基于单变量的关联测试
本研究共评估19项血小板聚集表型指标(补充表)。1)。这包括9种作为激动剂的二磷酸腺苷(ADP)、9种肾上腺素和4种胶原。对3125名欧洲裔美国人(EA)和730名非洲裔美国人(AA)(补充表)中的~2800万个变异体进行了全基因组单变异试验。2)来自Framingham心脏病研究(FHS)、老年Amish研究(OOA)和动脉粥样硬化风险的遗传学研究(GeneSTAR)。我们鉴定了101个与ADP、肾上腺素或胶原反应的血小板聚集相关的变异体(P值<5×10−8、图1.1，补充图。1)。使用迭代条件分析，基因组范围内的显着变异被细化到16个独立的位点(表)。1)。除两个变异体(rs 12041331和chr 17：21960955)外，所有基因座都与血小板聚集相关(图1)。1B)，而且大多数已识别的基因座在现有的基于数组的方法中不存在。8,9,10(表)1、补充图。2–4).
图1：16个基因座血小板聚集和汇总效应的全基因组关联研究结果P < 5 × 10−8.A3855名TOPMed参与者的全基因组关联研究结果显示血小板聚集反应肾上腺素、ADP和胶原。P提供的值是单个激动剂的所有个体表型的摘要(即最小值)。P肾上腺素、ADP和胶原的8、7和4种个体表型变异的价值，详见补充表1). P值来自双面分数测试，不对面板中的多次测试进行调整。A和B。基因座通过基因组范围的意义(P < 5 × 10−8)标记为红色的点。位点名称代表最近的(对于新的)或以前注释(对于已知的)基因。红线表示P值阈值为5×10−8，对应于全基因组的意义。B19个表型在16个位点上的前哨变异圆图显示了GWAS信号的强度(从中心环第二个)和效应的大小/方向(中心环)。
表1 3855名TOPMed参与者通过基因组范围内血小板聚集对肾上腺素、ADP和胶原反应的单一变异方法确定的16个位点。 单变量结果的复制
对来自FHS、OOA和GeneSTAR的多达2 009个独立样本进行了发现发现的复制(补充数据)1)，并扩展为一个独立的队列(凯尔菲利前瞻性研究[CAPS]，N=1183)ADP和胶原诱导的血小板聚集表型8,13(补充表)4)。在先前报道的7个位点中10，在这次调查中复制了2次(PEAR 1和ADRA2A表1)。样本数目减少，在先前研究的两个队列(FHS和GeneSTAR欧洲样本)的参与者中，重叠百分比较低(<75%)，增加受试者(OOA和GeneSTAR非裔美国人)，以及WGS数据和HapMap估算剂量数据之间的差异(补充表)5A在一定程度上，可以解释与其他5个先前确定的基因座之间缺乏关联的原因。元分析，而不是超级分析方法，并没有有意义地改变对这些发现的解释(补充表)。5A，b)将目前的WGS结果与先前的研究进行比较。与目前调查结果的比较RGS 18变体见补充表5B在之前的研究中，没有其他新发现的WGS变异体。
血小板eQTL基因座的共定位
鉴于采用单变异方法识别的所有16个基因座都位于基因组的非编码区，我们通过基因STAR对180个欧洲裔美国人的血小板进行了rna测序，检测了这些区域之间的共定位和eqtl数据。6)。我们发现PEAR 1和RGS 18位点上的哨兵变体为eQTL。PEAR 1和RGS 18分别。其余14个位点均未发现共定位。如图所示。2A，很可能只有一个变量来解释PEAR 1与之形成对比的是GWAS峰值RGS 18可能有几个因果变异。
图2：WGS信号的共定位PEAR 1和RGS 18影响血小板基因表达的区域及其调控特征RGS 18等位基因特异性SNP对增强子活性的影响。WGS相关信号与血小板eQTL信号的共定位及等位基因特异性实验RGS 18SNP增强剂P面板中的值A分别是GWAS/eQTL的双面分数/线性模型测试，不对多重测试进行调整。P面板中的值B是来自双面韦尔奇测试，没有调整多个测试。A顶部面板显示PEAR 1EQTL和WGS对Epi_low1反应血小板聚集的关联(见附表)1)和底部面板之间RGS 18与WGS关联的eQTL对Epi_low 5的血小板聚集反应(见补充表)1)。在左面板中，共定位区域被放大到SNV±25 kb，Y轴显示GWAS关联的-log(P)，点的颜色代表eQTL基因证据的强度，eQTL分析中不包括的SNV以灰色表示。右面板显示了GWAS的ChiSquare统计量与两组数据中所有SNV的eQTL信号之间的散点图和相关性。BRs12070423 A或G等位基因在HEK 293细胞中表达GATA 1(TOP)和rs4495675T或G等位基因过表达NFE 2(下)的等位基因特异性增强子活性差异。每个等位基因特异性结果代表12个实验的结果(12个生物复制超过3个独立复制)。提供的数据表示平均值。(下午)扫描电镜
外部生物圈中的PheWAS
对表中所报告的哨兵变体的检查1在英国Biobank和BioVU执行，如补充数据所示2。次要等位基因(A)PEAR 1在rs 12041331，已知与较小的血小板聚集有关，PEAR 1RNA和蛋白表达14,15，在BioVU Biobank PheWAS中，EAs和AAS的消化道出血几率增加。
RGS 18位点的功能随访
在RGS 18区域，使用独立样本复制了几个变量(补充数据)1)，在CAPS研究中还观察到了ADP和胶原聚集表型的额外证据(补充表)4)。将相关变异体与血小板eQTL和巨核细胞表观基因组特征相结合，有几种潜在的候选多态性(补充表)。8)。与人类的结果一致，独立RGS 18−/−小鼠研究表明rgs 18可以抑制激动剂前刺激的血小板反应性，而敲除则表现出对多种激动剂途径的过度血小板反应，减少出血时间，增加动脉阻塞。16,17。这是由于血小板中G蛋白偶联受体信号通路丧失抑制所致。18。次要等位基因(C)RGS 18在rs 1175170时，与BioVU Biobank中EAs和AAS的动脉血栓/栓塞有关(补充数据)2)。等位基因特异性和转录因子过表达研究表明，可能扰乱GATA 1靶点的rs 12070423和可能破坏NFE 2靶点的rs 4495675，都能降低RGS 18的表达(图1)。2B，补充表9、补充图。4和5)。这些SNP在LD中(最小r值)。20.614)rs 1175170提示它们可能是影响RGS 18介导的血小板活化的单倍型的功能变异。
基于稀有变异方法的基因鉴定
斯卡特19对17,774个蛋白质编码基因进行了mf阈值为0.05的有害变异体的基因检测(补充表)。10，补充图。6)在Bonferroni矫治后有显著发现SVEP 1(ADP诱导的血小板聚集，P数值=2.6×10−6), BCO 1(肾上腺素诱导的血小板聚集，P=8.9×10−7), NELFA(胶原诱导的血小板聚集，P=1.7×10−6)和IDH3A(胶原诱导的血小板聚集，P数值=2.6×10−6)。贯通独处分析，我们观察到这些关联主要是由单一或有限的稀有变异(补充图)驱动的。7，补充表11)。例如，SVEP 1与ADP诱导的血小板聚集的关联完全是由第二外显子(rs 61751937，MAF 0.028)中的一个非同义变异体(Gly229Arg)驱动的。P数值=5.8×10−6)。这一变异改变了一个高度保守的残基位于蛋白质的VWFA结构域(如图所示)。3A-C)。这一发现在复制队列中仍然具有重要意义(P数值=0.004，补充表3)和上限(P数值=0.008，补充表4)，两者均与ADP诱导的血小板反应性增强有关。这两种变体都与英国生物库的CVD结果有一定的关联(补充表)。7).
图3：SVEP 1中的蛋白编码变异对229 g，2702D及周围序列的ADP血小板活化、蛋白结构域和跨物种保守性的影响。年聚集的稀有有害编码变异体的关联SVEP 1和ADP诱导的血小板聚集。P面板中的值A都来自于双面分数测试，没有对多重测试进行调整。A使用独处方法，我们发现了一个罕见的编码变异(Rs 61751937)，解释了大多数关联。第一个橙色点代表了整个基于基因的测试，包括64个变种。当特定标记的变异被剔除时，随后的橙色点代表基于基因的测试的-log 10(P)，而蓝色的条形代表被排除在外的特定变异的小等位基因频率。BSVEP 1的图式蛋白结构Rs 61751937在229位用甘氨酸代替精氨酸。另一个变体SVEP 1在2702位与以甘氨酸代替天冬氨酸的冠心病有关。C利用UniProt技术，共鉴定出98个同源物为最大的人SVEP 1蛋白亚型，并对其进行了排列。对准在MAFFT中可视化(第7节，Https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/，Katoh等人。2017年)59有杂色的。229g和2702D两种氨基酸在不同物种及其周围蛋白质结构域上都高度保守。序列标识符、属和种在补充数据中给出。3.
基因变异在MK特异性超促进剂中的作用
为了研究基因变异在超增强子环境下对调控重要性的作用，我们在一组1065个发表的mk特异性超级增强子中聚集了罕见的非编码变异(补充图)。8)20。我们在超级增强子中发现了罕见的非编码变体PEAR 1位点与ADP-(P=2.4×10−8)，肾上腺素-(P数值=1.1×10−7)和胶原蛋白-(P数值=2.7×10−5)诱导血小板聚集。我们观察到，与基于基因的编码变异分析形成鲜明对比的是，PEAR 1超级增强剂是由该地区的多个稀有变体驱动的(补充图)。9).
