDUFA 4到MOQI的转换下调了CIV的活性。单用MIR-147b介导的NDUFA 4下调也能降低cIV的活性，这与以前的研究结果一致。15。CIV抑制可降低人外周血单个核细胞中促炎细胞因子的产生。24我们推测，莫奇和miR-147b对CIV活性的衰减导致细胞因子的产生下降。CIV的活性如何控制细胞因子的产生是一个开放的研究领域。一种可能的机制，如莫奇的表达，是减少活性氧的产生，但似乎不是这样，因为miR-147b抑制细胞因子的产生而不降低ROS。CIV抑制可通过线粒体应激时激活的逆行信号通路间接调节细胞因子的产生。40。越来越多的人认为线粒体逆行信号是一种综合应激反应。41,42。一个有趣的可能性是，CIV活性的变化通过类似的机制被感知和传递到下游的效应者。

NDUFA 4到MOQI开关是如何导致CIV活性减弱的，因为MOCI的掺入和NDUFA 4的耗竭都不影响CIV的总水平。一种可能是基于观察到CIV在单体和二聚体之间的跃迁。43,44，它们分别组装了不同的COX 7同系物COX 7A2和COX 7A。45。与单体相比，civ二聚体的活性较低。46对ATP/ADP比值高的抑制作用敏感。CIV单体的二聚已被证明降低了CIV的活性，并被认为是为了减少Ros的产生。44。基于NDUFA 4存在于CIV单体之间的结构观察，Yang和他的同事们假设NDUFA 4抑制CIV的二聚，从而保持CIV的最大活性。17。MOCI掺入和NDUFA 4耗竭可能有利于CIV二聚，从而降低CIV活性和ROS生成。然而，我们的BN-PAGE分析并没有提供支持这一假设的证据，这可能是由于洗涤剂提取的非生理性质和需要更多的原位生理方法，例如，摩奇与含有NDUFA 4的CIV复合物的结构比较。

必须指出的是，莫奇与miR-147b相比，CIV的减少在质量上是不一样的。在莫奇的情况下，CIV活性的降低伴随着膜电位的降低和ROS的降低。MiR-147b的情况并非如此。这些结果表明，NDUFA 4的去除，无论是否由莫奇取代，在抑制CIV活性的下游都有不同的效果，例如IR的差异调节。如何降低膜电位和活性氧的产生是一个悬而未决的问题。一种可能是，Moci掺入改变了CIV的本征解偶联，也被称为“质子滑移”，这是ETC配合物I、III、IV和V的质子泵效率受到调节的降低，从而使H。+/e−比率降至1.0以下47,48,49。在所有Et配合物中，调节的质子滑移仅被认为在civ中具有生理相关性。50并被认为在高∆Ψ时给予呼吸控制。m防止过量的活性氧生成51。已观察到含有COX 6A-1/2的CIV的组织特异性异构体具有不同的H。+/e−这表明其他非酶亚基表现出特定的表达模式(如摩卡)可能有助于调节H。+/e−CIV在不同细胞环境中的比例52调节膜电位和活性氧生成。值得注意的是，NDUFA4L2是NDUFA 4的另一个类似物，在缺氧条件下也表现出可诱导的表达，并被认为抑制复合物I的活性，通过etc降低通量，从而减少ros的生成。53。缺氧激活促炎基因表达54。缺氧诱导NDUFA4L2的产生以及由此引起的活性氧生成减少，与我们观察到的莫奇相似，可能有助于抑制缺氧所致的炎症反应。在IL-1β攻击过程中，MOCI也可能以类似的方式发挥作用，通过解偶联诱导免疫抑制反应。

3‘UTRC15ORF 48含有保守的微RNA和平号-147 b，表明这是一种强有力的进化选择，可以使两个基因保持在相同的转录本上(图1)。2A)。成熟的miR-147 b-3p在单核细胞中被认为是一种抗炎的微RNA。55，与我们的研究结果一致，莫奇具有抗炎作用。此外，mir-147 b的最高预测目标是NDUFA 4，我们在这里进行了实验验证。一个简单的场景是，通过NDUFA 4到Moki开关的相互增强，Moki和miR-147b作为一对。然而，我们的数据表明，莫奇和miR-147b都具有收敛函数和发散函数。一方面，莫奇和miR-147b均降低CIV活性，降低MCP-1和IL-6的生成.另一方面，莫奇降低了膜电位，降低了活性氧的生成，而miR-147b单独通过增加RIP水平增强了IR途径。在这两个过程中，MOCI和miR-147b是相互拮抗的，即miR-147b是通过MOCi介导的ROS和膜电位的下降而产生的(图1)。6d-f)，而摩奇反对miR-147b增强钻机-I(图一)。9B)。其表型效应与表达ATGmut-mRNA的表型效应不同，WT-mRNA的表达具有中间效应。例如，MOCI抑制了IR反应，导致DENV/ZIKV感染后病毒复制增加，而WT-mRNA和ATGmut-mRNA则增强了IR，从而抑制病毒复制。总之，这些数据表明，摩奇和miR-147b虽然可能协同工作，以实现NDUFA 4到摩奇开关在CIV，但在功能上并不等同。虽然莫奇的干扰素抑制作用可能有助于限制免疫病理，但它也可能有利于病毒复制。这反过来又被miR-147b抵消，miR-147 b具有控制病毒复制的功能。在MOQI和miR-147b的存在下，WT-mRNA HAECs双重控制病毒复制，抑制促炎细胞因子的产生。

值得注意的是，我们的模型假设mocii和mir-147 b同时存在于同一个细胞中，C15ORF 48mRNA根据现有的模式，miR-147 b等外显子miRNAs的加工会导致mrna失稳，这是miR生物发生的必要步骤。56。从理论上讲，mRNA的翻译和预处理应该是相互排斥的.因此，内源性MOCi和miR-147b在同一细胞中不同时存在是可能的。相反，它们活跃在组织中的不同细胞亚群中，它们在这些细胞中发挥着不同的功能。例如，在人类PBMC中，C15ORF 48MRNA在单核细胞中的高水平表达(补充图)。2A)。体外THP-1模型的结果预测这些单核细胞表达较高水平的miR-147b(补充图)。5A-d)，与其免疫监测和病毒防御的主要功能相一致。另一方面，内皮细胞诱导C15ORF 48同时，由于对ROS产生的保护作用十分精细，导致内皮功能紊乱和血管进一步损伤，从而有效地翻译了该多肽。一个突出的问题是控制细胞型特异性翻译的机制和miR-147b的生物发生。总之，我们的研究强调了基因的编码和非编码功能如何被优雅地协调以获得特定的生物学结果。

最后，从mito-seps与炎症呈负相关的初步观察开始，我们在这里提出了我们的发现：C15ORF 48它编码的mito-SEP-摩奇-组装了一种CIV同工酶，通过微调ETC来抑制急性感染后的炎症。我们的结果表明，莫奇-miR-147 b轴或总体上调节CIV活性可能是一种可行的策略，可以改善病毒引起的炎症反应，这一可能性有待进一步研究。另外，因为我们的研究只讨论了C15ORF 48在急性炎症中，研究其改善慢性炎症的能力将是很有趣的，特别是在心血管疾病的背景下。最后，这项研究应该激发进一步的努力，为呼吸链的其他调控者挖掘mito-sep肽链，这些调节物能够协调普遍存在的氧化磷酸化的生物过程，以实现特定的、上下文依赖的细胞结果。