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免疫电镜技术&核酸探针技术

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发表时间:2019-08-07 15:29作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

免疫电镜技术&核酸探针技术


免疫电镜技术

系将免疫学技术与电镜技术相结合,发展建立起来的一项新型血清学性质的检测法,即以铁蛋白标记抗体后,用其检测被检标本,使它渗入细胞内,结合于存在有抗原的部位,经锇酸固定后,包埋切片,用电镜检查。因铁蛋白分子在电镜下呈现明显可见的黑色颗粒,故能精确地显示出抗原所在的部位,使得它的应用达到了亚细胞检测水平。另外,也有报告,用酶标抗体处理被检标本,做免疫电镜检查,但在电镜下发生反差,不及铁蛋白标记抗体清晰。

除上述两种方法外,还可应用胶体金标记抗体球蛋白检测抗原,在电镜下作观察。胶体金(colloidal gold)技术又称胶体金探针(colloidal gold probes),是一种以1~100nm的微小金粒子分散在另一种溶液中所形成的体系即金溶液,以此金溶液去标记抗体球蛋白,用其检查被检标本,由于它渗入细胞内,与相应抗原结合后,即可在电镜下观察,该技术于1971年首先由Faulk和Taylor用于沙门氏菌表面抗原的定位测定。为提高胶体金技术的敏感性,Holgate于1983年又将该技术与银显影法结合,建立了免疫金银染色法(immunogoldsliver staining,IGSS),其原理是标本用金标记蛋白染色后,再用银显影液处理,即用对苯二酚将银离子催化还原成银原子,银原子围绕在金颗粒周围形成一个银壳,使得胶体金颗粒在光镜下就能观察到,且可见度得到提高。


核酸探针技术

核酸探针(又称基因探针,gene-probe)技术,是20世纪晚期在生物学领域中发展起来的一项新技术,除可用于病毒、细菌等微生物的快速诊断外,还可用于研究病毒基因在组织细胞中的存在,研究基因是以游离的形式还是以整合的方式与宿主细胞DNA结合,研究基因在细胞或组织中的定位等。

(一) 基本原理 Waston-Crick发现的DNA双螺旋模型已为大家所熟知。因为双股DNA是一种非常稳定的物质,于0.3mol/L NaOH 中暴露于60℃下,也不被破坏,在近100℃加热时,氢键虽可破坏,使DNA变成单股,但变性后的单股DNA还可结合在特定的载体如硝酸纤维素膜上,而标记的核酸(DNA或RNA)探针仍能与结合在膜上的单股DNA通过碱基互补配对原则形成氢键,又恢复成双股,此时,或通过放射自显影来观察X光片中的特定核酸片段的踪迹,或通过非放射性物质标记后,观察产生的特异颜色,以确定特定核酸片段的踪迹。使单股重新聚合成双股的过程称为退火或复性,不同来源DNA分子之间的退火,则形成杂交。应用这种杂交技术可用以检测和鉴定任何病毒或细菌的DNA分子等,核酸分子杂交可在DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA之间进行。根据杂交程度,可判断两个核酸分子之间核苷酸顺序同源性的多少。

(二) 核酸探针检验的特点 双股RNA比双股DNA更稳定,杂交后,经严格冲洗,可洗去非特异结合的探针,还可用RNA酶来降解未杂交的RNA,小的RNA分子比大的DNA分子更易扩散进入薄膜,在原位杂交中获得更大的信号与本底比率(signal to noise ratio),由此可见,用核酸探针检测具有很大的优点。

对于不易分离培养的微生物标本,及大量培养增殖后有“危险性”的病毒标本,均可用核酸探针直接检测。另外,对病毒子或病毒抗原太少的标本,不易用常规方法,包括电镜和血清学方法检测的标本,也可用核酸探针检测。本法还可用于对变异株病毒等的鉴定。

(三) 核酸探针的发展前景 近年来,随着人们对基因精细结构的深入细致的研究和DNA合成技术的发展,已经能够人工合成寡聚核苷酸片段作为探针来使用。这样由于DNA探针来源比较丰富,所以,可提高探针浓度来缩短杂交时间。Rubin等用Whatman 541滤纸代替硝酸纤维素膜进行菌落杂交试验,使操作过程方便简单,并且可取消预杂交。非放射性标记物——生物素,正日益引起人们极大的兴趣,是今后的发展方向。


文章分类: 试剂盒技术资料
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