德国波恩一项基于人群的研究中SARS-CoV-2中和抗体的血清学和相关性研究

为了估计SARS-CoV-2中和抗体的血清学和时间进程，我们在德国波恩正在进行的一项基于社区的队列研究中嵌入了一项多层血清学调查。我们首先用免疫分析法测定抗SARS-CoV-2免疫球蛋白G的水平，然后用重组尖峰免疫荧光法和斑块减少中和试验(PRNT)验证边界试验和阳性试验结果。4~5个月后，对边缘或阳性免疫测定结果的患者进行复检。基线时，有4771人参加(88%的答复率)。4月24日TH和6月30日TH2 0 0 0年，免疫法检测血清阳性率为0.97%(95%CI：0.72−1.30)，仅考虑2项阳性验证试验，血清阳性率为0.36%(95%CI：0.2 1−0.6 1)。重要的是，大约20%的PRNT+个体在5个月内失去了中和抗体。在这里，我们发现只有三分之一的免疫检测结果呈阳性的人可以检测到中和抗体，并且下降的相对较快。

截至1月20日TH2021年，严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2)已在全球范围内感染超过9600万人，导致200多万人死于冠状病毒病2019(新冠肺炎)。1,2。即使在最近研制出高效的疫苗后，对一般人群中sars-cov-2血清型的准确估计仍然是遏制这一仍在肆虐的大流行病的关键，因为生产、交付和部署方面的后勤挑战以及对疫苗接种的先入之见预计会严重拖延及时和广泛的接种。3,4,5。此外，目前对新出现的sars-cov-2株疫苗的效力仍有很多未知之处。6。Sars-cov-2中和抗体的血清学、相关性和时间动态是检测人群免疫的关键，但在血清流行病学研究中尚未见报道。7,8,9。人口研究是了解无症状和轻度症状病例的流行以及后天免疫反应的效力和可持续性的唯一途径，从公共卫生的角度来看，这两者都是至关重要的，因为这些人往往逃避传统的基于症状的感染链追踪，但在进一步传播和维持当前的全球暴发中发挥着关键作用。10。此外，血清学研究为追踪大流行的演变提供了重要的基准，方法是在人口水平上进行发病率估计。11.

许多基于人群的sars-cov-2血清监测研究已经在全球范围内进行，估计的血清学分布差异很大。12,13,14,15,16,17,18,19,20。这些估计中有许多可能是有偏见的。17由于抽样方法不足，抗体检测效果差，非随机抽样(如自我转诊)，非代表性抽样设置(如献血者和医院工作人员)，以及样本数量小。17。特别是，在使用标准化的血清学检测方法的同时，迫切需要基于涵盖同一地理区域和时间框架的多重抽样方法来比较血清学估计值，因为这些研究能够更好地估计使用方便抽样方法所产生的偏差的程度，这些方法目前是世界大多数地区血清价估计的主要来源。21。在德国，虽然仍在进行一些血清学研究，但只有少数几个血清学研究的结果已经发表。其中只有三项是基于人口的研究。22,23,24，而其余的评估则针对产业工人、保健提供者、母亲、学生/教师或献血者。18。与其他(欧洲)国家相比，德国与新冠肺炎相关的发病率和死亡率相对较低。25,26然而，鉴于sars-cov-2感染的轻度或无症状感染所占的未知比例，人口的真实暴露状态可能要高得多。15.

血清学检测的特异性不足是准确评估SARS-CoV-2血清学反应的一个重要挑战，尤其是在感染率相对较低的地区。广泛使用的(护理点)横向流动和定量的ELISAs导致与其他地方病冠状病毒交叉反应而产生相当多的假阳性。27。目前sars-cov-2血清学的金标准是中和试验。27。能中和病毒的抗体的存在对持续感染具有高度的特异性，也被认为是病毒获得性免疫的主要组成部分。28。然而，中和试验是非常辛苦的，只能在专门的(即生物安全等级-3)实验室进行，而且迄今为止几乎没有在血清中使用过。因此，目前对于SARS-CoV-2中和抗体的决定因素、相关关系和时间演变在群体水平上知之甚少.

我们的目的是(1)使用包括高特异性中和试验在内的多层血清学检测策略，准确估计SARS-CoV-2在感染率相对较低的地区的血清阳性率；(2)研究SARS-CoV-2中和抗体的相关性和时间动态，重点研究感染但无症状或轻度/中度症状者的特点。通过将一项大规模的血清流行病学研究嵌入到一项正在进行的未来社区队列研究的现有框架中，我们打算防止自我转诊偏见，确保参与者的长期随访(包括未来的血清转换)，并促进对基因、健康和生活方式决定因素的调查，这些决定因素影响对sars-cov-2感染的易感性和复原力。在本报告中，我们提出了第一次血清学调查的结果，包括所有对SARS-CoV-2中和抗体应答者的随访。

血清价估计

表中显示了第一组的队列特征和血清学调查结果。1还有无花果。1。参加者共有3983个不同家庭，包括778个2户及5个有3名参加者的家庭。酶联免疫吸附试验(ELISA)阳性的46人中，16人有中和抗体，而36人中只有1人的ELISA结果处于临界范围(图1)。1).

仅以ELISA结果为基础的流行率估计为0.97%(95%可信区间(CI)：0.72-1.30)。当仅将这些参与者视为在所有三项测试中均呈阳性的病例(包括一名具有边界ELISA检测结果但在重组免疫荧光试验和菌斑减少中和试验(PRNT)均为阳性的个体)时，见图1。1)，该方法优先考虑特异性，从而提供血清阳性率下限的估计值，其患病率估计为0.36%(95%CI：0.21-0.61)。因此，I组的真实血清阳性率估计在0.36%至0.97%之间。

血清效价估计值与年龄无关(95%CI：0.98~1.02)，与年龄无关(95%CI：0.94~1.03)，也与性别无关(男女OR=0.94~1.66，95%CI：0.54~1.66)和0.56(95%CI：0.23-1.40)。

中和抗体存在的相关因素

17人中和抗体来自15个不同的家庭，其中两个家庭各有两个病例，两个家庭有一个参与者和一个没有中和抗体的家庭。只有一人患有严重的新冠肺炎，需要住院治疗和重症监护治疗。其他16人没有需要住院治疗，因此被认为是无症状或轻度到中度感染：所有这些人都报告自2020年1月1日以来至少有一种症状(附图)。1)，中和抗体的几率增加12%(OR 1.12，95%CI：1.04-1.21)。除了与确诊或怀疑患有SARS的人一起生活-CoV-2感染和有过症状的人数外，其他因素-包括教育程度、体重指数、共病、饮酒、吸烟和接种季节性流感、肺炎球菌或肺结核疫苗-与中和抗体的存在无关(图一)。2A)；而味觉或嗅觉减退、上个月发烧、寒战或潮热、呼吸时疼痛、手臂或腿部疼痛以及肌肉疼痛和虚弱都与中和抗体的存在(OR值为3.44至9.97之间)显著相关。p < 0.018; Fig. 2B)。共患病的总数和特定共病的存在都与中和抗体的存在无关(见图)。2A和补充图。2).

ELISA阳性个体中和抗体存在的相关因素

在46例ELISA阳性个体中，中和抗体组的抗体应答率显著高于无中和抗体组(年龄调节组和性别调节组，IgG比值分别为2.62，95%CI：1.81~3.43)。3A)。此外，只有在有中和抗体的人群中，ELISA+/PRNT+亚组的IgG应答随年龄增加而显著增加(95%CI：0.0 5~0.12)，而在ELISA+/PRNT−亚组中则呈逐年上升趋势(95%CI：0.0 5~0.10)；3B).

30名ELISA+/prnt−患者中没有一人报告与先前确认的sars-cov-2感染的成员住在一起，而3名ELISA+/prnt+个人表示与先前确认的sars-cov-2感染的人住在一起(费舍尔的准确测试)。P=0.05)。年龄(OR 0.98，95%CI：0.94~1.02)和性别(男性对女性OR 0.47，95%CI：0.14-1.6)均无差异。有中和抗体的人报告有更多的症状(OR 1.19，95%CI：1.02-1.38)，而其他因素--包括教育、体重指数、共病、饮酒、吸烟和接种季节性流感、肺炎球菌或肺结核疫苗--在两组之间没有区别(图一)。4A)。发热(上个月)和耳痛仅在两人和四人的中和抗体中报道(Fisher‘s精确检验)P-发热和耳痛的数值分别为0.14和0.02)。中和抗体阳性率随食欲下降、肌肉无力、发冷或潮热以及味觉下降而显著增加(图一)。4B).

第二类的血清学估计数

这一组的样本特征和测试结果的总结载于补充表。1。两组血清阳性率分别为1.94%(95%CI：0.84~4.42)和1.39%(95%CI：0.49~3.85)。因此，I组的真实血清阳性率估计在1.39%~1.94%之间。与Ⅰ组比较，Ⅱ组ELISA阳性率高出2倍，但OR值无统计学意义(OR 2.03，95%CI：0.82~4.99)。与I组相比，II组中和抗体的发生几率高出4倍(OR 3.88，95%CI：1.20-12.55)。第一组和第二组在年龄、性别和同居人数方面没有差别(全部)。P≥0.07)。然而，与第一组相比，第二组个体报告症状的可能性略低(OR 0.97，95%CI：0.95~1.00)。然而，重要的是，经调整后，第二组有确认感染sars-cov-2的家庭成员的比例显著高于第一组(1.67%比0.36%)。P=0.007)。此外，与第一组相比，第二组中有更高比例的人曾被检测出sars-cov-2感染呈阳性(经调整后分别为1.11%和0.23%)。P=0.016)。

用双抗体夹心ELISA法对个体进行短期随访

来自第一组和第二组的所有个体，在基线时都有一个接近标准的ELISA结果，他们被邀请在第一次采血后的大约8周内进行一次回访。在被邀请的39人中，有30人在中位数为28天(20-41天)后返回进行随访测试。在随访时，其中7人的IgG比率超过1.1；然而，在后续访问中，这些参与者中的任何一个都无法检测到中和抗体，甚至在基线访问中证实存在中和抗体的个人也不能检测到中和抗体(补充图1)。3).

对处于边缘或ELISA阳性的个体进行长期随访。

在2020年9月，我们再次邀请了来自第一组和第二组的92人，他们的IgG水平处于基线水平的边缘或阳性范围(即≥0.8)。在这些人中，有83人进行了随访(反应率为≈90%)，其中包括所有22名先前证实存在中和抗体的人。抽血后，中位数为120天，从基线访问(范围89-144天)。

平均而言，中和抗体的水平在随访期间下降(PRNT增加的OR值)。50每日滴度=0.99，95%CI：0.98~0.99)，在基线时PRNT+的22人中，有4人无法检测到中和抗体(图1)。5A)。IgG抗体的反应是相对温和的，在所有的四个人，谁的中和抗体无法检测到长期随访(图一)。6)。随访期间IgG反应较高，与中和抗体阴性的概率(天内OR)×IgG比值相互作用=0.96，95%CI：0.94~0.98呈负相关。P << 0.001). Similarly, higher titers of neutralizing antibodies at baseline were associated with a lower probability of becoming neutralizing antibody negative after follow-up (OR for time (in days) × PRNT50滴度相互作用=0.18，95%CI：0.18-0.19，P << 0.001). There was also a group of four individuals, with PRNT50两次访问均在>1：80范围内的滴度，其中中和抗体的滴度在随访期间显著增加，作为较高prnt的证据。90在随访时，与基线访问相比较(图一)。5B和补充表2)。随访期间中和抗体反应的大小与共患病的存在和数量呈正相关，与体重指数(BMI)呈负相关(补充图)。4).

我们介绍了迄今为止德国最大的一项基于SARS-CoV-2血清流行病学研究的发现。我们在4月24日进行了一项研究。TH和6月30日TH波恩，德国西部的一个中等大城市，当时新冠肺炎的负担相对较低。25,26，发现SARS-CoV-2血清阳性率较低.此外，我们还发现：(1)在被广泛应用的定量免疫检测阳性的个体中，只有1/3的人血清中和抗体水平可检测到：(2)抗体反应的大小(如IgG比率所反映的)、所经历的症状总数以及特定症状的存在都与免疫检测阳性结果中存在中和抗体有关；(3)在有边缘免疫分析结果的人群中，中和抗体的存在是非常罕见的，在唯一确诊病例中，中和抗体滴度下降较快，在几个月内下降到检测极限以下的比例很大(约20%)，中和抗体丢失的概率与IgG反应的大小成反比关系，(5)自我推荐偏差可能导致血清价的大幅高估。

截至6月30日TH在人口约33万的波恩，总共有759例确认的sars-cov-2感染(包括3例与新冠肺炎有关的死亡)，其流行率为0.23%。29。我们的血清效价估计值是原来的1.6倍-4.2倍(分别基于所有三项测试的确认或仅为阳性的ELISA结果)。研究样本不包括30岁以下的人，因此并不代表整个波恩人口。然而，我们的研究结果显示，相当多的被感染的人没有被当地的卫生监管机构发现，很可能是因为亚临床感染或轻微症状的发展。我们的研究结果还证实，当地居民接触sars-cov-2的机会有限，很可能是当时与新冠肺炎相关的住院率和死亡率相对较低的原因，从而支持了德国早期实施社会隔离和限制措施的有效性。25,26。我们的血清学估计值低于在第一波大流行期间进行的其他三个以德国社区为基础的血清学估计值。22,23,24。然而，这些先前的血清学检查是在超级传播事件发生后在社区进行的，不太可能反映德国其他地区相对较低的新冠肺炎负担情况。22,23,24.

在被广泛使用的免疫分析方法中，只有三分之一的参与者检测到了中和抗体。至少有两种解释可以解释这一发现。首先，在免疫分析中检测出阳性，但在确认试验中没有阳性的人，可能是假阳性，例如，由于与其他冠状病毒抗体的交叉反应。根据我们所用的ELISA的特异性为99.6%，假设为零，我们预计会出现19例假阳性。27。第二，这个群体也可能包括那些感染了SARS-CoV-2的人，但是他们要么没有发展中和抗体，要么在感染后失去了抗体。事实上，在报告过去感染过SARS-CoV-2的15人中，有6人无法检测到中和抗体。此外，我们发现约20%的血清阳性个体在随访5个月内中和抗体滴度低于检测值。尽管最近的另一项研究发现了一种更持久的中和抗体反应，但该研究使用了微整化试验，而且队列中包括了大量根据疑似新冠肺炎进行筛查的人群，因此他们很可能患有更严重的疾病，而不是以群体为基础的不带偏见的样本。30。相反，我们的发现进一步延伸了最近的其他报告，表明中和抗体可能不会在无症状或只有轻微症状的个体中出现，特别是在这个群体中，在感染后的时期内可能会相对较快地消退。28。虽然中和抗体被认为是适应性免疫的主要组成部分，它们的水平也与sars-cov-2特异性T细胞的数量密切相关。31，中和抗体水平的下降并不一定意味着缺乏持续的免疫记忆。32。事实上，在轻微新冠肺炎后的恢复期血浆中也发现了sars-cov-2特异性T细胞识别来自病毒尖峰、核蛋白和基质成分的多肽，并有可能产生更持久的免疫。33。同样，尽管在症状发生后三周后抗体水平下降，但最近的一项研究发现，25例恢复期新冠肺炎患者血液样本中长寿命记忆B细胞的数量持续上升，直到大约5个月。34。虽然关于免疫应答的哪些成分能提供最初感染和再感染的保护，还有很多有待了解，但最近从sars-cov-2疫苗试验中获得的证据支持这样的观点，即中和抗体的存在和数量可以被视为保护性免疫反应的有效标志。35,36,37。因此，这一可能性不能排除，即使在感染后，很大比例的个人，特别是那些无症状或轻度感染，可能会再次成为敏感的SARS-CoV-2感染。

在免疫测定结果阳性的人中，IgG反应的幅度、以前经历过的症状的数目以及先前出现的特定症状--包括食欲减退、肌肉无力、发冷或潮热以及味觉减退--与中和抗体的可能性密切相关。此外，中和抗体的滴度也与IgG反应的大小，以及一些临床特征如共病数和BMI密切相关。因此，这些发现表明，可以根据临床特征和基于免疫分析的抗体水平建立预测模型，以估计中和抗体应答的概率和程度。中和抗体的检测目前是非常劳动密集的，只有在专门的实验室才能可靠地进行。良好的预测模型可能有助于更好地估计没有这种先进检测设施的地区的实际人口免疫水平。

自我推荐或志愿者偏见可能会夸大血清学的估计值。38。为了估计这种影响的严重程度，我们还对同一地区的一组自发志愿者进行了抽样，他们不是最初的莱茵兰研究队列的一部分，但对血清学研究表示了兴趣。在这些人的正式邀请下，应答率几乎比参与者的原始队列低30%，而血清效价估计值则高出2至4倍(分别基于中和抗体的存在或ELISA阳性结果)。自我选择的主要原因似乎不是症状的存在，而是先前确认的SARS-CoV-2感染或与以前的SARS-CoV-2感染密切接触。因此，这些发现说明了选择-对血清价估计的偏见-的深刻影响-这很可能是许多先前血清学研究结果的巨大异质性的主要来源-从而强调了基于队列的分析的极端重要性，这些分析能够准确量化应答率和(非)应答的原因。

我们的研究既有长处，也有局限性。通过在一项正在进行的基于社区的前瞻性队列研究中实施这项血清学调查，我们能够迅速接触和动员一大群参与者，并获得很高的响应率，从而将选择偏差的风险降到最低。事实上，据我们所知，我们的血清学调查是唯一一项关于SARS-CoV-2血清学的研究，其中特别讨论了自我选择偏差的严重程度。通过对来自同一预定地理区域的第一组(自我选择的低风险)和第二组(自我选择的高风险)参与者的血清学阳性率的差异，我们的研究可以用来说明和警告自我推荐/自我选择偏见在膨胀血清价估计中的实质性影响。我们还介绍了针对群体水平中和抗体反应的相关和时间演变的极少数后续研究之一。我们研究的局限性包括，它仅限于成人≥30年，而且我们没有评估sars-cov-2特异性T细胞和记忆B细胞反应，即后天免疫的其他关键成分。39,40。然而，考虑到低(中和抗体)血清价，这一地区的人群血清阳性率极不可能在当时与我们的估计有很大的不同。

总之，在免疫分析阳性的人群中，只有三分之一的人能检测到抗SARS-CoV-2的中和抗体，而且在几个月内下降相对较快。这些发现不仅表明该地区几乎整个人口当时都易受SARS-CoV-2感染的影响，而且表明如果不接种SARS-CoV-2疫苗，很难实现持续的人群对SARS-CoV-2的免疫，因此需要继续保持警惕，并采取措施遏制卫生当局进一步蔓延。

学习人口

这项血清学调查是以莱茵兰研究为基础的，这是一项正在德国波恩进行的基于社区的队列研究。所有30岁以上的30岁以上的居民都被邀请参加莱茵兰的研究。唯一的排除标准是德语不足以提供知情同意。居住在招募区的人主要是白种人后裔的德国人。莱茵兰德研究的首要目的是研究年龄相关疾病(神经退行性疾病)的病因和预测，并评估正常和病理(脑)结构和功能在成人生活过程中的作用。41。这项研究始于2016年，强调深度表型。由于实施了当地的禁闭措施，定期考察于3月18日暂停。TH, 2020.

这份血清学调查分两组进行。第一组包括所有在3月18日前参加莱茵兰研究的活着的参与者。TH, 2020 (N=5427)。因此，他们参与这项研究与对待SARS-CoV-2的态度或经验无关.第二组由符合条件但尚未参加莱茵兰研究的个人组成。他们主动与我们联系，表示愿意参加血清学调查。N我们允许那些同意成为莱茵兰研究的潜在参与者。因此，参与这一群体的动机是受到考验的前景。

进行莱茵兰研究的批准是从波恩大学医学院道德委员会获得的(参考资料编号：338/15)。莱茵兰研究是根据国际协调会议(协调会议)良好临床做法标准(ICH-GCP)的建议进行的，并根据“赫尔辛基宣言”获得所有与会者的书面知情同意。这份血清学调查无需单独的伦理批准，因为它嵌入在莱茵兰的研究中，该研究的伦理任务已经涵盖了后续测量，包括收集系列生物样本。

学习设计与程序

第一组的所有参与者都通过电子邮件、信件和/或电话被告知血清学调查，而正如上文所述，第二组的个人积极与我们联系。所有受邀者都被要求使用一个专门设计的在线平台，在当地的两个学习中心之一预约，除非他们患有急性感染的症状(特别是发烧、咳嗽或其他类似流感的投诉)，在这种情况下，他们被推荐去看医生。从4月24日开始TH至6月30日TH第一组的受邀参与者中有4771人(88%)和第二组的360人(60%)访问了一个研究中心进行采血。无反应的原因包括死亡，无法发出的邀请，以及由于被认为是由于老年、不活动或共同发病导致的高负担或感染风险而被拒绝。

数据收集

数据收集包括采血和问卷调查。在研究中心，血液从前肘静脉或手背静脉采集。取血后30~90 min，血清管离心15 min，2000×g，直接保存在+2到+8°C之后，并在收集后1周内通过夜间信使送到诊断实验室。采血后，参与者收到一份书面问卷，要求他们在家里完成并返回研究中心。

血清学测量

SARS-CoV-2抗体的血清学分析是在国家冠状病毒顾问实验室(德国柏林Charité-Universit tsmedizin，Charité-Universit tsmedizin)用三层方法进行的。首先，用商业ELISA法测定抗SARS-CoV-2的IgG抗体水平(德国吕贝克，EUROIMMUN)。根据生产厂家的产品说明书，在确定血清阳性反应时，采用>1.1的截尾，估计敏感性为94.4%(感染>10天)，特异性为99.6%。我们的独立室内验证实验使用119名血浆供者在轻度至中度新冠肺炎恢复期后的血清样本(由阳性的拭子核酸测试证明)，以及110名健康受试者(无典型症状或无危险接触史，或咽拭子sars-cov-2核酸测试阴性)，与制造商的报告值一致，灵敏度为86.8%，特异性为100%。42。重要的是，我们再次邀请所有在基线≥水平为0.8的人在3-6周内对IgG水平进行重复随访，以避免错过最近感染后有初生体液免疫反应的个体。我们对所有ELISA检测结果呈阳性(即>1.1)或边缘(即0.8~1.1)的个体进行了两次额外的验证试验。验证性试验包括室内重组免疫荧光试验和PRNT试验，目的是如我们最近所述，专门检查是否存在抗sars-cov-2的中和抗体。43,44。用血清浓度测定中和抗体滴度，使斑块数量减少50%或90%(定义为PRNT)。50或PRNT90(分别为<1：20(即无法检测)、1：20、1：40、1：80或>1：80。特别是在预期血清学阳性率较低的地区，尽量减少假阳性的数量是至关重要的。因此，我们测试了我们的三层测试方法的特异性，使用了来自同一个队列(即第一组)的100个随机选择的预流行样本，这些样本是在2016年至2018年3月至9月期间收集的，与在大流行期间在我们的血清学调查中采集样本的时间大致一致。所有100份样本在商业ELISA、室内重组钉基免疫荧光试验和prnt检测均为阴性，证实了我们的三层检测方法(补充表)具有极高的特异性。