一种流行的、可培养的微生物群将生态平衡与人肺移植后的临床稳定性联系起来

有越来越多的证据表明，下气道微生物群会影响肺健康。然而，微生物群落组成与肺内动态平衡之间的联系尚不清楚。我们将扩增序列分析和细菌培养相结合，对64例肺移植受者234例支气管肺泡灌洗标本的活菌群落进行鉴定，并建立与病毒载量、宿主基因表达、肺功能和移植健康的联系。我们发现肺移植后的微生物区系可分为四种不同的组成状态，即“肺型”。主要的“平衡”型肺炎是一个多样化的细菌群落，病毒载量适中，宿主基因表达谱显示免疫耐受。其他三种肺炎类型的特点是微生物缺乏，或由潜在病原体主导，并与免疫活动增加，下呼吸道功能增加，感染和排斥的风险增加有关。总的来说，我们的发现建立了肺微生物生态系统、人体肺功能和移植后临床稳定性之间的联系。

最近的研究表明，健康人的下呼吸道存在多种细菌群落。1,2,3,4,5,6。这些群落与口腔和胃肠道微生物区系相同(拟杆菌, 费米尤特S，放线菌, 蛋白细菌)。然而，由于肺的物理化学、解剖和免疫学条件，它们的系统发育组成、总细菌负荷和时空动态是不同的，这使得该器官成为一个独特的微生物栖息地，具有特定的宿主-微生物相互作用。7,8.

几项独立的研究表明，声门上的分类群(即在人类口咽区发现的细菌)，如链球菌，和维氏菌是健康下呼吸道微生物的主要成分。这些细菌被认为有助于人类肺的免疫发育和动态平衡，因为它们的存在与出生后免疫成熟过程中的促炎症反应以及成年期的肺功能密切相关。4,9。微生物群落组成的变化，以及细菌多样性的下降10,11与各种呼吸系统疾病有关，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、特发性肺纤维化和哮喘。这些发现表明，下呼吸道微生物区系与人类肺的健康状态有关，因此可能在维持肺内动态平衡方面发挥重要作用。

下呼吸道微生物群的研究面临着巨大的挑战。首先，通过收集支气管镜下的支气管肺泡灌洗液(BALF)，对人体肺进行采样。12，这是一种侵入性的手术，它意味着很少在健康的人身上进行。因此，来自健康个体的大量数据集--包括关于人体肺微生物群动态的纵向研究--是稀缺的。其次，人体肺中相对较低的细菌生物量增加了将污染物描述为呼吸道微生物区系的风险。这可能会扭曲下呼吸道微生物区系的多样性测量，特别是仅依靠相对丰富度数据时。5。第三，虽然一些研究已经从肺样本中分离出活菌。6,13,14，一个可以作为公共资源的细菌收集还没有建立，对肺分离物的生理和生长特性知之甚少。因此，我们目前对不同肺微生物学成员的生态特性以及它们如何与肺生态系统中的环境条件(如免疫状态)的认识仍然有限。

研究肺移植过程中的微生物群，可以为呼吸道微生物与宿主之间的串扰提供重要的理论依据。15。肺移植受者进行移植后随访，收集BALF以监测移植器官的健康状况。这为肺微生物学组分的纵向研究提供了独特的机会，并允许建立与宿主免疫状态和临床元数据的联系。由于不同类型的临床并发症，如感染16急性细胞或体液排斥反应17和慢性同种异体肺功能障碍18，移植的肺也为研究呼吸微生物提供了机会。19,20,21,22在广泛的生态条件下。在这种背景下，更好地了解肺生态系统的动态可以最终帮助限制与移植后并发症相关的发病率和死亡率，并促进移植物存活。

最近对肺移植的研究提供了关于呼吸和传导气道微生物区系分布的见解。23，或机会性病原体对肺环境的适应。24。此外，越来越多的证据表明，移植肺的免疫状态与肺微生物学成分的变化有关。20,25。高丰度的机会性病原体，如属的成员葡萄球菌和假单胞菌与移植肺的促炎反应有关25,26，也存在于呼吸系统疾病中，如COPD和哮喘。27,28。这些细菌在移植后激活巨噬细胞并诱导强烈的炎症反应，表现为肿瘤坏死因子-α和环氧合酶-2的高水平表达。25。这与某些非致病性菌株形成鲜明对比。肺炎链球菌，其丰度与低炎症及组织修复和重塑有关。25。持续的炎症反应和不受控制的组织重塑最终会导致肺功能不可逆转的下降。29,30。这些先前的数据表明，移植后的肺微生物学可以构成不同的组成状态，可能与同种异体移植功能有关。然而，目前还缺乏对这些微生物群的定量分析，包括可存活社区成员的系统发育和生理特征，以及与肺生态环境和移植后临床结果的联系。

本研究对64例肺移植受者234例支气管肺泡灌洗液(BALF)纵向标本的气道微生物区系进行了分析。我们将独立培养和文化依赖分析结合起来，以确定移植后最常见的肺细菌，并建立一组原发性肺细菌分离物。我们将肺微生物区系中确定的成分变化与宿主基因表达谱、巨细胞病毒载量和患者元数据联系起来，以了解移植肺生态环境对临床结果的重要性。我们的研究结果表明，BALF样本可分为四种不同的组成状态(即肺型)，类似于人类肠道中所识别的肠型。31。这些肺型由其主要成员的不同群落特征和不同的生理特性来区别。我们发现肺炎型与巨细胞病毒载量、呼吸功能、局部和外周宿主免疫反应，包括与同种异体排斥反应有关。综上所述，我们的发现不仅说明了肺健康与局部微生物组成之间的紧密联系，而且还指出了潜在的群落特征和肺环境条件，并为今后的实验方法提供了大量的培养分离物资源。

联合培养依赖和文化独立的方法确定普遍和可行的细菌社区成员的人肺移植后。

为了表征移植后肺微生物学区系的细菌群落组成，我们对64例肺移植受者在49个月内采集的234份纵向BALF标本进行了16S rRNA基因扩增测序(图1)。1A，补充表1)。共鉴定了7164个操作分类单元(OTUS)，不包括在11个阴性对照样本中导致读取的OTUS。32(见“方法”，附图。1A，补充数据1和2)。根据以前对健康非移植个体BALF的研究4,5,6,26，我们发现拟杆菌和费米克特紧随其后蛋白细菌和放线菌是移植后肺中最丰富的门(图)。1B)。所有BALF样本的流行率分析表明，群落组成变化很大，只有22个OTUS由50%的≥共享(补充图)。1B，补充数据3)。然而，这22个OTUS占稀薄阅读总数的42%，表明他们是移植后肺微生物学的主要成员(图一)。1C，补充图。1C，补充表2，补充数据3)。它们属于属Prevotella 7, 链球菌, Veillonella，Neisseria，Allopretella，Pseudomomon，Gemella，Granulicatella，弯曲菌，Porphyromonas和Rothia，其中大部分也是健康人体肺部的主要社区成员。3,5,7,26表明健康的肺和移植的肺之间的肺微生物区系的总体组成有相当大的重叠。

样本间细菌负荷的差异，如果仅基于相对丰度分析，就会使群落分析产生偏差。因此，我们使用qPCR方法来确定16S rRNA基因的总拷贝数，作为细菌数量的估计，并对234份样品中每个OTU的丰度(绝对丰度)进行归一化处理。我们发现样本间的细菌数量相差很大，从10个不等。1和106每毫升BALF基因拷贝数(补充图。1D)。观察到的OTUS数目随着计数的减少而增加(图1)。1D)表明在细菌生物量较低的样本中检测到很大一部分OTUS，因此要么代表短暂的或极低数量的社区成员，要么代表测序的人工制品和污染物。反过来，在234个BALF样品中，7164个OTUS中有19个占总细菌生物量的75%以上(图1)。1E)。这包括22种最流行的OTUS中的11种(见上文)，加上仅在少数样本中检测到的8种OTUS，但丰度很高(葡萄球菌；奥图2，棒状杆菌1；奥图16和奥图24、厌氧菌；Otu_49和OTU_234、嗜血杆菌；奥图78、链球菌；奥图6768；Otu_63，补充表2)。重要的是区分这些机会殖民者与其他低发病率的社区成员，因为他们在一些样本中达到了非常高的细菌数量，对肺健康有潜在的影响。

为了证明流行的肺微生物群成员的生存能力，并为实验研究建立人肺细菌分离物的参考目录，我们用细菌培养方法补充了扩增序列(补充图)。2)。我们在15种半固态培养基(一般培养基和选择性培养基)上，结合3种氧气浓度(有氧，5%CO)，从18只个体中随机培养了21份BALF样本。2，和厌氧(见“方法”和补充表)3)，代表26个不同的条件。提取后(2h内)立即培养新鲜BALF，培养冷冻样品后观察到细菌多样性的丧失。结果总共有300个细菌分离物，代表5个门，7个类别，13个目，17个科，我们从这些细菌中建立了一个叫做鲁吴米生物群养殖科勒(LuMiCol，补充数据)4, Https://github.com/sudu87/Microbial-ecology-of-the-transplanted-human-lung).

为了研究lumicol中细菌之间的重叠程度和通过扩增测序得到的多样性，我们将215个菌株的16S rrRNA基因序列通过我们的质量过滤器进行了群落分析，从而可以检索otu-分离物匹配对。32(方法)我们发现213个分离物与47个OTUS相匹配。2A，c，补充数据5)，包括17种最流行和最丰富的细菌。1E，补充表2)。正如预期的那样，在基于扩增序列的群落分析中，高丰度的细菌被更频繁地分离出来，费米克特揭示了最高的隔离多样性(图一。2A-C，补充数据4, 5)并在最多样的培养条件下恢复。

总之，我们的联合培养依赖和文化无关方法的结果表明，移植后肺微生物区系在细菌负荷和群落组成上都有很大的变化，有许多暂时性和低丰度的细菌类群。然而，少数社区成员的流行率和/或丰度相对较高，这表明他们是人类肺的重要殖民者。

LuMiCol告知可培养的人肺细菌的多样性和代谢偏好

我们通过测试广泛的生长条件和表型特性(见“方法”)，对LuMiCol所含的下呼吸道可培养社区成员进行了描述。根据16S rRNA基因V1-V5区的基因分型，大多数培养分离物可以在物种水平上进行分类。然而，这种方法提供的有限的分类分辨率不允许区分密切相关的菌株，其中可以包括致病菌和非致病菌。因此链球菌，我们还测试了溶血类型(α，β，或γ)和对视颏的抗药性，这区分了致病性肺炎球菌和非致病性病毒群(图一)。2A，补充图。2B，c)。这表明16链球菌Otu-分离物对属于链球菌病毒群(Vs)。33。有趣的是，这些分离物在我们的收集过程中表现出最高的基因型和表型多样性，属于22个最流行的社区成员中的5个OTUS。微链球菌炎(OTU_11)在所有样品中占93.6%。

来自健康个体的Balf含有氨基酸、柠檬酸、尿酸、脂肪酸和抗氧化剂(如谷胱甘肽)，但没有检测到葡萄糖。34，这与细菌负荷增加和感染有关。35,36,37。为了深入了解细菌的基本代谢，我们评估了所有47个与OTU匹配的菌株在不同氧浓度下的生长情况。我们使用未定义的富培养基(托德-休伊特酵母抽提物)和定义的低复杂度液体培养基(Rpmi 1640)，包括一个无葡萄糖版本来模拟深肺环境(见“方法”)。尽管人类肺中存在氧气，但大多数分离物要么是专性厌氧菌，要么是兼性厌氧菌(图一)。2A)，包括一些最流行的成员(黑素原前杆菌(OTU_3)、链球菌炎(Otu 11)，异型退伍军人(Otu_6)和二角肉芽肿(Otuc 17)。在厌氧条件下，液体培养基也有类似的趋势，但属除外。Prevotella, 维氏菌和肉芽肿。大多数来自人类肺的链球菌在厌氧条件下在含有葡萄糖的复杂液体培养基中生长最好，包括我们队列中最常见的物种，米氏链球菌(图11)2B)。然而，值得注意的例外是前庭链球菌(Otuc 34)，口部(OTU 3427和OTU 1567)高丹氏菌(S.Gordonii)(OTU_10031)，在氧气存在和低复杂性液体介质中生长良好(见图)。2B)。最放线菌在含5%CO的富培养基上生长最好2，除.溶气放线菌(OTU 39)，需要厌氧条件。一些放线菌在厌氧条件下生长得同样好，就像在5%的CO存在下一样。2，即硬脑膜棒状杆菌(Otu 501)，放线菌SP.口腔分类群(OTU_328和OTU_228)。

我们肺群中最主要的两种机会病原体，铜绿假单胞菌(Otu_1)和金黄色葡萄球菌(Otu_2)，在富氧液体培养基中生长最好(图1)。2C)，虽然在厌氧条件下，它们也会增长到较低的程度。这些结果表明肺内物理化学条件的改变可能有利于这两种机会性病原体的生长。总之，我们从细菌培养收集的观察提供了对人类肺细菌表型特性的第一次洞察，并将作为今后实验工作的基础。

基于生态度量的机器学习识别移植后四种不同的肺型

为了检测和描述移植患者BALF样本中细菌群落组成的差异，我们使用一种基于配对Bray-Curtis不同相似性的无监督机器学习算法对样本进行聚类。32(β多样性，见“方法”，补充数据6)。这在门和OTU水平上将样本分成四部分围绕着MEdoid(PAMS)(如图所示)。3A，b，补充图。3A，b)。我们将这些集群称为“肺型”PAM 1、PAM 2、PAM 3和PAM 4(补充表)。4)。PAM 1是由大多数样本组成的最大的簇(n=115)紧随其后的是PAM 3(n=76)，PAM 2(n=19)和PAM4(n=24)(补充数据7)。各种多样性措施的检验(物种发生、OTU多样性、OTU丰富度，图)。3C-E)，占主导地位的社区成员的分布情况(图1.3F)，细菌计数(16S rRNA基因拷贝，图1)。第三代)四种肺型之间有明显的特征。

PAM 1在群落组成上表现出最高的相似性(物种发生/索伦森指数)。3C)，具有中等水平的多样性和细菌负荷(图一)。3D，e和g，补充图。3C)。在22个最普遍的社区成员中，20个与其他PAM相比，在PAM 1中的发生率和丰度更高(ART-ANOVA，FDR，丰度)。P < 0.01, Fig. 3H，补充表55例OTUS发生率>90%(发生率)；黑色素P.(Otu 3，97.4%)、米氏链球菌(S.mitis)(Otu 11，99.1%)五.非典型性(Otu 6，93.9%)、V.disar(Otu 30，93%)和G.二烯二烯(OTU 17，93%)。相比之下，两个OTUS(铜绿假单胞菌；OTU_1和荧光P.OTU 15在PAM 1中的发病率和丰度均不高(图1)。3H，补充表5)。因此，PAM 1样本具有相对高相似性的平衡细菌群落，由我们的数据集中最流行的细菌组成。从此以后，我们把这个PAM称为“平衡气态”(气动型)。平衡).

与气动型相比平衡，PAM 2和PAM 4的细菌多样性较低。三维空间)和OTU丰富度(图1.3E)，由单一的社区成员控制(见图)。3F)，并有较高的细菌载量(图1)。第三代)。在这两个PAM中，与肺型相关的分类群。平衡与其他PAMS相比，样品发病率和绝对丰度较低(补充图)。4A，b). 金黄色葡萄球菌(Otu 2)，棒状杆菌(Otu 24))和厌氧菌(Otu_49)富含PAM 2(ART-ANOVA，FDR)，P < 0.001, Supplementary Fig. 4A)，同时嗜血杆菌(Otu 78)和铜绿假单胞菌(Otu_1和OTU_15)主导PAM4(ART-ANOVA，FDR)，P < 0.001, Supplementary Fig. 4B)。我们称之为“气动型”葡萄球菌“(PAM 2)和”气动型“假单胞菌‘(PAM 4)，在多种病理呼吸系统条件下，已知的主要病原体是在肺内迅速增殖的潜在病原体。38,39，与在我们的环境中观察到的高负荷相一致(如图所示)。第三代).

第四个聚类PAM 3在物种组成上表现出最低的样本相似性(图一)。3C)，OTU多样性和丰富度最高(图1.3D，e)，以及最低的优势度(图1.3F)。在此PAM样品的特点是非常低的细菌负荷，高达两个数量级以下的样品在其他PAMS(图)。第三代，补充图。3C)，暗示一种与肠道微生物区系的异常生理状态相关的极度退化的微生物群。40。因此，在PAM 3样品中检测到较高的OTU丰富度很可能是由于稀有或暂时性物种的过度测序或测序人工制品造成的。与其他PAM相比，PAM 3中的30个优势菌群成员的发生率和丰度显著降低(ART-ANOVA，FDR)，这也支持了这一事实。，P < 0.001, Fig. 3I)。我们将此PAM称为“微生物耗尽”型(肺炎型)。MD).

在选择性培养基上对BALF和支气管抽吸物(BA)进行定性培养，进一步证实了四种肺型的真实存在(图一)。3J，补充图。5)。气动型Balf样品平衡口咽菌群的比例最高，而口咽微生物区系中主要由多种细菌组成(例如，链球菌或维氏菌)。同样，对肺型BALF标本的培养结果进行了分析。葡萄球菌气动型假单胞菌最常被认为是金黄色葡萄球菌/棒状杆菌SPP.和铜绿假单胞菌，而对于肺型BALF样本，则分别获得。MD通常是文化阴性(图一)。3J，补充图。5A)。对BA也有类似的观察(图)。3J，补充图。5B)，但是，与BALF相比，口咽菌群的阳性培养率更高，尤其是肺炎型。MD。这表明，尽管已知空气中微生物群落的地形连续性，但两种样本类型之间的微生物区系仍存在差异。1,3,7。这一点得到了以下事实的支持：对于气动型葡萄球菌气动型假单胞菌，移植前和移植后的定植之间没有关联。金黄色葡萄球菌 (χ2=0.047，P=0.82)和铜绿假单胞菌 (χ2=0.2，p=0.65)(附图5C，d)分别在上呼吸道。

许多气动型OTUSMD不能在我们的细菌培养方法中进行培养(补充表)3, 5，补充图。5)，再加上相应样本的低细菌丰度，质疑它们作为肺微生物学成员的相关性/存在性。相反，其他三种肺炎类型的主要社区成员大多以LuMiCol的分离物为代表，其中包括两种机会性病原体，铜绿假单胞菌(Otu_1)和金黄色葡萄球菌(Otu_2)，为今后研究这些肺型的优势种提供了实验依据。总之，我们在移植肺中鉴定了四种不同的细菌群落，我们称之为肺炎型，并通过BALF样本的培养对它们进行了验证。

细菌肺炎型与不同的宿主基因表达模式有关。

具有独特群落组成的细菌肺炎型的存在表明，移植后人肺的微环境条件存在差异，这可能在肺生态系统的其他成分中得到反映。我们比较了这四个肺型的七个功能类别的31个宿主基因的中位表达水平。这些基因涉及炎症、免疫调节、组织重塑以及细菌和病毒的检测(见“方法”，图1)。4A)，它们在四种肺型中的表达模式不同，在肺型中具有特别高的转录活性。葡萄球菌(无花果)4A)。为了鉴别四种肺炎类型和细菌数量不同的样本，我们在234份BALF标本中应用了一种基于宿主基因表达的机器学习方法(随机森林，见“方法”)。气动型平衡预测准确率最高(92%)，其次为气动型假单胞菌(83.4%)和气动型MD(81.4%)，而气动型没有达到准确性葡萄球菌(补充表)5)。我们发现31个基因中有6个具有特别高的预测能力。IFNLR 1, MRC 1, IL 10, IL1RN, LY 96, 伊藤(重要性评分>10分；99%置信区间，图1。4B). IFNLR 1编码干扰素λ受体1，它参与抗病毒防御和上皮屏障的完整性。41。该基因在肺炎型标本中表达上调。平衡与其他三种肺型相比(图1)。4C). MRC 1(甘露糖受体C-1型)42和LY 96(淋巴细胞抗原96)43微生物多糖和脂多糖识别蛋白编码43分别。与气动型样品比较平衡，这两个基因在肺型中被上调。葡萄球菌气动型MD，在有气动型的样本中被下调。假单胞菌(无花果)4D，e)。气动型样品平衡另外，与其他三种肺型相关的基因的表达与其他三种肺型有更大的区别，这些基因涉及免疫调节和外周免疫耐受。伊-10/白细胞介素10和IDO 1/吲哚胺2，3-双加氧酶1，图1。4F，补充图。6)，以及较低的表达式IL1RN(白细胞介素1受体拮抗剂，图1。4G)，作为炎症反应的一部分，以控制白细胞介素-1β(IL-1β)的潜在有害效应。44.

同样，我们发现了五个具有高分辨力的基因。4I细菌计数的重要性评分>10)，其中两个是特别好的预测因素：PDGFD和IFNLR 1. PDGFD编码血小板衍生生长因子的D亚型，促进间充质细胞如成纤维细胞的增殖。45。该基因的表达呈负相关(图一)。4J、AIC 62.4，p < 0.001) with bacterial abundance. In contrast, IFNLR 1表达与细菌丰度呈正相关(图一)。4K、AIC 35.7，p < 0.05). Accordingly, PDGFD高表达IFNLR 1肺型低表达MD(无花果)4C，h)与其他肺型相比，提示下呼吸道细菌的正常存在与组织重塑的稳态水平、上皮屏障完整性和宿主对病毒的反应有关。综上所述，这些结果表明宿主特异性基因表达标记与不同的细菌状态相一致，突显出不同肺生态系统特征之间存在复杂关联。

Anellovirus动态与肺内细菌群落和宿主生理有关。

观察到的肺型与抗病毒防御之间的联系促使我们研究肺细菌、病毒和宿主之间的三方相互作用。为此，我们量化了人类发现的三种水痘病毒的载量。Alphatorquevirus, Betatorquevirus，和伽马克病毒)在234份BALF样本中。根据先前的研究46，我们发现移植的肺含有大量的巨细胞病毒，伽马克病毒占主导地位。三个属的病毒载量在移植后1.5-6个月达到高峰，并在随后的时间点下降(图1)。5A)。Anellovirus载量在不同的肺型之间有很大差异(图1)。5B-d)。所有三个病毒属在肺炎型样本中最低。MD和Alphatorquevirus在有肺炎型的样本中含量特别高假单胞菌(无花果)5B)。个体内部的成对分析显示，从气动型纵向过渡到纵向过渡的负荷有了特别大的下降。平衡气动型MD并相应地增加了逆(图1)。5E，补充图。7)。我们进一步鉴定了四种人类基因：TLR 3, IGF 1, RSAD 2, IFITM 2，作为BALF中Anellovirus载量的重要预测因子(图1)。5F，见“方法”)。其中，Toll样受体3(TLR 3)与病毒总载量呈正相关(图一)。5G、AIC 73.9p < 0.001). This is consistent with the low viral load observed with PneumotypeMD，TLR 3被下调的地方(如图所示)。5H)。这些发现将肺微生物学组分的变化与病毒载量和宿主基因表达的变化联系起来，表明可能对同种异体移植的结果有影响。

肺炎型与移植后临床并发症的风险有关。

大量临床数据(补充数据)7)使我们能够将细菌群落组成、宿主基因表达和Anellovirus载量的差异与异体移植和患者健康状况联系起来。免疫抑制以及预防性和治疗性抗生素的使用被认为是主要的混杂因素。然而，我们发现不同的肺炎类型与主要的免疫抑制剂(ANOVA、泼尼松)之间没有关联；P=7.68×10−1、他克莫司；P=9.1×10−1)在我们的队列中使用，在BALF取样时使用(补充图。8a，b)。与移植后血浆的报道形成对比47我们也没有观察到病毒载量与免疫抑制药物水平之间的相关性(LM，泼尼松)；P=8.0×10−1、他克莫司；P=9.1×10−1，补充图。8C，d，见“方法”)。然而，我们观察到在BALF取样时使用抗生素的数量与肺炎型标本的比例呈负相关关系。平衡，与肺炎型的比例呈正相关。MD样本(费舍尔试验，P=2.0×10−3、图1.6A)。因此，这些观察表明，密集的抗生素使用与最平衡和最稳定的肺微生物群的紊乱之间存在联系。

我们观察到感染的临床诊断在有肺炎型的情况下是罕见的。平衡气动型MD，与气动型相比葡萄球菌气动型假单胞菌(二项式线性模型，是或否，P < 0.001 and P分别=0.016；图1。6B)。这证实了我们的16 SrRNA基因分析的结果。葡萄球菌气动型假单胞菌被机会主义的病原体所控制，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别。这也与中性粒细胞数量减少的发现是一致的(图一)。6C)，但不包括巨噬细胞(如图所示)。6d)，气动型平衡气动型MD与气动型相比葡萄球菌在较小程度上，气动型假单胞菌强调肺型与局部条件有关，在促炎细胞的吸收方面各不相同。

肺移植受者面临异基因反应的风险，特别是在临床感染的促进下。我们的研究没有统计能力来分析肺型和不同类型排斥之间的联系，但受到数据集中每个排斥类别样本数量的限制。因此，我们将来自17例患者的29例标本进行分组，无论是包层、急性细胞排斥反应分级≥2，还是存在供体特异性抗体(平均荧光强度>1000)，因为这些都表明宿主免疫能力控制不佳，从而增加了同种异体移植损伤的概率(图1)。6E，见“方法”的临床定义)。这些样本大多与肺炎型有关。葡萄球菌(41.7%)和肺炎型MD(26.2%)，其次是气动型假单胞菌(15.4%)和气动型平衡(13.1%)，表明后一种微生物区系特征与较低的临床并发症风险有关。外周血中循环B淋巴细胞的计数进一步证实了这一点，表明在有肺炎型的情况下，体液免疫更加活跃。葡萄球菌、气动型假单胞菌气动型MD，与气动型相比平衡(图基测试，P=2.7×10−2, P=2.6×10−1和P=1.2×10−1分别；图1。6f)。除了细菌组成外，巨细胞病毒还通过较低的负载与包层连接。伽马克病毒(Wilcoxon检验，P=7.0×10−3、图1.6g)，虽然没有观察到与Alphatorquevirus或Betatorquevirus(Wilcoxon检验，P=1.5×10−1和P=9.0×10−2分别，图1。6g).

最后，我们用“用力呼气量在1s”(FEV 1)的测量来寻找肺生态学与肺功能测试之间的联系。这种评估不考虑包层的诊断，这要求FEV 1不可逆地下降到基线值的80%以下，而事先不包括其他混淆诊断(见“方法”)。气动型葡萄球菌气动型假单胞菌总体上与FEV 1值降低有关，并且经常大幅下降，低于80%的预测值(Dunn‘s检验，P=3.0×10−2、图1.六小时)，而气动型平衡，以及气动型MD，与保存的肺功能有关。

气动型平衡在移植肺中表现出最高的时间稳定性和恢复力。

我们利用纵向取样的优势，探讨了移植后肺型的动态变化。我们分析了每次移植多达8个BALF样本中肺型之间的转换，并在连续5个时间窗内收集(见图)。7A)。肺型在不同时间窗间的分布无显着性差异(χ2测试，P=6.0×10−1)。虽然大多数BALF样本都与肺型有关平衡，两种不同的微生物肺炎类型之间的转变发生在所有连续样品对中的大约一半(补充图)。9)。过渡动力学由马尔可夫链性质解释，即给定样本的气态仅取决于链中先前样本的状态(χ2测试，P=3.3×10−1、图1.7b)。这些转变是不可再生的、非周期性的和反复发生的，没有一种肺炎类型表现为吸收状态(见“方法”)。气动型平衡其稳定性最高，重现概率最高(63%)，符合马尔可夫概率，其次是气动型。MD(42%)7b)。此外，向气动型转变的很大一部分平衡在头四次期间，窗口显示了这一概况的相当大的复原能力。因此，气动型之间的转换葡萄球菌、气动型假单胞菌气动型平衡主要发生在后一剖面的方向(如图所示)。7b)，而与模型预测相比，气动型葡萄球菌气动型假单胞菌似乎几乎断开了连接。

最后，我们通过一个案例研究来说明肺炎类型的时间动力学与临床结果之间的关系。7C)。35名被诊断为肺纤维化的患者接受了两次移植，提供了12份系列样本，并提供了四种肺型中的每一种(图一。7C)。气动型破裂平衡发生于25个月，随后转为气动型葡萄球菌30月份的时候。这伴随着一种积极的文化棒状杆菌SPP.符合我们的丰富分析和临床培养试验(补充图。4、图1.3J)，增加BAL中性粒细胞减少，同时增加宿主免疫基因的表达(图中的热图)。7C)。此后，病人反复接触抗生素，呼吸功能开始不可逆转地下降，导致49个月诊断为肺炎型。MD。肺部细菌和巨细胞病毒载量总体下降，表明微生物的选择压力很大，这很可能是由于抗生素治疗和宿主免疫能力控制不佳所致。第二次移植是在第50个月进行的，这与肺型的重建有关。平衡与保存的肺功能、肺细菌和巨细胞病毒的中间载量、中性粒细胞计数的减少和宿主免疫基因表达的变化相一致。然而，向气动型的过渡假单胞菌直到取样结束时观察到，细菌数量增加，但肺功能没有下降。7C)。综上所述，这些观察突出了将肺炎型与临床和分子数据整合的潜力，其主要目标是跟踪肺炎型的破坏。平衡有利于临床稳定性。

在目前的研究中，我们利用了来自64名肺移植患者的234份纵向BALF样本。我们结合了依赖于文化和独立的方法来描述人类肺微生物的组成，获得有代表性的培养分离物并测试它们的生长需求，评估这些群落在肺中的时间动态，并最终建立与宿主健康状况的联系。总之，我们的结果表明，移植后的肺微生物区系是高度动态的，在不同的生理条件下，有少数占主导地位的社区成员，其中许多可以被培养。我们发现肺移植后的微生物区系根据其独特的细菌群落特征，可分为四种组成状态，即“肺型”。这些肺型具有不同的时间动态，并能在肺细菌、巨细胞病毒载量、宿主基因表达以及移植受者的生理和免疫状态之间架起桥梁。总之，这些结果为我们了解肺细菌群落、其临床意义和主要肺细菌的可治疗性提供了重要的进展。

我们的分析表明，人肺移植后的微生物区系主要由口咽类群组成，与健康肺的微生物类群相似。5,6,26。因此，这些结果不仅与肺移植相关，而且对下呼吸道微生物生态学的研究也有一定的指导意义。除了在分类成分上有很大的差异外，我们发现肺内的总细菌生物量在样品之间也会有很大的差异。在以前的研究中也发现了肺微生物组成的这种数量差异。我们发现，在所有样品中，OTUS占细菌总生物量的很大一部分(19 OTUS占生物量的75%以上)，尽管检测到超过7000 OTUS。这些不仅包括流行的口咽分类群，还包括在少数样本中生长出来的潜在病原体。这些发现，以及气动型的一个关键特征MD它是否与低细菌生物量有关，强调考虑绝对细菌计数的重要性，而不是仅仅依靠微生物群研究中的比例数据。40,48。通过宿主基因的表达可以预测细菌的生物量，这进一步证明了这一点。

除了考虑细菌的总生物量外，展示细菌的生存能力还为测序检测到的细菌的生物学相关性提供了进一步的证据。以前的研究表明，人肺中的细菌可以在氧化条件下培养，大多数细菌都是在氧化条件下生长的。6,13,14。我们的大规模细菌培养方法，包括广泛的培养条件，大大扩大了从人类肺分离出的细菌的可用性，并提供了关于其系统发育多样性、生理偏好和代谢潜力的新见解。例如，我们发现许多分离物，包括流行的社区成员，更喜欢在厌氧或5%CO的存在下生长。2条件，提示肺深部存在低氧浓度区域。此外，培养使我们能够更详细地描述特定的分离物，并识别与之密切相关的病原和非致病性物种。链球菌，否则就不能单凭扩增序列而受到歧视。值得注意的是链球菌在所有分离物中具有最高的遗传、代谢和表型多样性，这可能解释了它在整个人类呼吸道中的存在，包括具有非常不同的理化性质的位点。3。我们承认，目前的文化收集并不是详尽无遗的。我们认为，这是由于肺微生物学的高度变异性，以及我们培养了相对较少的BALF样本，而不是一些社区成员在测试条件下无法在体外生长，或者他们在肺中没有生存能力。

观察到BALF样品在群落组成和细菌负荷上的差异，说明人体肺微生物区系变化很大。然而，我们的无监督机器学习方法确定了四种不同的组成状态，即气动型。平衡、气动型MD、气动型葡萄球菌气动型假单胞菌。在先前对健康人肺微生物区系的研究中，采用了类似的方法，从而确定了两种肺型。5。值得注意的是，其中一种先前确定的肺型在声门上的分类群中富集，即主要是。链球菌，和维氏菌类似气动型平衡从我们的书房里。西格尔等人描述的另一种肺炎型。具有与气动型相似的特征MD也就是说，细菌数量很低，分类成分变化很大。风型MD在我们的研究中，其他肺型的许多分类群被认为代表污染(或所谓的背景分类群)。相反，气动型葡萄球菌气动型假单胞菌在先前的研究中没有检测到，可能是因为它是基于一个较小的队列大小，并且只包括来自健康个体的样本。葡萄球菌，是肺炎型的主要社区成员。葡萄球菌，是健康的人类鼻粘膜的常客，能够在宿主身上进化并转化为传染性鼻粘膜。49。它也被证明在新生儿下气道中占主导地位，这表明它对人类肺的早期适应能力是有潜力的。4。这些研究共同为人类肺微生物在不同环境中的存在提供了独立的证据。此外，这四种肺炎类型与宿主基因表达、细菌和巨细胞病毒载量以及同种异体移植功能和健康状况的差异密切相关，表明下呼吸道存在不同的生态条件，下文将对此作进一步讨论。

我们建议气动型平衡主要与肺内动态平衡有关(图一)。7D)，因为它具有多样性的细菌群落，具有中等的细菌和病毒载量，并且与倾向于免疫调节和外周免疫耐受的人类基因表达谱有关。气动型的一个特殊特征平衡与高表达的干扰素-λ受体1(IFNLR 1)，说明细菌群落与维持上皮屏障完整性之间的联系。41和抗病毒防御50。此外，气动型平衡与白细胞介素-1受体拮抗剂(IL1RN)，产生于促炎细胞因子。44，以及对白细胞介素-10的调控(伊-10)，一种耐受性细胞因子51。这与先前报道的Th17免疫应答有关。9指示气动型的可能作用。平衡调节性T细胞的发展和免疫监视的维持，如肠道细菌的情况52,53。与此相一致的是，有肺炎型的个体平衡取样时临床并发症发生率最低。此外，从气动型过渡平衡在其他肺型中，观察到的频率最少。总的来说，这些观察证实了与这种肺型相关的稳定状态，表明移植后肺健康和临床稳定。

气动型MDMrc 1基因表达增加，这是M2型巨噬细胞的特征。42，以及血小板衍生生长因子-D基因45，是气道重塑的重要贡献者。低的微生物负荷和相关的稳定炎症水平的丧失可能是这些基因表达增加的根本原因，从而导致宿主细胞无限制的增殖和细胞外基质的沉积，正如在包层中所观察到的那样。54。这种肺炎的另一个显著特点是低表达TLR 3，一种宿主基因，参与病毒检测，这与在肺内观察到的这种肺炎型病毒的低载量是一致的。几乎所有的肺移植受者都携带巨细胞病毒，主要在血浆中，但也存在于肺中，病毒载量随时间而波动。46,47。以往的报道表明，血浆中的巨细胞病毒计数与宿主免疫能力、感染和同种免疫排斥反应有关。47,55,56,57,58,59表明气动型MD是宿主免疫系统对肺部病毒和细菌施加更强选择性压力的指标。感染的低风险和免疫活动控制不良的巨大风险证实了这一点，主要表现在循环B淋巴细胞和供体特异性抗体、急性细胞排斥反应或包被。

对于任何一种类型的样品，我们都观察到了强烈的对比模式。葡萄球菌或气动型假单胞菌都与炎症背景紧密相连。在这里，病毒和细菌的载量相对于肺炎型的样本有所增加。平衡气动型MD。这是伴随着较高的感染风险和中性粒细胞的持续征集进入肺，最终导致肺功能受损(图一)。7D)。尤其是气动型假单胞菌与淋巴细胞抗原的低表达有关(Ly)96髓样分化蛋白(MD2)是人TLR 4复合物的重要组成部分43。虽然人们很容易联想到铜绿假单胞菌在这种肺炎型中缺乏TLR 4通路在宿主中的参与60,61，我们不能得出因果关系的结论。与感染激活同种免疫反应的证据一致62，具有任一种气动类型的样本葡萄球菌或气动型假单胞菌也与免疫活动控制不良和排斥反应的风险显著相关。

我们的研究缺乏足够的统计能力来探讨肺炎型与不同类型的排斥(急性细胞排斥，抗体介导的排斥反应，包层)之间的联系。然而，将这些样本分组后，我们就可以将气动类型联系起来。平衡免疫活动控制不良的风险最低。此外，我们不能将因果关系归因于观察到的肺生态系统不同成分之间的联系。这是由于我们的方法的非介入性质和混杂因素的多重性及其在队列中的可变性。特别是，除了感染和异基因免疫反应的影响外，潜在的治疗方法还有望显著调节肺生态。这可以通过观察到的气动型之间的联系来说明。平衡在没有进行抗生素治疗的情况下采集的样本，而不是肺炎型与细菌群落破坏和正在进行的抗生素治疗之间的关联。最后，我们需要进行后续研究，以扩展我们的单点bal采样所获得的知识，这将不会捕捉到肺不同区域生态条件的潜在变异性。63或者在肺和上呼吸道之间7,64.

总之，我们的工作为理解细菌群落-病毒-宿主生理学轴需要一个平衡的肺生态系统以维持呼吸功能和健康提供了基础。总之，我们建议这四种肺型似乎遵循“安娜卡列尼娜原则”，健康的社区在稳定的状态下变化不大，而受干扰的社区在不稳定状态下的变化要大得多。65。我们建议，利用生态学原理分析多组学数据的整合，将有助于肺移植受者的管理和随访，特别是在复合预测和支持性干预方面。一个重要的下一步将是建立因果关系之间的肺生态学和异体移植健康，通过确定微生物和宿主相关的因素背后的肺炎型转变。为此目的，我们的细菌收集LuMiCol提供了一个非常宝贵的资源，将作为基础，为今后的实验研究使用动物或细胞培养模式。