无偏功能筛选法鉴定MCLA-145 为制备双T细胞激动剂和阻断双特异性IgG抗体的检查点，制备了多种抗CD 137、PD-1和PD-L1的共轻链Fab板。Fab板被重新格式化为人免疫球蛋白G1(IgG 1)，并被广泛地描述(补充表)。1 )。用47个不同的CD137Fab臂(代表11个表位箱)结合高亲和力和功能活性的pd-L1[8×]或pd-1[3×]Fab武器(补充表)共产生了440个Babs。 1 )。以gg1分子的形式表达babs，并对fch3进行修饰，以促进重链杂化反应。 30 与FC受体结合的CH2修饰 31 。初步筛选显示CD137xPd-L1和CD137xPd-1Babs弱诱导抗CD3激活Jurkat NFκB−Luc CD 137报告细胞中荧光素酶的表达。 1A )，尽管抗CD3治疗后的CD 137报告细胞与PD-1和PD-L1共同表达CD 137(补充图1)。 1A )。在交联的CD 137抗体中加入抗人IgG并不能显着地提高CD 137报告细胞的活性。 1A )。我们的数据表明，CD 137和PD-1或PD-L1在同一T细胞(顺式)上或可能在相邻T细胞(反式)上的双重作用不能有效地诱导CD 137受体下游信号传导。
图1：cd137xpd-1/pd-lbb组合的筛选识别mcla-145。 a CD137xPD-L1和CD137xPD-1双特异性在CD 137 NFκB-Luc报告试验(荧光素酶信号的多次诱导)中的左面板活性； b 活化T细胞与8个候选CD137xPD-L1 Bab组合孵育3d后，在CHO-Pd-L1细胞存在的情况下，用剂量滴定法测定白细胞介素-2(IL-2)的水平；右面板，在野生型CHO细胞中重复实验； c 活化T细胞与三种表现最好的CD137xPD-L1 BABS及对照抗体孵育3天后，在CHO-PD-L1细胞存在下，释放IL-2、IFN-γ和TNF-α(bAb001=MCLA-145)。
在相同的实验条件下，当表达人PD-L1的CHO细胞与CD 137报告细胞共培养时，我们观察到几种CD137xPD-L1 Babs能够诱导CD 137报告细胞的激活。然后，我们在含有WT或Pd-L1表达CHO细胞的人原发性T细胞实验中，对CD137xPD-L1 BABS进行了连续滴定(图1)。 1B )。Urelumab*在共培养的CHO细胞上有或不表达pd-L1的IL-2分泌法测定T细胞的活性。CD137xPD-L1 Bab板显示出一定的效价，有些与urelumab*相当，但只有当pd-L1抗原存在于共培养的CHO细胞时。用纯化的T细胞和葡萄球菌肠毒素B(SEB)激活的PBMCs进行转活化实验，证实CD137xPD-L1 Bab板的T细胞激动剂活性。 1B )。最有效的CD137xPD-L1 Babs如图所示。 1C )比urelumab*或urelumab*和atezolizumab*组合释放更多的细胞因子。在SEB实验中，T细胞的多克隆刺激也与诱导CD 14+细胞的pd-l1高表达和CD8诱导CD 137的表达有关。 + T细胞(附图) 1C )证明在炎症条件下可以实现有效的共刺激。MCLA-145是从CD137xPD-L1 Babs板中筛选出来的。
Mcla-145对其靶标具有很高的亲和力，并在CD 137上结合了一个独特的表位。 MCLA-145与表达人CD 137或PD-L1的CHO细胞和流式细胞仪检测的活化的人T细胞有高度的亲和力(附图)。 2A )。用表面等离子共振(SPR)技术检测MCLA-145与其靶点的亲和力，并在一个基于细胞的系统中证实，该系统的靶点为天然构象(图1)。 2A，b )。SPR显示MCLA-145与pd-L1(0.51±0.05nM)和CD 137(1.9±0.2nM)有较高的亲和力(补充表)。 2 )。MCLA-145能够同时在SPR传感器上绑定到两个目标上(如图所示)。 2C )。用放射标记抗体对人pd-L1和人CD 137的细胞亲和力进行Scatchard分析(分别为0.49±0.03nM和2.02±0.02nM)。 3 )。MCLA-145的亲和力和结合动力学与pd-L1的比较抗体atezolizumab*和avelumab*在同一范围内。 2A )CD 137的urelumab*和utomilumab*。 2B ).
图2：MCLA-145与CD 137上具有高度亲和力和独特的表位结合。 a SPR和细胞亲和力测定与pd-L1结合的综述； b 综述SPR和基于细胞的亲和力测量与CD 137的结合； c SPR亲和力分析显示人Pd-L1和CD 137与固定化MCLA-145双结合。绿色曲线：先注射人PD-L1，然后注射人CD 137或运行缓冲液。红色曲线：注射人CD 137后注射人PD-L1或运行缓冲液； d CD137L(PDB：6MGP)配合物CD 137外显子结构域的表面同源性模型，CRD结构域1-4分别以黄色、绿色、紫色和青色阴影，CD137L为灰带，urelumab*(暗红色)和utomilumab*(橙色)表位的骨架和残基突出，经丙氨酸扫描确定MCLA-145的关键结合残基为蓝球； e 标记CD137L与CHO-CD 137的结合 + 细胞在mcla-145和对照抗体的滴定系列中进行流动分析。 f Pd-1报告细胞与CHO-PD-L1共培养的NFAT活性 + 并与MCLA-145滴定法和对照抗体共同孵育。
CD 137单抗的结合位置对其功能性质有很大影响。 26 。首次采用结构域交换法研究了MCLA-145在CD 137上的表位，利用MCLA-145与小鼠CD 137低亲和力结合的观察结果。MCLA-145仅能与HEK293T细胞具有高度亲和力，瞬时表达保留人半胱氨酸丰富结构域(CRD)2(附图2)的结构物。 2B )。采用一种单独的作图方法，通过丙氨酸扫描实验，将MCLA-145在CD 137上的关键相互作用位点定位到位于CRD 2中的R66、G70、V71和F72残基。 二维空间 ，补充图。 2C )。C 133的丙氨酸替代降低了MCLA-145的结合，但这种作用被认为是由于构象的改变而不是直接干扰MCLA-145的结合。这些作图数据表明，cdd 137上的mcla-145表位位于crd 2，这是cd137l相互作用的关键区域。 32 但与utomilumab和urelumab的结合表位不同(见图)。 二维空间 )。CD 137表位定位符合MCLA-145的CD 137结合臂的功能特征，不存在交联作用，可以阻断CD137L与CD 137的结合(图一)。 2E )。值得注意的是，面板中最强大的CD137xPD-L1 Babs具有这些特性(补充表中以粗体表示)。 1 )提示该结合区是BABS反式激活CD 137的最佳区域，至少在IgG 1格式下是如此。
MCLA-145的pd-L1结合臂起双重作用，既能激活CD 137，又能阻断T细胞与pd-1的相互作用。用Pd-1报告法测定MCLA-145的单价抗Pd-L1活性，并与双价单克隆抗体atezolizumab*进行比较。 2F )。尽管我们测量了MCLA-145对pd-L1的单价亲和力，但它与atezolizumab*相当(图1)。 2A )教育署 50 在报告试验中，伊佐利单抗*的含量显著低于MCLA-145。MCLA-145对T细胞的最大Pd-1抑制作用与AtZolizumab*相似，其浓度与T细胞最大活化CD 137的浓度相当。这些数据表明，MCLA-145除了通过CD 137信号提供共刺激外，还能同时阻断pd-1对TCR信号的抑制，从而增强肿瘤微环境中抗原特异性T细胞的应答。
MCLA-145能有效激活T细胞，促进免疫记忆，克服免疫抑制。 抗原天真的T细胞，如果遇到同源抗原，就会瞬时表达CD 137。 14 。通过抗原特异性启动试验，观察了MCLA-145介导的pd-L1抗原特异性启动试验对人幼稚CD8+T细胞启动的影响。Mcla-145显著增加抗原特异性CD8的绝对数量。 + T细胞(MCLA-145与Neg相比)。Ctrl Ab p < 0.01, as determined by one-way ANOVA and Tukey’s multiple comparisons test) and preferentially enhanced the proportion of antigen-specific T cells with an effector and memory phenotype (Fig. 3A 和补充图。 3A )。与urelumab相比，MCLA-145治疗后抗原特异性T细胞的绝对数量大于urelumab*，而T细胞群体的供者多于治疗相关者。这些结果与小鼠模型中的研究一致，表明T细胞启动过程中CD 137的参与是次级免疫反应的一个关键决定因素，并与抗原特异性记忆CD8+T细胞池的扩大有明显的联系。 33 。与urelumab*联合使用时，对T细胞增殖或分化T细胞比例的影响无明显变化(补充图1)。 3B )。PD-1和PD-L1阻断抗体的实验证实T细胞的增殖和分化与PD-1信号轴无关(附图)。 3C )。综上所述，这些观察表明MCLA-145对T细胞启动的增强作用是由CD 137激活而非PD-1轴阻滞介导的。
图3：MCLA-145活性对原发性T细胞功能的影响. a MCLA-145对天真CD8的影响 + T细胞启动图表显示右旋体+抗原特异性CD8的绝对数目。 + 4例供体T细胞共培养10d后，用流式细胞仪测定T天真/记忆干细胞(CD45RA+CCR 7+)、中央记忆T细胞(CD45RA-CCR7+)、效应记忆T细胞(CD45RA-CCR7-)和终末分化效应T细胞(CD45RA+CCR 7−)数量。 b 转活化试验欧共体 50 人T细胞因子(IL-2、IFNγ和α)在CHO-PD-L1细胞中的分泌 n =7)； c 混合淋巴细胞反应(MLR)检测人白细胞产生干扰素γ n =3个独立供体)，由异基因DC刺激( n (1)在10μg/ml的试验化合物存在下(误差条为扫描电镜)，MCLA-145的干扰素γ浓度显著高于urelumab*、atezolizumab*和neg。Ctrl Ab( p < 0.001) and significantly less compared to ure* + atezo* (p < 0001) as determined by two-way ANOVA and Holm-Sidak’s multiple comparisons test; d 塞伯试验。外周血单个核细胞产生IL-2或IFNγ的折叠变化(左面板， n =3名独立供者，误差条为平均值±SD)或全血(右面板) n 当抗体浓度增加时，SEB刺激后，误差条分别为SEM)； e 用10μg/ml抗体重复刺激人CD4+记忆T细胞产生干扰素γ和肿瘤坏死因子α。 n =4个独立捐助者，误差栏为SEM)，* p < 0.0001 for IFNγ and p =0.0012用于生产肿瘤坏死因子α(NIG)。Ctrl Ab诉MCLA-145)和 p =0.0026为干扰素γ和 p 用双向方差分析和图基试验测定肿瘤坏死因子α产量(mcla-145vs.ure*+atezo*)=0.0025； f Treg法检测活化的白细胞在自身调节T细胞(1：1)和10μg/ml抗体存在下，对肿瘤坏死因子α和干扰素γ产生的多重诱导作用。 n =4独立的捐献者错误条为平均SD)。* p =0.0005为干扰素γ和 p 用单因素方差分析和TUKEY‘s检验，测定肿瘤坏死因子α(Vehicle vs MCLA-145)的值为0.012； g Pbmc：M2抑制法检测人白细胞与活化M2极化巨噬细胞与10g/mL抗体共培养产生干扰素γ。 n =5个独立捐助者，误差栏为SEM，* p < 0.0001 by one-way ANOVA and Tukey’s test).
为了评估MCLA-145对预激活T细胞的作用，我们使用了一组正交的体外试验。用7种不同供体的纯化T细胞进行转活化试验，MCLA-145的EC 50值为10~117 ng/mL，urelumab*的EC 50为22~1752 ng/mL。 3B )。MCLA-145也显示了在混合淋巴细胞反应(MLR)中使用同种异体人DC的强大活性(如图所示)。 3C )和用PBMCs或全血进行SEB检测(如图所示)。 三维空间 )。与CD8形成对比 + T细胞，对于CD 137信号在CD4上的作用还没有达成共识。 + T细胞 34 。Mcla-145与人CD4共孵育。 + 记忆T细胞用同源抗原重新刺激，以研究其在这个群体中的活性。MCLA-145对干扰素γ和TNFα的释放有促进作用，而urelumab*则无影响。他唑利单抗*治疗可引起干扰素γ和肿瘤坏死因子α水平的升高，但加入urelumab*不能使其进一步升高(图1)。 3E )。这表明mcla-145在CD4中的作用。 + T细胞的回忆反应主要是由于抑制了PD-1通路.
对检查点阻断没有反应的肿瘤通常会被大量的抑制性免疫细胞浸润，特别是T调节细胞(Treg)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，它们可能会抑制免疫反应。 35 ,36 。为了检测MCLA-145是否能克服这些细胞类型的抑制作用，在Tregs或抑制性M2巨噬细胞存在的情况下进行T细胞活化试验(见图)。 3 f、 g )。Tregs对T细胞依赖性干扰素γ和肿瘤坏死因子α分泌的抑制作用分别为79%和69%。MCLA-145能完全克服细胞因子分泌的抑制作用。 3F )。与此形成鲜明对比的是，与urelumab*联合使用，部分克服了Treg对细胞因子分泌的抑制作用。同样，在PBMC：M2巨噬细胞共培养中加入mcla-145可以克服IFNγ的产生对M2巨噬细胞的免疫抑制作用，而阴性对照抗体或urelumab*和atezolizumab*联合培养则不能(图1)。 第三代 )。这些结果共同指出MCLA-145在免疫抑制环境中所起的多功能作用。
MCLA-145在体内外招募和激活T细胞以增强抗肿瘤免疫。 为探讨MCLA-145在治疗相关条件下的活性，对含有肿瘤特异性效应T细胞和Tregs的新鲜肿瘤外植体进行了评价。将5例子宫内膜原发瘤分离成单细胞悬液，用流式细胞术进行细胞计数，或在可溶性抗CD3抗体存在下与MCLA-145或参考抗体共同孵育，以检测γ的产生。CD3% + T细胞，CD4的比例 + 、CD8 + 肿瘤标本间的Treg亚群和IFN-γ生成水平存在异质性(图1)。 4A )。与对照抗体相比，MCLA-145能提高肿瘤标本中干扰素γ的产量，并在较小程度上增加对照抗体的生成。即使在高Treg数的情况下也观察到了这一效应(图1)。 4A )，与我们的体外结果一致(如图所示)。 3F )。就像我们在SEB分析中的观察一样(补充图)。 1C )，少量pd-l1 嗨 髓系和/或肿瘤细胞(附图) 4A )似乎足以驱动MCLA-145激活T细胞和释放细胞因子。
图4：MCLA-145的体内外活性。 a 5例子宫内膜瘤单细胞悬液中T细胞亚群相对比例的顶面板、甜甜圈图、抗体孵育后第6天各肿瘤外植体上清液中干扰素γ水平。误差条：三次复制的平均值±SD，ND=未完成，** p < 0.0001 in Tumor #1 and Tumor #5, *p =0.0018(Neg.Ctrl Ab诉MCLA-145)和 p =0.0042(mcla-145vs.atezolizumab*)；肿瘤#2，** p =0.0007(Neg.Ctrl Ab诉MCLA-145)；肿瘤#4* p =0.0074(mcla-145vs.atezolizumab*)，单因素方差分析和图基检验； b 表达NY-ESO特异性TCR的Ly95 T细胞转染NSG小鼠A 549-pd-L1 嗨 肿瘤和用所指示的抗体治疗，终点数据显示，( n =7只小鼠)； c 叠加直方图，人CD3的百分比 + 各治疗组红细胞溶解(开放棒)和肿瘤(实色棒)后血液中淋巴细胞总数的变化。 b ); d 各治疗组肿瘤中NY-ESO-1特异性T细胞的比例( b )，以CD3+TIL的百分比表示，( n =7，误差条为SEM)，* p < 0.0216 (MCLA-145 vs. Ly95), determined by one-way-ANOVA and Tukey’s test; e 表达NY-ESO特异性TCR的Ly95 T细胞转染NSG小鼠A 549-pd-L1 嗨 或A 549-PD-L1 零 肿瘤和治疗的指示抗体，终点数据显示。( n =9只老鼠)，** p < 0.0018 MCLA-145 treatment (A549-PD-L1嗨 VS A 549-PD-L1 零 单因素方差分析(ANOVA)和图基试验(Tukey‘s test)。 f 人CD 34+移植NSG小鼠移植MDA-MB-231细胞后肿瘤体积的变化及mcla-145或参考抗体(mcla-145)处理后的肿瘤体积n C=每组小鼠9只)。每组小鼠均有肿瘤生长和死亡时间，有两个独立实验的代表性实验，*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.001 of treatment group vs negative control antibody, determined by a two-sided mixed-effects model and Dunnett’s test. g 各治疗组肿瘤中CD8+(上面板)和CD4+(中面板)TIL的比例，以肿瘤细胞总数的百分比表示，以肿瘤细胞总数的百分比表示，以CD11b+细胞(CD11b+细胞)的百分比表达。 n =每组7只老鼠，误差条为平均±SD，* p =0.0492的CD8+T细胞和 p 为pd-l1=0.0014 + 单核细胞，单因素方差分析和图基试验。
采用小鼠异种移植动物模型，对MCLA-145在体内的疗效进行了评价。MCLA-145的结合臂不与PD-L1和CD 137的同源物发生交叉反应，因此采用两种不同的策略对小鼠异种移植模型进行人源化。在第一种模型中，将表达NY-ESO特异性TCR(Ly95)的人T细胞克隆转入人A 549肿瘤免疫缺陷小鼠。NSCLC细胞系A 549在适当的HLA环境中表达NY-ESO抗原 37 并对本研究进行了改进，以稳定表达高水平的PD-L1(补充图)。 4B )。LY 95细胞表达PD-1和CD 137，在实验期结束时肿瘤组织中有较高比例的LY 95双阳性细胞(附图)。 4C )。A 549 pd-L1移植小鼠 嗨 与对照组相比，Urelumab*和atezolizumab单独或与LY 95细胞联合治疗对肿瘤生长无明显影响(图1)。 4B )。所有经MCLA-145处理的小鼠均能控制肿瘤生长(图1)。 4B )。重要的是，mcla-145依赖的肿瘤生长抑制与过继转移的huCD3的不平衡分布明显相关。 + LY 95细胞转化为肿瘤与血液(图1)。 4C 与对照组相比，肿瘤内NY-ESO抗原特异性T细胞增多(图1)。 4D ).
为了进一步探讨MCLA-145活性的上下文依赖性，我们制备了第二个A 549细胞系，其中Pd-L1被敲除(补充图)。 4B )。Mcla-145与a 549 pd-l1共培养时不能激活T细胞。 零 与A 549 pd-l1形成对比 嗨 细胞(附图) 4D )。同样，mcla-145体内处理对a 549 pd-l1无影响。 零 肿瘤大小与对照组比较，并与A 549 pd-L1形成对照。 嗨 肿瘤(如图所示)。 4E ).
为了评价MCLA-145治疗对更多异种T细胞的影响，我们将NSG小鼠植入人CD 34+造血干细胞，然后植入表达人MDA-MB-231的Pd-L1乳腺癌细胞系(图1)。 4F )。在接受对照IgG的动物中，肿瘤在前40天逐渐生长，此后大多数动物观察到更快的生长动力学(图一)。 4F )。CD 137激动剂urelumab*治疗组的肿瘤生长模式与对照组非常相似。在使用彭布鲁克利唑单抗、特唑利单抗或联合使用伊佐利单抗和乌瑞马布*治疗组中，有证据显示某些小鼠肿瘤生长受到控制，但到观察期结束时，所有存活小鼠的肿瘤都迅速生长(图一)。 4F )。相反，所有使用MCLA-145治疗的动物都经历了肿瘤控制，包括两个完整的反应，并且在治疗结束时表现出明显的缓慢生长动力学(图一)。 4F )。10倍低剂量的MCLA-145(0.5mg/kg)对小鼠的肿瘤生长也有类似的抑制作用(图一)。 4F )。与NY-eso模型相一致，对模型中的TILs的分析表明，mcla-145处理可导致CD8的增加。 + 肿瘤中的T细胞。 4G )。令人惊讶的是，与NY-ESO模型一致的是，仅用urelumab*治疗就显着地减少了CD8的数量。 + 与mcla-145相比，肿瘤中的细胞与CD4的增加有关。 + T细胞与pd-L1 + 单核细胞(图1. 4G )。这些结果表明，MCLA-145在体外所观察到的强效T细胞激动剂也在体内转化为Pd-L1依赖的肿瘤控制。
我们还注意到，一些小鼠在彭布鲁克利苏单抗、伊佐利苏单抗或乌瑞尔马布*组和所有小鼠在联合治疗组表现出皱褶的皮毛和皮肤和驼背姿势，在某些情况下与过度减肥相关(补充图4e)，需要安乐死(每组3-5只小鼠)。对照组和MCLA-145组中没有动物表现出压力的迹象(尽管MCLA-145组中有一只动物因不相关的原因而被安乐死)。特别是，我们观察到，Urelumab*和atezolizumab联合治疗比对照组或MCLA-145治疗有明显的毒性(补充图4F)。观察到的毒性的一个可能的解释是移植物与宿主疾病(Gvhd)的加速。 38 。如果属实，MCLA-145小鼠明显缺乏GvHD可能是由于其肿瘤限制的T细胞激动剂所致。
Mcla-145在非人类灵长类动物中有很好的高剂量耐受性。 为了进一步研究安全性，在非人类灵长类动物中对MCLA-145进行了评估.MCLA-145与pd-L1和CD 137的半胱氨酸同源物完全交叉反应(补充图)。 5A , b )，并在全血SEB试验中显示了类似的功能(补充图)。 5C )。在重复剂量研究中，雄性和雌性半裸猴每周接受5次MCLA-145剂量，观察一组动物，观察时间分别为31天(雄性)或32天(雌性)(如图所示)。 5A )。所有剂量的动物都暴露在MCLA-145中。MCLA-145的药代动力学分析显示，剂量成比例的全身暴露符合标准单克隆IgG抗体的PK谱和半衰期(见图)。 5B )。照射量随着剂量的增加而增加--在第1天按剂量比例增加，在第22天按比例增加，这反映了重复给药后较低剂量水平的照射损失(图1)。 5C )。在100 mg/kg/周剂量组，70%的动物在整个治疗期间持续暴露。系统暴露数据与接受低剂量动物的预期抗药物抗体(ADA)效价一致。MCLA-145在所有剂量下均表现出良好的耐受性，最高可达100 mg/kg。没有发现器官重量的变化或任何大体或微观的病理表现。血液化学在所有剂量和时间点都在正常范围内，包括肝脏酶、AST和ALT(如图所示)。 5D )。对中性粒细胞和血小板数等血液学指标无影响(图5)。 5E )。一项对激动剂mAb urelumab临床试验安全性数据的综合回顾指出，转氨酶升高、中性粒细胞减少、血小板减少是最常见的伴随疲劳的严重不良事件。 27 。即使在试验的最高剂量时，也没有观察到这些症状，这比人的最大耐受剂量(0.1mg/kg)高1000倍。肝脏毒性与肝脏中免疫浸润的出现有关。 39 ,40 。肝脏和其他组织的病理检查没有显示任何增加免疫浸润的证据。在车辆和100 mg/kg/周剂量组中，淋巴细胞数量和T细胞亚群都有轻微的波动(图1)。 5F )。总的来说，这些数据表明MCLA-145能够产生有效的T细胞激动剂，导致体内肿瘤生长减少，但似乎没有表现出其他强效CD 137激动剂所观察到的安全责任。
图5：重复剂量非人类灵长类动物研究中MCLA-145的安全性。 a 给出了重复剂量安全性研究的设计方案； b 平均血清MCLA-145浓度在一个周期内测量( n =10只载具动物及100毫克/公斤， n =其他治疗组动物6只)； c 平均最高血清浓度( C 马克斯 )和曲线下面积(AUC)分别为10 mg/kg(蓝)、30 mg/kg(绿)和100 mg/kg(橙)-145，分别在第1次给药后24h和第5次给药后24 h，雄、雌分别测定； n =10只载具动物及100毫克/公斤， n 其他治疗组为6只动物，误差条为平均±SD)； d 血清AST、ALT和ALT的平均浓度 e 研究期间在指定剂量下测定的循环中性粒细胞和血小板的平均数量( n =10只载具动物及100毫克/公斤， n =6只动物为其他治疗组，误差条为SD)。参考均值(男性和女性分别为蓝色和粉红色)和均值+1或−1 SD(分别为男性和女性粗体蓝和粉红色线)； 69 f 循环B数(CD 20) + )、NK(CD 16) + T细胞(CD3) + )与CD4 + 和CD8 + 每周剂量100 mg/kg剂量组或车辆的T细胞数和不同亚群的比例，男女组的平均±SD之和： n =10只动物)。
Mcla-145通过受体聚类以依赖pd-l1的方式激活CD 137。 在没有实验条件下，我们不能证明MCLA-145能够激活CD 137，而不存在Pd-L1在辅助细胞上的表达。为探讨pd-L1表达水平对MCLA-145激动剂活性的影响，采用报告法将Jurkat细胞与不同蛋白水平过表达人Pd-L1的CHO细胞共培养。 6A )或具有不同水平的内源性PD-L1表达的人肿瘤细胞株(如图所示)。 6B )。在这两种情况下，PD-L1在辅助细胞上的表达与MCLA-145介导的CD 137受体激活有直接关系。在这组实验的基础上，我们估计每个细胞需要>5000个pd-L1分子来驱动CD 137受体的聚集和激活。
图6：CD 137和PD-L1的共定位介导CD 137聚集. CD3刺激的Jurkat NFκB-Luc-CD 137的双重诱导作用 a CHO-Pd-L1细胞 b 人肿瘤细胞在MCLA-145浓度增加时内源性表达Pd-L1，括号中的数目表示每个细胞的Pd-L1结合位点，用QIFIKIT分析； c 图示VeraTag法测定CD 137聚类； d CD 137表达活化Jurkat T细胞和pd-L1表达CHO细胞与10g/mL试验抗体共培养，用两种不同的CD 137检测抗体固定并测定CD 137的接近程度； e 图示VeraTag法测定CD 137和Pd-L1邻近性； f 细胞的培养和制备 d )测定pd-L1和CD 137的相对峰值面积；活化CD8+T细胞与CHO-pd-L1共培养时CD 137受体内化的共焦图像。 + 与( g )MCLA-145，( h )urelumab*或( i 阴性对照抗体15 min，核(DAPI)染色(蓝色)，CD8(绿色)，CD 137(洋红)。单平面视图，放大倍数×20(内嵌×63)。数据代表了图6g-i的两个重复实验.
CD 137的天然配体是一种三聚体，在细胞表面与三拷贝CD 137结合，导致CD 137聚集，触发下游信号。激动剂CD 137 mAb同样能够通过聚集受体二聚体来激活CD 137，从而导致受体复合物的快速内化和持续信号传递。 41 。我们进行了受体邻近性分析(RPA)来研究MCLA-145是否诱导CD 137聚集.RPA能够定量表达福尔马林固定的石蜡包埋(Ffpe)组织或细胞中的蛋白表达和二聚。 42 。用这种方法可以直接检测细胞表面靶点的表达，在MCLA-145和对照组的存在下，CD 137和Pd-L1的信号是等价的(补充图)。 6A-c )。在共培养系统中，CD 137在活化的Jurkat细胞上有特异性表达，Pd-L1的检测仅限于CHO-Pd-L1细胞(附图)。 6d-e )。我们首先探讨了T细胞与CHO-Pd-L1细胞共培养的CD 137团簇的存在(图示图)。 6C )。MCLA-145能增强CD 137的聚集(图1)。 6d )。MCLA-145的活性与无交联或辅助细胞的激动剂抗体urelumab*相当(见图)。 1A )。接下来，我们重点介绍了Pd-L1和CD 137的近距离测量(实验设置如图所示)。 6E )。根据已发表的结构，估计MCLA-145的CD 137表位与细胞膜的距离为8-9nm，pd-L1表位的距离为7-8nm，IgG 1的相对Fab臂可达12 nm。因此，mcla-145有望将这两个表面分子纳入近距离检测范围(30-100 nm)。 42 。事实上，pd-L1和CD 137的接近程度只能在用MCLA-145处理的Jurkat细胞和CHO-Pd-L1细胞的共同培养中测量；添加urelumab*和阴性对照抗体可导致上述背景无信号(图1)。 6f )。这些数据表明，MCLA-145的结合使CD 137和Pd-L1向相邻细胞间的接触区迁移，从而导致CD 137聚集。
为了研究mcla-145在pd-l1表达细胞存在下是否触发CD 137的聚集和内化，我们对活化的人原代CD8的共培养物进行了共聚焦成像。 + T细胞与CHO-Pd-L1或CHO-WT细胞(图1)。 6g-i )。在与CHo-pd-l1细胞共培养时，cd 137呈强点状染色，提示受体聚集和内化，在CD8上可见。 + T细胞在MCLA-145作用15 min后(如图所示)。 6g )或urelumab*(图1。 六小时 )，但不是阴性对照抗体(如图所示)。 6I )。在与CHO-WT细胞的共培养中，MCLA-145不能诱导CD 137聚集或内化(补充图)。 6f )。共焦图像的三维显示显示mcla-145激活的CD8。 + 具有点状CD 137染色的T细胞在CHO-pd-L1单层界面上的表达 + 细胞(附图) 6g )。与urelumab*(补充图*)相比，MCLA-145处理的共培养物中CD 137染色明显增强。 六小时 )，与我们的体外功能数据一致。这些数据表明，MCLA-145诱导CD 137聚集的直接证据，导致受体内化，依赖于表达pd-L1的相邻细胞，其阈值高于每个细胞>5000分子。
