三阴性乳腺癌的脂肪发生与肿瘤免疫微环境不良及生存率差有关

癌症相关脂肪细胞已知会引起炎症；然而，脂肪发生、脂肪细胞的形成在乳腺癌中的作用尚不清楚。我们假设肿瘤内脂肪发生反映了不同于肿瘤内脂肪细胞丰富的癌症生物学。采用分子标记数据库Hallmark脂肪发生基因集变异分析对脂肪发生进行量化。共有5,098名多组乳腺癌患者(培训；GSE 96058)n=3273)，验证；TCGA(n=1069)，治疗反应；GSE 25066(n=508)和GSE 20194(n)进行分析。脂肪的发生与脂肪细胞的丰富程度无关。三阴性乳腺癌(TNBC)的脂肪生成明显降低。脂肪生成增加与TNBC生存不良有关，而在其他亚型中则无显着性差异(P>0.05)。高脂肪发生TNBC与低同源重组缺陷显著相关，但与突变负荷无关。高脂肪发生的TNBC丰富代谢相关基因集，但细胞增殖和炎症相关基因集均未富集到脂肪细胞。高脂肪形成TNBC与低CD8浸润+T细胞和高M2巨噬细胞。虽然脂肪发生与新辅助化疗反应无关，但高脂肪生成TNBC与低表达Pd-L1和Pd-l2基因和免疫检查点分子指数。因此，TNBC的脂肪发生与肿瘤代谢和肿瘤免疫微环境不良有关，这与脂肪细胞的丰富程度不同。

乳腺癌的筛查和治疗的进展都明显改善了乳腺癌患者的预后。然而，乳腺癌仍然是美国妇女中最常见的癌症死亡原因。1。肥胖是几种癌症的危险因素之一，与乳腺癌的发生、癌症的进展和不良的临床结局有关。2。许多研究表明肥胖和癌症发展之间的生物学联系。例如，脂肪组织会引起炎症，其特征是脂肪细胞被巨噬细胞包围，形成冠状结构。3并增加组织中促炎介质的水平4。我们报道了鞘氨酸激酶1在乳腺癌细胞中产生的鞘氨醇-1-磷酸(S1P)与肥胖、慢性炎症和转移有关。5，S1P参与肥胖相关乳腺癌的阿霉素耐药。6.

肿瘤内脂肪细胞，又称癌相关脂肪细胞，与癌细胞相互作用，分泌炎性细胞因子(如：IL-6和α)。7。这些细胞因子会导致癌前炎症，这种炎症会加重癌症的进展，并激活多种途径，如上皮间充质转换(EMT)、Noch 1信号和血管生成。8,9,10,11。我们以前曾报道过，肿瘤内脂肪细胞与炎症和转移有关，但使用多个具有转录序列的大乳腺癌组，细胞增殖较少，患者生存更好。12。这些数据表明肿瘤内脂肪细胞的丰富程度反映了大量肿瘤的癌细胞密度，从而减少了肿瘤的侵袭性。另一方面，脂肪发生的临床相关性，即脂肪细胞的产生与先前研究中所研究的脂肪细胞的存在相比，从来没有在大型患者队列中显示过。

到目前为止，我们的小组一直在研究生物学途径在乳腺癌进展中的作用及其临床相关性。我们和其他人反复表明，使用多个基因的竞争评分比单个基因的表达更准确地预测生物途径，因为多个基因参与了癌症的进展。13,14。基于基因集的方法利用多个基因，考虑到基因的协调性，降低了模型的复杂度，提高了预测的解释力。15。我们使用基因集变异分析(GSVA)和Hallmark基因集在分子签名数据库特征基因集集合中的评分，从而可以探索一个感兴趣的信号通路的生物活性。16。该方法已被广泛应用于从全球基因表达数据中评估通路活性，从而显示出g2m检查点的临床相关性。17，E2F目标18、MYC目标19，KRAS发出信号20，雌激素反应21血管生成途径22乳癌。

在此，我们假设肿瘤内脂肪发生的活动与不同的癌症生物学有关，与乳腺癌中脂肪细胞的丰富程度有关。为了验证我们的假说，我们用GSVA Hallmark脂肪发生基因集定义了脂肪发生活性，并对5,098名乳腺癌患者进行了测试和验证。

乳腺癌Cohors的临床及转录资料

1,069例乳腺癌基因组图谱(TCGA-BRCA)中女性乳腺癌患者的临床资料23并通过cBio癌基因门户获取rna测序数据。24，我们以前报道过25,26。我们还获得了GSE 96058队列的临床和rna测序数据(n=3273)27来自基因表达总括(GEO)存储库。我们使用了Siegel等人的研究。(GSE 110590；n=83)28用于转移性乳腺癌的分析，并由塞曼斯等人提出。(GSE 25066；n=508)29和石等人。(GSE 20194；n=248)30用于药物反应分析。转化后的基因表达数据用于log。₂.

TCGA和GEO数据集，均为公开数据库，机构审查委员会被免去.

基因集变异分析(GSVA)和基因集富集分析(GSEA)

用基因集变异分析法(GSVA)测定肿瘤内脂肪发生途径评分。31利用分子标记数据库(MSigDB)中的“Hallmark_脂肪发生”基因的生物导体封装16，类似于我们如何测量其他几个信号得分。21,32,33。基因集富集分析(GSEA)34统计显着性定义为GSEA软件推荐的错误发现率(FDR)小于25%。

其他分数

用Xcell算法估计免疫细胞和脂肪细胞的比例35使用R(表)S4)。细胞溶解活性评分以颗粒酶A的表达水平为依据。GZMA)和穿孔素1(PF1)，这是由Rooney等人报道的。36。用Thorsson等计算同源重组缺陷(HRD)、分数改变、沉默突变和非沉默突变、单核苷酸变异(SNV)和INDEL新抗原评分。在TCGA中37。根据免疫检查点分子的mrna序列数据计算免疫检查点分子指数，包括ADORA2A(A2AR)、CD 274(PD-L1)、PDCD 1(PD1)、CTLA 4、HAVCR2(TIM3)、IDO 1、IDO 2、PD1LG2(PD-L2)、TIGIT、Vista(C10orf54)、和VTCN1(B7-H4)，按照Balli等人的描述。38.

统计分析

R软件(4.0.1版)用于分析。以成脂途径评分的中位数作为分割，在队列中划分两个脂肪发生评分组。计算采用Mann-Whitney U检验和Fisher‘s检验。p分组值-比较分析。生存分析采用Kaplan-Meier曲线加对数秩检验。用Xcell算法用R软件计算Xcell评分35，用于估计肿瘤微环境中的几个免疫细胞比例，正如我们先前报道的那样。39,40,41,42,43。统计意义被定义为p-数值小于0.05。

高脂肪发生评分与脂肪发生相关基因的高表达显著相关。

脂肪发生途径评分定义为分子标记数据库(MSigDB)中Hallmark Adipoogenation基因集的GSVA评分。分数中包含的基因列在补充表中。沙一。中间值被用作分割，在队列中分为低和高脂肪生成评分组(图1)。沙一)。首先，为了检验该评分是否反映了乳腺癌患者的脂肪发生，我们研究了该评分与几个脂肪发生相关基因(Acetyl-coA羧化酶/)之间的关系。ACLY，ATP柠檬酸裂解酶/Acca，NADP依赖性苹果酸酶/SLC25A10，和线粒体二羧基化载体/ME1)和脂肪细胞相关基因(脂联素/ADIPOQ瘦素/LEP、脂蛋白脂肪酶/LPL和危险品1/PLIN 1)在GSE 96058和TCGA队列中。高脂肪发生评分肿瘤与GSE 96058队列中所有脂肪发生相关基因的高表达显著相关(图一)。1全部p < 0.001). This result was validated by the TCGA cohort, except for Acetyl-CoA carboxylase/ACLY和ATP柠檬酸裂解酶/AcCA基因。高脂肪发生评分肿瘤与脂联素/高表达显著相关。ADIPOQ瘦素/LEP、脂蛋白脂肪酶/LPL和危险品1/PLIN 1这两个队列中的基因(图1)。1b)。高脂肪发生评分的肿瘤也与其他脂肪发生相关基因的高表达显著相关，包括CEBPPA，AP2(FABP 4)，和GLUT 4(SLC2A4)，以及PPAR的低表达(PPARA)，在这两个队列中(如图所示)。S2全p < 0.001). On the contraly, there was no correlation between adipogenesis and adipocyte scores in neither of the cohorts (Fig. 1C；Spearman秩相关(r)分别为0.234和0.249)。脂肪生成评分也与瘦素(Leptin)无关(LEP)至脂联素(ADIPOQ)GSE 96058队列中的比率(如图所示)。S3, r=0.063，p < 0.01). These results suggest that the score reflects adipogenesis but does not overlap with adipocyte score.

在GSE 96058和TCGA队列中，脂肪发生评分与脂肪发生相关基因和脂肪细胞相关基因的表达有关，与脂肪细胞评分的相关性。儿童低、高脂肪发生评分肿瘤基因表达水平的比较(A)脂肪发生相关基因；乙酰辅酶A羧化酶/ACLY，ATP柠檬酸裂解酶/AcCA，NADP依赖性苹果酸酶/SLC25A10，以及线粒体二羧基化载体/ME1，和(B)脂肪细胞相关基因；脂联素/ADIPOQ瘦素/LEP、脂蛋白/LPL，以及Perilipin 1/PLIN 1乳癌。P-用Mann-Whitney U检验计算。(C)脂肪发生与脂肪细胞评分的相关性。Spearman相关系数(r)已习惯于分析。

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三重阴性(Tnbc)和基底亚型乳腺癌的脂肪生成评分较低，但与临床侵袭性无关。

为探讨乳腺癌成脂评分与临床特征的关系，我们在GSE 96058和TCGA队列中检测了美国癌症联合委员会(AJCC)的分期、T类、N类、Nottingham病理分级、亚型和PAM 50。该评分与积极的临床参数，包括AJCC分期和T-类别在两个队列中没有关联(图)。2a)。高分与高N类显著相关(图一)。2a；p=0.017)仅在TCGA队列中，而在GSE 96058队列中不存在(图1)。2a；p=0.613)。虽然脂肪发生评分在第四阶段出现较高的平均值，但由于样本数量少(18/1069(1.6%))，差异不显著。Nottingham组织学分级2级的脂肪发生评分明显高于GSE 96058的其他级别，而TCGA组则无显著差异。免疫组织化学(IHC)确定的三阴性乳腺癌(TNBC)和PAM 50分类所确定的两组患者的脂肪发生评分均明显偏低(图1)。2B；全部p < 0.001). Clinical and pathological features of low and high adipogenesis score in the GSE96058 (n=3273)和TCGA(n补充表中总结了队列S2和S3。此外，我们还使用GSE 110590队列比较了原发性和转移性乳腺癌的脂肪发生评分(补充图)。S4)。我们发现，虽然总体上没有显着性差异，但与原发性乳腺癌相比，肝转移评分明显偏高(*)。p=0.025)。这些结果表明，脂肪发生评分与临床癌症侵袭性无关，但TNBC的肿瘤内脂肪发生明显减少。

GSE 96058和TCGA队列中脂肪生成途径评分与临床特征的关系。肿瘤成脂记分的X线分析(A)美国肿瘤分期、肿瘤大小(T级)、淋巴结阳性(N级)、诺丁汉病理分级及(B)乳腺癌亚型，和PAM 50分类。P-数值用Kruskal-Wallis检验计算。组大小显示在地块下面。

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高脂肪发生评分与tnbc的存活率差显著相关，而在其他亚型中则不相关。

鉴于各亚型的脂肪发生评分有显着性差异，我们假设每种亚型可能与脂肪发生有不同的关系。为了验证这一点，我们分析了TCGA队列中的疾病特异性生存(DSS)，以及GES 96058和TCGA队列的总体生存率(OS)。高脂肪发生评分与GSE 96085组整体和ER阳性/HER 2阴性乳腺癌患者的OS差显著相关(图一)。3(A)，但不属于TCGA队列(图1)。3a)。此外，在TCGA中，HER 2阳性乳腺癌的高脂肪发生评分与OS较差显著相关，但在GSE 96058队列中未得到证实。值得注意的是，在GSE 96058和TCGA队列中，患者是否接受了HER 2靶向治疗尚不清楚，这可能严重混淆了数据及其解释。另一方面，在TNBC中，在GSE 96058中，高分数与更糟糕的OS显著相关(见图)。3c；p在TCGA中，更糟糕的决策支持系统和操作系统(如图所示)。3c；p=0.031，以及p=0.007)。这些结果提示，高脂肪发生评分与预后较差有关，特别是在TNBC患者中。

在GSE 96058和TCGA队列中，脂肪发生途径评分与患者整体及各亚型的生存相关。Tcga队列中疾病特异性生存(Dss)的Kaplan-Meier图，以及两个队列中的总体存活率(OS)，分别以低(蓝)和高(红)分的成脂率计算。(A)整个，(B)雌激素受体(ER)+/HER 2−(C)人表皮生长因子受体2(HER 2)阳性，或(D)三重阴性乳腺癌(TNBC)患者。以中位数作为分割值，将各组分为低脂组和高脂组。P-数值计算采用对数秩检验。

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在tnbc中，较高的脂肪生成评分显著丰富了代谢相关的基因，而不是炎症或细胞增殖相关的基因集。

鉴于脂肪发生评分仅在TNBC中有显着性差异，我们的研究重点是TNBC。为了阐明TNBC评分差异的机制，我们对TCGA和GSE 96058两组的Hallmark基因集进行了基因集富集分析(GSEA)。高脂肪发生评分显著丰富了代谢相关基因集；氧化磷酸化、脂肪酸代谢和胆固醇稳态基因集，以及过氧化物酶体和活性氧途径在两个队列的TNBC中的作用(图一)。4a)。令人惊讶的是，与炎症有关的基因(炎症反应、干扰素-α信号、干扰素-γ信号)和细胞增殖相关基因(E2F靶点、g2m检查点、MYC靶V1和v2、有丝分裂纺锤体)没有明显的富集，这些基因都在我们上一期的出版物中富集到低脂肪细胞分数。12(无花果)4b、c)。

高脂肪形成TNBC与低同源重组缺陷(HRD)和低CD8比例显著相关。+T细胞

鉴于GSEA中脂肪发生与脂肪细胞丰度的差异，我们进一步研究了TNBC中脂肪发生与浸润免疫细胞的关系。同源重组缺陷(HRD)是引起突变和高突变负荷导致新抗原产生的机制之一，被认为是吸引免疫细胞进入肿瘤微环境的机制之一。44。我们发现，高脂肪发生与低HRD水平和分数改变量显著相关(见图)。5a；p=0.005，p=0.008)，但不存在沉默或非沉默突变，也不存在单核苷酸变异(Snv)和新抗原。5a；p=0.008，0.424。(分别为0.293、0.089和0.530)。另一方面，我们发现高脂肪形成的tnbc与CD8的低比例显著相关。+T细胞和大量M2巨噬细胞在这两个队列中保持一致(见图)。5b)。高脂肪形成与TCGA组中Th2和Tregs的低比例、Th1和M1巨噬细胞的高比例显著相关(图一)。5(B)但不在GSE 96058中。反映整体免疫反应的溶细胞活性评分与脂肪发生无关(图一)。5c)。这些结果表明，高脂肪形成的TNBC具有较少的HRD和较低的CD8浸润。+T细胞，但M2巨噬细胞大量浸润。

高脂肪形成与新辅助化疗(Nac)反应无关，与pd-l1和pd-l2低表达及抑制检查点指数显著相关。

高浸润性CD8乳腺癌+T细胞对nac有更好的反应，特别是在tnbc中。45。因为高脂肪形成与低CD8有关+T细胞，我们认为高脂肪发生与NAC后病理竞争反应(PCR)的实现降低有关。与我们的预期相反，ER-阳性/HER 2阴性或TNBC亚型在GSE 25066或GSE 20194队列中的低、高脂肪发生评分之间没有差异(图一)。6a)。另一方面，高脂肪发生TNBC与GSE 96058和TCGA队列中的主要免疫检查点分子PD-L1和PD-L2的低表达密切相关(图一)。6b)。此外，高脂肪发生乳腺癌与TNBC中免疫检查点分子指数的降低以及GSE 96058和TCGA(图5所示)的整个队列中的免疫检查点分子指数低密切相关。6C和S5)。这些发现表明，脂肪发生与NAC反应无关，但高脂肪发生与免疫检查点分子水平低有关，尤其是Pd-L1和Pd-l2.

在本研究中，我们通过转录组的评分证明了乳腺癌肿瘤内脂肪发生的临床相关性。在乳腺癌中，脂肪发生评分与脂肪发生相关基因和脂肪细胞相关基因的表达显著相关，但与脂肪细胞比例无关。在其他亚型中，TNBC和基础型的成脂评分显著低于其他亚型。高脂肪发生与生存状况明显相关，特别是在TNBC。高脂肪形成的tnbc丰富了多种代谢相关基因；氧化磷酸化、脂肪酸代谢、过氧化物酶体和活性氧途径，但与脂肪细胞浸润不同的是，细胞增殖和炎症相关基因集均未富集。高脂肪形成TNBC与低HRD、变率及CD8减少显著相关。+T细胞和高M2巨噬细胞浸润。NAC后，ER-阳性/HER 2阴性或tnbc表达均无显着性差异，但高脂肪形成与低表达显著相关。Pd-L1和Pd-l2免疫检查点分子指数低。

众所周知，肿瘤内脂肪细胞会引起炎症、缺氧和血管生成。8,9,10，这与病人的生存能力差有关。众所周知，脂肪细胞参与了一个由癌细胞组成的高度复杂的恶性循环，以促进癌症的发展。46。我们曾证明，在基因集富集分析中，高比例的肿瘤内脂肪细胞富集于炎症相关和转移相关的基因，而细胞增殖相关的基因集富集较少，但与生存无关。12。我们推测，这是因为高度增殖的肿瘤细胞密度过高，脂肪细胞不可能在这样的肿瘤微环境中生存。因此，肿瘤内脂肪细胞所诱发的侵袭性生物学被选择较少增殖的癌症所抵消，而脂肪细胞的丰富并没有导致临床结果的差异。虽然脂肪细胞是脂肪发生的最终产物，但我们发现乳腺癌中脂肪细胞与脂肪细胞之间的相关性很弱，高脂肪发生TNBC并不能丰富与高脂肪细胞相似的基因，包括免疫和增殖相关的途径。另一方面，高脂肪发生的TNBC与代谢相关基因集呈显著相关，但与脂肪细胞的丰度无关。这些结果使我们推测，TNBC具有较高的代谢活性，包括脂肪生成，但由于大量的不利免疫细胞浸润，而不是侵袭性的肿瘤生物学，如高细胞增殖，导致其生存不良。我们的研究结果表明，脂肪发生评分能更好地反映脂肪相关信号通路，而不是脂肪细胞的丰富程度。血清瘦素/脂联素比值是癌症危险的重要指标47,48。虽然在肿瘤组织中没有发现这种情况，但在本研究中，瘦素与脂联素的比值与脂肪发生程度无关。众所周知，TNBC是一种异质亚型，最近的研究将TNBC分为几类(Burstein等人)。49著：Lehmann等。50))。我们发现，与其他亚型相比，无论是经IHC分析分类的TNBC，还是PAM 50分类的基础型，其脂肪发生评分均显著低于其他亚型。为此目的，调查Burstein等人报告的这四类新的TNBC之间的联系将是很有趣的。49然而，我们不能这样做，因为我们无法在研究队列中获得关于TNBC的这些新分类的数据。

虽然TNBC中脂肪细胞的丰度与CD8的浸润无关+T细胞和巨噬细胞、高脂生成的TNBC与CD8减少显著相关。+T细胞和高M2巨噬细胞浸润，生存不良。这些发现提示，脂肪细胞的生成活性和丰度反映了乳腺癌不同的生物学特征。这表明肿瘤内脂肪发生的临床意义可能不是由于细胞周期或炎症，而是由于肿瘤免疫微环境不太有利和更不利。众所周知，tnbc在乳腺癌亚型中有较高的免疫细胞浸润。45。我们的小组以及其他人都证明，CD8高的TNBCs。+T细胞浸润具有较好的存活率，并与免疫检查点分子的高表达密切相关。39。巨噬细胞作为肿瘤浸润免疫细胞的重要子集，参与肿瘤的整个进展过程，又称肿瘤相关巨噬细胞。M2巨噬细胞被认为是癌前免疫细胞，抑制抗原提呈功能，从而促进免疫逃逸。肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤相关脂肪细胞在乳腺癌中的关系11。死亡或死亡脂肪细胞周围的巨噬细胞经常出现在脂肪组织中。51。这是促炎过程的组织学特征，脂肪组织导致肥胖乳腺癌的风险增加和预后恶化。52。乳腺癌冠状结构巨噬细胞的数量和密度与脂肪细胞的大小、数量和巨噬细胞的丰度成正比。类冠状巨噬细胞释放脂肪酸和甘油三酯，这是肿瘤内脂肪细胞最常见的两种代谢产物，它们释放炎症因子和细胞因子，促进癌症的发展。53.

近年来，由于免疫治疗的成功，人们对免疫检查点分子越来越感兴趣。54. Pd-L1是一种有利于肿瘤发生的免疫检查点分子，有助于肿瘤从宿主的免疫系统中逃脱。反-Pd-L1治疗现在是治疗多种癌症的标准，包括TNBC。吴等人报告了脂肪的分化和Pd-L1脂肪细胞的表达与免疫检查点抑制的疗效密切相关。55。华莱士等人体外系统显示炎症促进巨噬细胞浸润脂肪组织和脂肪发生56。我们发现高脂肪形成与CD8低浸润有关。+患者的T细胞和M2巨噬细胞与以前在体内和体外系统中所证实的这些机制是一致的。我们不得不推测，脂肪发生评分不仅可以作为预测患者生存的生物标志物，也可以作为TNBC免疫检查点抑制剂的反应。

我们的研究有几个局限性。首先，我们用GSEA Hallmark基因集确定的转录谱来定义脂肪发生，它可能包括也可能不包括所有与脂肪发生相关的基因。第二，这是一项回顾性研究，利用了多个具有可靠的临床和转录数据的大队列；然而，一些临床数据，如共患病和治疗干预措施却缺乏。我们分析的队列缺乏详细的资料，说明哪些病人接受了什么系统治疗，并假定所有患者都接受了“护理标准”。这在HER 2阳性乳腺癌中尤为重要，因为它的靶向治疗是如此的有效，尽管它已知具有攻击性，无论患者是否接受了治疗，都可能是生存分析中的一个重要混淆因素。另一个局限性是，我们的结果仅仅是基于对肿瘤基因表达的分析，没有任何证据证明肿瘤内脂肪发生活动的机制作用。目前的研究没有对肿瘤免疫微环境进行IHC分析，因为我们无法进入GSE 96058和TCGA队列中肿瘤的病理切片。另一方面，我们的研究的新奇之处在于用一个结合多个基因而不是配对的分数来评估脂肪发生和肿瘤免疫微环境。试图证实我们的发现，每肿瘤200个污渍的数千个样本是完全不现实的。最后，为了证明脂肪发生评分作为预测生物标记物的实用性，需要进行前瞻性临床试验。

总之，肿瘤内脂肪发生活动并不能反映出与脂肪细胞丰度相似的肿瘤生物学，而与肿瘤代谢和CD8减少有关。+T细胞和高M2巨噬细胞浸润。该评分可以预测患者的生存和对免疫检查点抑制剂的反应。