IL-6在GBM肿瘤免疫抑制中的作用 我们研究了IL-6在GBM肿瘤免疫抑制中的作用，最初采用遗传方法(图1)。 1A )。认为肿瘤相关内皮细胞(Ecs)是gbm中IL-6表达的主要来源。 21 我们利用他莫昔芬诱导的EC基因敲除系统精确调控肿瘤微环境中IL-6的表达.GBM诱导 Ntv-a ;Ink4a-Arf −/− PTEN Fl/fl LSL- LUC供体小鼠通过RCAS(复制型禽肉瘤-白血病病毒长端重复剪接受体)介导的基因转移，然后原位植入肿瘤细胞 Cdh5-CRE ERT 2 IL6 Fl/fl IL-6的表达受EC特异性启动子Cdh 5的调控.肿瘤来源单细胞悬液的流式细胞术分析表明，IL-6的基因消融术增加了细胞毒性CD8的数量。 + GBM中的T细胞(图1. 1B，c )。此外，CD3也有类似的增长趋势。 + 和CD4 + T细胞也是如此，而自然杀伤(NK)细胞的数量则保持不变。值得注意的是，IL-6基因敲除减少了总髓系细胞和M-ϕs的数量，提示T细胞募集或激活的增加可能是由于免疫抑制性M-ϕs向肿瘤的浸润减少所致。流式细胞仪对肿瘤细胞的分析表明，IL-6基因敲除增强了CD3的浸润。 + T细胞进入肿瘤(图1)。 1D )CD8的增加部分 + CD 45中的T细胞 + CD3 + T细胞(图1. 1E 和补充图。 1 )，与CD 45减少有关 + CD11b + 髓系细胞与CD 45 + CD11b + F4/80 + Mϕs(图1. 1F )。肿瘤相关Mϕs分泌大量抗炎、免疫抑制细胞因子，如IL-10和TGF-β，抑制T细胞浸润和活化。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示，IL-6消融能显著降低GBM肿瘤组织中IL-10和TGF-β的表达，但对正常脑组织的表达无明显影响(图1)。 1g，h )。这些发现共同提示了IL-6在gbm免疫抑制中所起的关键作用，支持了我们先前的工作，表明ecs中的IL-6基因敲除可以抑制gbm的生长，并提高荷瘤小鼠的存活率。 21 。此外，这些结果提示IL-6阻断可能是激活T细胞抗肿瘤免疫的一种策略.
图1：IL-6基因消融逆转GBM免疫抑制. RCAS介导的基因工程诱导GBM的研究 Ntv-a ;Ink4a-Arf −/− PTEN Fl/fl LSL-Luc 供体小鼠，然后植入原位肿瘤 Cdh5-CRE ERT 2 IL6 Fl/fl 受体小鼠用IL-6-ΔEC预处理或不加他莫昔芬(对照组)处理.肿瘤植入后2周切除肿瘤。 a 示意图法 b , c 用细胞因子法分析肿瘤细胞来源的单细胞悬液。 b 有代表性的细胞分类。 c 定量结果(均值±扫描电镜) n =4只小鼠)。双尾学生的统计分析 t -测试。 d –f 流式细胞术分析肿瘤细胞来源的单细胞悬液。 d CD3分析 + T细胞左，有代表性的单元格分类。对，量化结果( n =6只小鼠，平均±SEM)。双尾学生的统计分析 t -测试。 e , f 分析 e CD4 + /CD8 + T细胞或 f 髓系细胞( n =6只小鼠，平均±SEM)。双尾学生的统计分析 t -测试。 g , h 对正常脑组织和肿瘤组织进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。 g 伊-10和 h 转化生长因子-β表达(平均±扫描电镜) n =4只小鼠为IL-6-ΔEC ggm组和 n =其他各组小鼠3只)。用SIDAK‘s检验进行双向方差分析。源数据作为源数据文件提供。
IL-6中和能提高动物的存活率，但不会使GBM对免疫检查点的阻断敏感。 摘要由于肿瘤中T细胞浸润较少，gbm对免疫检查点阻滞不敏感，这在临床上仍然是一个重大挑战。 4 。考虑到IL-6对肿瘤T细胞浸润和活化的负性作用，我们接下来在遗传小鼠GBM模型中测试IL-6中和抗体的治疗潜力，特别是联合免疫检查点抑制剂(ICIS、抗PD-1和抗CTLA-4抗体)。 2A )。生存分析显示抗IL-6治疗中度但显著( P < 0.05) improved the survival by over 30% (+8 days, comparable to 22 days of median survival in control mice, Fig. 2B )。此外，抗IL-6治疗可以抑制肿瘤的生长。 2C )。根据我们的结果，通过基因IL-6消融(图)。 1 )，流式细胞仪分析显示IL-6中和增强了CD 45的浸润。 + CD3 + T细胞进入肿瘤(图1)。 二维空间 )和减少CD 45的征聘 + CD11b + 髓系细胞与CD 45 + CD11b + F4/80 + Mϕs(图1. 2E 和补充图。 2 )，但不影响CD 45的人口。 + CD11b + Ly6G 高 Ly6C INT 中性粒细胞和CD 45 + CD11b − CD3 − NK1.1 + NK细胞(附图) 2 )。然而，IL-6中和作用适度地提高了CD8的比值。 + T细胞在肿瘤相关CD 45中的表达 + CD3 + T细胞(图1. 2F )，但没有激活这些T细胞，这一点在Ki 67中没有检测到增加。 + 、干扰素-γ + ，或CD 69 + 激活CD 45中的T细胞 + CD3 + T细胞(图1. 2G )。相反，单用ICIS治疗并不能显著延长动物的存活时间(如图所示)。 2B )或抑制肿瘤生长。 2C )，与在人类临床研究中观察到的类似结果一致。 22 ,23 。ICI单药不刺激CD3 + 渗透(图1. 二维空间 )或抑制肿瘤中髓样细胞的数量(如图所示)。 2E )；它并没有增强CD8的无线电功能。 + /CD3 + T细胞或影响Ki 67、干扰素-γ(IFN-γ)及CD 69在CD3中的表达 + T细胞(图1. 2F，g )，提示ICIS不能诱导GBM中T细胞活化。值得注意的是，与单一药物治疗相比，ICIS和抗IL-6抗体联合治疗并没有协同延长生存率或降低肿瘤生长。 2B，c )。根据这些发现，联合治疗未能协同促进肿瘤相关T细胞的细胞浸润或激活(图一)。 2D-g )。综上所述，我们的数据表明，IL-6中和增强了T细胞向GBM肿瘤的浸润，提高了动物的存活率；然而，由于免疫抑制的逆转不足和肿瘤微环境中T细胞的浸润/激活有限，IL-6对免疫检查点阻断不敏感。
图2：IL-6中和增强了T细胞对GBM肿瘤的浸润，提高了动物的存活率，但不使肿瘤对免疫检查点阻滞敏感。 在WT B6小鼠体内诱导GBM，然后注射对照IgG、抗IL-6抗体(Ab)、免疫检查点抑制剂(ICIS)或ICIS+抗IL-6抗体。 a 示意图法 b , c 生存和肿瘤生长分析( n =8-12只小鼠 n 数字如图所示)。 b 监测小鼠生存60d，进行双侧对数秩Mantel&Cox分析。中位生存期。 c 第13~23天用生物发光显像分析肿瘤体积(平均±SEM)。用Dunnett检验进行双向方差分析。 d –g 治疗后2天切除肿瘤。肿瘤来源的单细胞悬液用抗CD 45抗体染色， d CD3， e CD11b， f CD4，CD8，CD3，和 g Ki 67，IFN-γ，CD 69，流式细胞仪分析。 d CD3分析 + T细胞左，有代表性的单元格分类。对，量化结果( n =6只小鼠，平均±SEM)。用Fisher‘s LSD检验进行单因素方差分析。 e –g 免疫细胞量化结果( n =6只小鼠，平均±SEM)。用Fisher‘s LSD检验进行单因素方差分析。源数据作为源数据文件提供。
IL-6诱导Mϕ介导的免疫抑制但刺激CD 40的表达 为了探讨IL-6调节Mϕ介导免疫抑制的机制，我们从转录水平研究了IL-6对小鼠骨髓Mϕs基因表达的影响。IL-4作为对照，在诱导M2极化和M-ϕ免疫抑制方面具有良好的作用。主成分分析显示，IL-4或IL-6引起的分化或谱系变化有不同的变化(图6)。 3A )。此外，IL-4和IL-6处理的Mϕs与对照未处理的Mϕs相比，表现出明显的表达谱，如火山图和热图分析所示。 3B，c )。免疫抑制细胞因子的特异性分析表明，IL-6主要诱导IL-10、TGF-β2和精氨酸酶-1/2的表达，而IL-4则显著增加精氨酸酶-1的表达，但不增加IL-10的表达。 三维空间 )。流式细胞仪检测IL-6诱导的IL-10表达。 3E )。有趣的是，IL-4和IL-6以不同的方式诱导M2 Mϕ相关标记的表达：IL-4似乎选择性和明显地诱导CD 206( 姆尔克1 )表达，而IL-6更广泛地刺激CD 206、CD 86、Toll样受体2( TLR 2 )、凝血因子XIII( F13a1 )，以及serpin家族b2( Serpinb 2 )(图1. 三维空间 )。流式细胞仪分析证实IL-4和IL-6均能增强Mϕs中CD 206的表达。 3F )。这些结果共同提示IL-4和IL-6在诱导MϕM2极化和免疫抑制中具有积极作用，提示IL-6对Mϕ产生免疫抑制表型有明显的促进作用。
图3：IL-6诱导Mϕ介导的免疫抑制，但刺激CD 40的表达. a –e 分离小鼠骨髓Mϕs，用50 ng/ml IL-4和IL-6处理2天，然后进行rna-seq分析。 n =3只老鼠)。基因被定位 a 主成分和 b 火山图分析。 c 分泌基因热图。 d 免疫抑制细胞因子(TOP)和M2 Mϕ激活相关基因的表达。左边，热图。对，控制的折叠表达方式。 e , f 用IL-4和IL-6处理骨髓源性小鼠Mϕs 2d，用流式细胞仪进行分析。 e IL-10表达左，有代表性的分类。对，定量结果( n =3只小鼠，平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。 f CD 206表达( n =3只小鼠，平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。 g Mϕ激活相关受体基因的表达。左边，热图。对，定量结果( n =3只小鼠，平均±SEM)。用Dunnett检验进行双向方差分析。 h 用IL-4和IL-6处理骨髓源性小鼠Mϕs，用流式细胞仪进行分析.左，有代表性的分类。对，定量结果( n =3只小鼠，平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。 i 在对照组WT或IL-6-ΔEC小鼠中诱导GBM.肿瘤植入后2周，用流式细胞仪(平均±扫描电镜)分析肿瘤来源的单细胞悬液。 n =3只小鼠为对照组 n =4只小鼠(IL-6-ΔEC组)。双尾学生的统计分析 t -测试。 j 建立小鼠GBM模型。用IL-6 Ab和ICIS或对照抗体治疗2天后，用流式细胞仪(FCM)对肿瘤进行分析。 n =5只小鼠，平均±SEM)。双尾学生的统计分析 t -测试。源数据作为源数据文件提供。
多种机制介导Mϕ活化及其对T细胞的共同刺激促进抗肿瘤免疫，主要通过肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族介导。 Tnfrsf1a/b )和CD 40 24 ,25 。与我们所发现的IL-6诱导MϕM2极化和免疫抑制的结果不同，我们的rna序列分析结果意外地显示IL-6刺激CD 40的表达，而不是肿瘤坏死因子R1α/β(如图所示)。 第三代 )。此外，IL-6，而不是IL-4，在mRNA和蛋白水平上都能持续诱导CD 40的表达(如图所示)。 3G，h )。流式细胞仪分析表明，IL-6对肿瘤源性M-ϕs的CD 40表达有明显的促进作用(附图)。 3 )。这些发现提示IL-6在促肿瘤免疫和抗肿瘤免疫中具有双重作用，分别通过免疫抑制细胞因子和Mϕ激活信号CD 40的表达介导。此外，流式细胞仪对肿瘤来源的单细胞进行了分析，发现遗传的IL-6消融抑制了肿瘤Mϕs中CD 40的表达，而CD 40的降低则说明了这一点。 + F4/80 + 细胞群体但在CD 40中不存在 − F4/80 + 细胞种群(图1. 3I 提示IL-6在GBM微环境中对CD 40的Mϕ表达具有正调控作用。同样，在抗IL-6抗体和ICIS治疗的肿瘤中，CD 40的Mϕ表达也明显降低(如图所示)。 3J )，这可能是由于CD 40表达下调导致Mϕ激活不足所致。
IL-6通过STAT 3和HIF-1α诱导CD 40表达 考虑到IL-6诱导M型ϕ极化的机制已经得到了很好的界定。 21 ,26 ,27 我们主要研究IL-6调控CD 40表达的分子机制。对前20种转录因子的计算生物信息学分析表明，IL-6单独诱导低氧诱导因子(HIF)-1α、Ets 2、NK-κB2、STAT 3和Bcl 3的表达均达到一个较强的水平(rna-seq法测定，每千伏酶(FPKM)>1.0，与对照组和IL-4处理的小鼠Mϕs(Fig)相比，差异无显着性(P>0.05)。 4A )。我们最初的研究重点是参与IL-6信号调节的hif-1α、nk-κb和stat 3。 28 ,29 ,30 ,31 。小干扰RNA(SiRNA)介导的STAT 3基因敲除，而非NK-κB2基因的敲除，使IL-6诱导的人Mϕ的CD 40表达明显减少(图一)。 4B )。此外，染色质免疫共沉淀(芯片)分析显示STAT 2与CD 40启动子，特别是在转录起始点下游的−821至−577之间，以IL-6诱导的方式相互作用(如图6所示)。 4C，d )，表明STAT 3在IL-6诱导的CD 40转录中起着关键作用。
图4：IL-6通过STAT 3和HIF-1α诱导CD 40表达. a 取小鼠骨髓来源的Mϕ，用50 ng/ml的IL-4和IL-6处理2天，然后进行rna-seq分析。 n =3只老鼠)。所示为IL-6诱导的转录因子。左边，热图。对，控制的折叠表达方式。 b 用靶向NF-κB2、STAT 3或对照序列的siRNA转染人单核细胞，用IL-6或对照培养基处理。细胞裂解物免疫印迹。本实验分别重复两次，结果相似。 c –e 人单核细胞经IL-6或对照培养基处理后， d 常氧或 e 缺氧。核蛋白免疫沉淀 d 反STAT 3或 e 抗HIF-1α抗体，用不同引物进行芯片分析. c 结果来自实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)。 n =3例人体标本，即±SEM)。用图基检验进行双向方差分析。 f 人单核细胞在常氧或缺氧条件下用IL-6或对照培养基处理，然后进行免疫印迹分析。本实验分别重复两次，结果相似。 g 用靶向HIF-1α或对照序列的siRNA预处理人单核细胞，缺氧条件下用IL-6或对照组处理。细胞裂解物免疫印迹。本实验分别重复两次，结果相似。源数据作为源数据文件提供。
考虑到HIF-1α是细胞对缺氧反应的主要调节因子，在IL-6诱导转录因子的顶端被发现(如图1所示)。 4A 我们研究了缺氧条件下HIF-1α在IL-6诱导的CD 40表达中的作用.我们的数据表明，缺氧条件下，HIF-1α与TSS下游−402至−161启动子区的CD 40启动子结合，IL-6显著增强了这一结合(如图4 0 1所示)。 4C，e )。此外，免疫印迹分析表明，低氧刺激IL-6诱导的CD 40表达。 4F )。SiRNA介导的HIF-1α基因敲除阻断IL-6诱导的CD 40表达(如图所示)。 4F，g )。我们的数据显示IL-6通过STAT 3和HIF-1α诱导CD 40的表达.
IL-6中和和CD 40刺激使GBM对免疫检查点阻滞的敏感性 给予IL-6在免疫抑制细胞因子介导的肿瘤前效应免疫和CD 40介导的抗肿瘤免疫中的双重作用。 3 )，我们下一步尝试联合CD 40激动剂的实验治疗，以最大限度地提高抗IL-6治疗中的肿瘤免疫能力。在野生型(WT)小鼠中进行基因诱导，然后单独或联合应用IL-6中和抗体、CD 40激动剂抗体和ICI治疗。 5A )。我们的数据显示，仅刺激CD 40并不影响肿瘤的生长。 5B )或动物生存(见图。 5C )。在一项平行的研究中，联合应用CD 40激动剂和检查点抑制剂也不能延长动物的存活时间(补充图)。 4 )。然而，将IL-6中和和CD 40刺激相结合的双重治疗能显著提高GBM对ICI治疗的敏感性，如CD 40抗体、IL-6抗体和ICIS三联疗法(如图1所示)。 5B )和提高小鼠的存活率，几乎翻了一倍中位生存期(37天)，相比之下，在21天的对照组，IgG处理的小鼠(图一)。 5C )。这些结果提示双靶向IL-6和CD 40是克服GBM抵抗ICI的有效策略。
图5：IL-6中和和CD 40刺激使GBM对免疫检查点阻断治疗敏感. 大鼠移植性GBM的实验研究 a –c ，来源于RCAS基因工程模型的肿瘤细胞( n =6-7只小鼠 n 数字如图所示)或 d –f GL 261肿瘤细胞( n =8-9只小鼠 n 数字如图所示)，然后是不同的治疗和生存分析。 a , d 实验程序。 b , e 用生物发光成像技术分析肿瘤体积。 c , f 用双侧对数秩Mantel-Cox分析法监测和分析小鼠的生存情况.中位生存期。源数据作为源数据文件提供。
此外，我们在独立的GL261小鼠GBM模型中测试了双重靶向治疗的疗效。 5D )。与在基因诱导的GBM模型中观察到的结果相似，proCD 40和抗IL-6单药对肿瘤生长和动物存活的治疗作用分别有限和中等(如图1所示)。 5E，f )。与先前公布的数据一致 32 GL 261肿瘤对ICI治疗有部分反应。值得注意的是，ICIS与IL-6和CD 40双重靶向作用的结合导致了完全的治疗反应，所有治疗动物在治疗结束时存活，没有发现肿瘤(图1)。 5E，f ).
IL-6中和和CD 40刺激加免疫检查点阻断协同减少M-ϕ介导的免疫抑制，增强T细胞浸润和活化 接下来，我们在基因工程的GBM模型中观察了联合治疗对治疗后2天肿瘤免疫功能的影响(图1)。 6A )。我们的数据表明，三重治疗几乎完全阻断了肿瘤的生长在治疗窗口，并在较小的程度上，联合治疗与IL-6中和和CD 40刺激明显减少肿瘤生长(图一)。 6B )。流式细胞仪分析肿瘤来源的单细胞悬液显示，与对照组相比，所有治疗组均表现出肿瘤相关的Mϕs的免疫抑制活性逆转，而IL 10的数量减少就证明了这一点。 + F4/80 + 细胞增加了70%(见图)。 6C )。然而，只有三重治疗引起了显著的( P < 0.01), robust sevenfold increase in the infiltrates of cytotoxic CD45+ CD8 + T细胞(图1. 6d )，这很可能导致治疗的好处，包括延迟肿瘤生长和延长动物的生存(图一)。 5B，c )。此外，三次处理可增强这些浸润的T细胞的活性，如CD 45的增加所表明的那样。 + CD8 + 基67 + 和CD 45 + CD8 + 干扰素-γ + 表达增殖标记Ki 67和细胞毒性细胞因子IFN-γ的细胞群体(图)。 6E，f )。此外，除CD 40单独刺激治疗外，所有治疗方法均降低肿瘤组织中免疫抑制细胞因子(IL-10和TGF-β)的表达，与对照组相比，免疫抑制性细胞因子在肿瘤组织中的表达减少(如图1所示)。 6g，h )，验证Mϕ介导的免疫抑制在GBM中的逆转。
图6：IL-6中和和CD 40刺激加免疫检查点阻断协同逆转Mϕ介导的免疫抑制，激活GBM相关T细胞. 用不同的方法诱导小鼠GBM，并进行终点分析。 a 实验程序。 b 应用生物发光成像技术对治疗前后肿瘤体积进行分析。左边，有代表性的图像。对，量化结果( n =6只小鼠，平均±SEM)。用Dunnett检验进行双向方差分析。 c –f 流式细胞术分析肿瘤细胞来源的单细胞悬液。 c , d 细胞被 c 、抗F4/80和抗IL-10，或 d 抗CD 45和CD8抗体。左，有代表性的分类。对，量化结果( n =5只小鼠，平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。 e , f 细胞被 e 抗CD8及抗Ki 67，或 f 抗CD8和抗IFN-γ抗体。量化结果显示( n =5只小鼠，平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。 g , h 肿瘤裂解物 g 伊-10和 h 转化生长因子-βELISA分析(均值±扫描电镜) n =4只小鼠ICI+IL-6抗体治疗组， n =6只小鼠为ICIS，CD 40 Ab，加IL-6 Ab治疗组，及 n =其他各组小鼠5只)。单因素方差分析与Dunnett检验。源数据作为源数据文件提供。
与GL261GBM模型并行研究(补充图)。 6A )，三重处理同样减少了IL-10的数量。 + F4/80 + Mϕs(附图) 6B )，加强CD 45的渗透。 + CD8 + T细胞进入肿瘤(附图)。 6C )，并增加了CD 45的人口。 + CD8 + 干扰素-γ + 活性T细胞(附图) 6d )。综上所述，我们的数据表明，双靶向IL-6和CD 40结合检查点阻断的联合治疗会强烈逆转Mϕ介导的免疫抑制，导致T细胞浸润和激活。
GBM患者IL-6高表达和CD 40低表达与生存不良相关 最后，我们分析了肿瘤基因组图谱(TCGA)数据集，以探讨IL-6和CD 40在GBM或胶质瘤患者中的作用。我们的结果表明：(1)IL-6刺激CD 40在Mϕs的体外表达(如图1所示)。 3G，h (2)IL-6基因敲除或抑制可降低小鼠肿瘤相关Mϕs中CD 40的表达。 3i，j TCGA数据中IL-6的表达与CD 40的表达密切相关(图1)。 7A )。CD 40的表达与IL-6在GBM中的促炎作用相一致，也与TNF-α、IL-1α、IL-1β等促炎细胞因子的表达有关。 7A )。相比之下，另一种调节Mϕ和T细胞功能的重要细胞因子IL-4的表达与CD 40在GBM或所有级别胶质瘤中的表达无关(图一)。 7b )。此外，临床总生存期数据显示，高表达IL-6与GBM患者生存不良有关(图一)。 7C 和补充图。 7b CD 40的表达并不是影响GBM患者生存率的一个预后因素(如图所示)。 7C 和补充图。 7b )。有趣的是，IL-6高表达和CD 40低表达的GBM患者总体生存率最差(如图所示)。 7D 和补充图。 7b )。这些临床数据共同支持我们的实验结果，表明IL-6控制GBM相关Mϕs中CD 40的表达，IL-6和CD 40对肿瘤免疫和病理结果有重要的调节作用。
图7：人GBM患者IL-6高表达和CD 40低表达与生存不良相关。 a , b CD 40表达与 a 中-6和 b 用GlioVis/TCGA、GBM-RNA-seq( n 160例)和低度胶质瘤( n =513名患者)数据集。用线性回归分析进行统计分析。 c , d 用TCGA-Firehoss数据集分析IL-6和CD 40表达(高/低截止率为40%)与总生存率的相关性。用双面对数秩检验进行统计分析。 e 一个图式模型。IL-6分别通过IL-10和CD 40的表达诱导Mϕ的抗炎和促炎作用.抗IL-6中和和CD 40激活联合治疗可逆转Mϕ介导的肿瘤免疫抑制，促进T细胞浸润和活化，使肿瘤对检查点抑制敏感。
总之，我们的工作揭示了IL-6在肿瘤免疫调节中的复杂作用。 7E )：IL-6可诱导选择性Mϕ极化和抗炎免疫抑制，而通过STAT 3/HIF-1α刺激促炎CD 40的表达。因此，抗IL-6单药治疗不能诱导强大的抗肿瘤活性和克服gbm对检查点阻断的抵抗力，这可能是由于共同刺激的CD 40信号减少和T细胞浸润和激活不足所致。基于这些结果，我们开发了双靶点抗IL-6和proCD 40策略，以激活肿瘤免疫，使肿瘤对T细胞免疫治疗敏感，包括检查点阻断。
