促炎细胞因子白细胞介素6和白细胞介素8诱导癌细胞BRD 4蛋白的表达
为了研究炎性细胞因子对大肠癌细胞染色质活性的影响，我们用14种已知参与炎症性肿瘤微环境的重组细胞因子治疗大肠癌细胞株(PDC 1)。1A)。免疫印迹法分析了主要表观基因调节因子的蛋白质水平，包括组蛋白读写者、作者、橡皮和相关组蛋白制造者。1A和S1a)。其中，重组白细胞介素6(RIL 6)和白细胞介素8(RIL 8)对组蛋白读取器蛋白BRD 4的表达有明显的诱导作用，但对其他BET家族成员BRD 2和BRD 3及其他染色质调节因子无明显影响(图5)。S1a)。对两种患者来源的CRC细胞系(PDC 1和PDC 2)的进一步时间历程分析证实，rIL 6或rIL 8最早可在4h内诱导BRD 4的表达，而不影响BRD 2和BRD 3的表达(如图1所示)。1B，c)。值得注意的是，作为IL6/8下游激酶的Janus激酶2(JAK 2)早在BRD 4诱导前2小时就被激活(如图1所示)。1C)，提出JAK 2可能是一个潜在的上游激酶负责BRD 4的诱导。根据这一假设，与JAK 2抑制剂PARITINB共处理可消除rIL 6/8诱导的BRD 4表达(如图所示)。1D)，但这是由蛋白酶体抑制剂MG 132(如图所示)拯救的。1E)。这一发现表明BRD 4表达的增加与蛋白质稳定性的提高有关。事实上，我们发现rIL 6或rIL 8的治疗并没有增加。BRD 4MRNA水平(图1.S1b)。RIL 6/8诱导的BRD 4蛋白在几种商业大肠癌细胞系中的表达也得到证实。1F)。有趣的是，它也出现在其他癌症类型的细胞系中，包括乳腺、肺和前列腺(图1)。S1c)。这些发现表明，IL6/8-诱导BRD 4在人类癌症中是常见且保守的。
图1：IL6和IL8诱导大肠癌BRD 4蛋白表达。a图示研究肿瘤微环境衍生细胞因子及其在CRC表观遗传重构中的作用的筛选策略。b, cPDC 1肿瘤细胞指示蛋白的代表性westernblot分析(英文)b, n=3)和PDC 2(c, n(2)用20 ng/ml rIL 6或20 ng/ml rIL 8治疗后，给予指示时间。d代表性Westernblot分析(n(2)用20 ng/ml rIL 6(20 ng/ml)、20 ng/ml rIL 8或2.5μM紫杉醇(2.5 ng/ml)处理的肿瘤细胞中的指示蛋白。e代表性Westernblot分析(n(2)用20 ng/ml rIL 6、20 ng/ml rIL 8、2.5μM紫杉醇或20μM MG 132处理的肿瘤细胞中的指示蛋白。f代表性Westernblot分析(n(2)5 ng/ml rIL 6或rIL 8处理结肠癌细胞株(HCT 116、HT-29、SW 480)中的指示蛋白。
JAK 2通过磷酸化酪氨酸97和酪氨酸98诱导BRD 4蛋白稳定
为了验证JAK 2对BRD 4的稳定性，我们将标记为BRD 4的293 T细胞与野生型JAK 2(JAK 2-WT)或构成性激活的JAK 2(JAK 2-V617F)共转染293 T细胞，并在蛋白合成抑制剂环己酰亚胺存在下检测BRD 4蛋白的转化率。结果表明，活性JAK2-V617F，而不是JAK2-WT，诱导了旗-BRD 4的显著诱导。2A)。经放线菌酰亚胺处理后，JAK2-V617F诱导的BRD 4随着时间的推移而保持其水平，表明其半衰期延长，而转染JAK2-WT的细胞中的BRD 4则表现出快速降解(图二)。2A和S2A)。我们进一步证实JAK2-V617F，而不是激酶死JAK 2(JAK2-K882R)，也能诱导内源性BRD 4。S2B).
图2：JAK 2在Y97/Y98诱导BRD 4酪氨酸磷酸化，使BRD 4稳定。a代表性Westernblot分析(n(2)转染指示结构的293 T细胞，用50μg/ml环己酰亚胺(CHX)处理后，在不同时间点收获。b代表性Westernblot分析(n(3)用20 ng/ml rIL 6或2.5μM紫杉醇处理的PDC 1细胞中含有抗BRD 4抗体的全细胞裂解液(Wcl)和抗BRD 4抗体的共ip样品。c描述BRD 4功能域和JAK 2预测BRD 4磷酸化位点的方案。由JAK 2预测磷酸化的酪氨酸残基用红色高亮显示。d代表性Westernblot分析(n(3)转染293 T细胞中的指示蛋白与野生型JAK 2、活性JAK2-V617F或非活性JAK2-K882R共同表达所指示的BRD 4突变体。e代表性Westernblot分析(n2)转染293 T细胞表达BRD 4-BD1和BRD4-BD1突变体与野生型JAK 2或活性JAK2-V617F的酪氨酸磷酸化。f代表性Westernblot分析(n转染BRD 4及其突变体与活性JAK2-V617F共转染293 T细胞中指示蛋白的表达。g代表性Westernblot分析(n(2)活性JAK2-V617F或非活性JAK2-K882R在体外激酶分析中磷酸化BRD 4肽(BD1和BD2)。h活性JAK2-V617F对BRD 4肽磷酸化残基的质谱分析。i代表性Westernblot分析(n(3)转染所述结构的293 T细胞产生的抗国旗免疫共沉淀物，然后用活化的JAK2-V617F进行体外激酶试验。j代表性Westernblot分析(n(2)PDC 1细胞经特定细胞因子、紫杉醇和20μM MG 132处理后的WCL。k代表性Westernblot分析(n(2)抗BRD 4抗体免疫共沉淀的SW 480细胞，分别加入细胞因子、紫杉醇和20μMG 132。
为了研究酪氨酸激酶JAK 2是否能磷酸化BRD 4，我们检测了免疫共沉淀后BRD 4上的酪氨酸磷酸化。免疫沉淀的BRD 4在rIL 6处理的细胞中酪氨酸磷酸化增强，而在JAK 2抑制剂紫杉醇处理的细胞中则无明显的酪氨酸磷酸化。2B)，支持BRD 4被IL6-JAK 2信号磷酸化。为了预测jak 2在brd 4上的潜在酪氨酸磷酸化位点，我们使用了基于基团的预测系统。23，这导致了四个酪氨酸残基(Y97，Y98，Y 390和Y 599)的预测，这些残基可能被JAK 2磷酸化(图2所示)。2C)。值得注意的是，Y97/98和Y 390分别位于BD1和BD2的溴域，而BD1和BD2是BRD 4表观遗传读取器活动所必需的。16,17。通过酪氨酸对非磷酸化丙氨酸替代物(Y到A)的诱变分析发现，在BD1中存在Y97/98，而不需要Y 390或Y 599，才能使JAK 2诱导的BRD 4稳定(如图4所示)。二维空间和S2C添加蛋白酶体抑制剂MG 132恢复了BRD4-Y97/98A突变体的稳定性。S2D)。对Y97和Y98的进一步解剖表明，JAK 2诱导BRD 4磷酸化需要两个酪氨酸残基。2E)和稳定(图1.2F)。有趣的是，Y97而不是Y98在BET家族成员中被发现是保守的，包括BRD 2和BRD 3。S2E)。这也许可以解释为什么只有BRD 4才能由活动JAK 2稳定下来。此外，与其他突变体相比，Y97/98A突变体的泛素化水平要高得多。S2f)。相比之下，模拟酪氨酸残基组成磷酸化的酪氨酸到谷氨酸突变体Y97/98e蛋白水平升高，与活性JAK 2诱导的野生型BRD 4相一致。S2g)。与Y97/98A突变体相比，类似荧光粉的Y97/98e突变体的泛素化水平要低得多。S2H)。这些数据共同强调，JAK 2诱导的BRD 4在Y97/98上的磷酸化决定了BRD 4的稳定。
为了证实BRD 4是JAK 2的直接底物，我们接下来进行了体外激酶分析。结果表明，活性JAK 2(V617F)而非激酶死JAK 2(K882R)能诱导BRD4-BD1合成肽强酪氨酸磷酸化，但能轻微磷酸化BRD4-BD2(图1)。2G)。磷酸化BD1结构域肽的质谱分析证实了Y97存在丰富的磷酸化，尽管Y98的磷酸化程度不高(图1)。2H)。然后，我们开发了一种针对BRD 4的Y97/98磷酸化肽的多克隆抗体(图1)。S3A，并证实在体外激酶分析中，荧光粉Y97/98 BRD 4抗体特异性地识别了JAK 2诱导的BD1结构域磷酸化。S3b, c)。荧光粉-Y97/98抗体也能识别野生型BRD 4，但不能识别BRD4-Y97/98A突变体(无花果)。2I和S3D此外，它还检测到rIL 6和rIL 8细胞内内源性BRD 4的磷酸化，而紫杉醇可使其磷酸化程度降低(图1)。2J，k)。综上所述，BRD 4是JAK 2的真正底物，酪氨酸97/98的磷酸化对BRD 4的稳定至关重要。
UCHL 3脱泛素酶与磷酸化BRD 4相互作用和稳定
由于BRD 4稳定性的增强与泛素化的减少有关，我们开始研究去泛素化事件，以使JAK 2介导的BRD 4稳定。为此，我们进行了一个去泛素酶(Dub)文库的筛选，其中泛素化的BRD 4作为底物与一组dub一起孵育，然后用westernblotting测定BRD 4的泛素化水平。S4a)。本实验确定了16个对BRD 4有明显去泛素活性的配子(图4)。3A和S4a)。为了确定哪些配子与crc相关，我们比较了它们在crc和相邻正常对照基因表达数据集中的表达情况。24。我们发现OTUB 2, UCHL 3，和USP 7与正常的癌旁组织相比，高异位表达频率和显着性的癌旁组织是否有较高的高表达率和高表达量？p数值(频率>60%)p值<0.01)3B)。为了确定它们是否参与了BRD 4的调控，我们在rIL 6存在的情况下对这些配音进行了击倒，并与USP 6作为阴性对照DUB 3，此前已证明对BRD 4进行了规范。8。结果表明：UCHL 3基因敲除是降低BRD 4表达的最有效方法。3C和S4B, c)和缩短BRD 4半衰期。S4d, e，这种效果可以通过蛋白酶体抑制剂MG 132治疗来恢复。三维空间和S4F)。泛素化试验一致显示UCHL 3促进BRD 4的泛素化。3E)。我们还表演了UCHL 3当活动JAK 2被过度表达时被击倒。活性JAK 2对BRD 4的诱导作用显著减弱。UCHL 3击倒(图)S4G)。但是，无论是蛋白质水平还是mRNA水平UCHL 3其本身不受JAK 2激活的影响(图1)。S4G, h)。最近有报道称E3连接酶SPOP诱导BRD 4降解。9,10,11。有趣的是，我们发现伴随而来的是SPOP带着UCHL 3救出…的效果UCHL 3BRD 4蛋白的敲除(图1)。S4i)，表明UCHL 3对抗SPOP以保持BRD 4的稳定性。相反，UCHL 3的异位表达延长了BRD 4的半衰期。S4j它也提高了WT BRD 4的蛋白质稳定性，但不增加BRD4-Y97/98A突变体的稳定性。3F)。相反，UCHL 3击倒也废除了JAK 2诱导的BRD 4稳定(图1)。第三代)。值得注意的是，我们的实验是在IL6/8存在的情况下进行的。
图3：JAK 2诱导的BRD 4稳定需要去泛素酶UCHL 3。aBRD 4脱泛素酶的鉴定纯化的未泛素化BRD 4按照制造商的指示(Dub扫描试剂盒，CAT)与指示的去泛素酶孵育。第67-0006-001号)。在此基础上，用westernblot分析BRD 4的泛素化。S4a)。BRD 4泛素与缓冲液孵育后泛素相对强度的定量研究。b热图显示50对CRC及邻近正常黏膜组织中候选双标的高表达频率。c代表性Westernblot分析(n(2)用50 ng/ml rIL 6转染PDC 1和HCT 116细胞的指示蛋白。d代表性Westernblot分析(n(2)在rIL 6(50 ng/ml)作用下，转染20μg/ml MG 132的PDC 1细胞中的指示蛋白。e体外泛素化试验(n(3)在20μM MG 132和50 ng/ml rIL 6存在下，转染指示的siRNA或构建物的293 T细胞的WCL和免疫共沉淀物。f代表性Westernblot分析(n(3)转染FLAG-BRD4或FLAH-BRD4-Y97/98A和HA-UCHL 3的293 T细胞的WCL。g代表性Westernblot分析(n(2)转染siRNAs或siRNAs的293 T细胞中指示蛋白的表达。h代表性Westernblot分析(n(2)转染20μMG 132或2.5μM Pacritinib的293 T细胞经抗HA抗体免疫沉淀后的WCL和免疫共沉淀物。i代表性Westernblot分析(n(2)转染20μMG 132的293 T细胞经抗HA抗体免疫沉淀后的WCL和免疫共沉淀物。j代表性Westernblot分析(n(2)50 ng/ml rIL 6和(或)2.5μM紫杉醇作用于PDC 1细胞的抗BRD 4抗体所致的WCL和免疫共沉淀物。
为了研究UCHL 3是否与BRD 4结合，我们对转染BRD 4的细胞或单独转染的UCHL 3和JAK2-V617F细胞进行了相互免疫共沉淀试验。结果表明，UCHL 3确实与BRD 4相互作用，在JAK2-V617F存在下，UCHL 3明显增强，而PARITinib(无花果)对UCHL 3有抑制作用。3H和S4k)。这表明UCHL 3优先与磷酸化的BRD 4结合。事实上，BRD4-Y97/98A非磷酸化突变体与UCHL 3的相互作用减少，而磷酸化模拟BRD4-Y97/98e的突变体与UCHL 3的相互作用增强。3I和S4l)。进一步的研究还发现，内源性BRD 4与UCHL 3的结合受到rIL 6的增强，而PARITinib(无花果)对此有抑制作用。3J和S4M)。因此，我们证实UCHL 3是JAK 2磷酸化BRD 4的去泛素酶，其在CRC中的过表达可能是维持炎性肿瘤微环境中BRD 4蛋白丰度的机制之一。
Caf分泌的IL6/IL8诱导JAK2-BRD4信号转导增强肿瘤侵袭性
肿瘤相关成纤维细胞(Cafs)是肿瘤微环境中分泌IL6和IL8的主要来源之一。25,26,27。事实上，通过对结直肠癌数据集GSE 39396的分析，我们发现CAFs表达的IL6和IL8水平高于tme中的其他细胞类型，如内皮细胞、免疫细胞和癌细胞。25(无花果)S5)。因此，我们试图用CAFs作为细胞模型来研究CAFs是否通过IL6/IL8分泌在CRC中诱导BRD 4的表达。为此，我们从切除肿瘤中分离出CAFs，并从不同的CRC患者中分离出相邻的正常成纤维细胞(NFS)，进行CAF/CRC共培养实验(图1)。4A)。酶联免疫吸附试验(ELISA)证实，与正常成纤维细胞(NF)和PDC细胞相比，患者源性CAFs分泌的IL6和IL8水平要高得多。4B)。与rIL 6/8相似，CAFs(而非NFS)在PDC 1和PDC 2中诱导BRD 4表达，JAK 2激活，而BRD 2和BRD 3则无表达(图1)。4C)。同样，直接用条件培养液CAF(CM)处理PDC细胞也能诱导BRD 4的表达。4C)。CAF还产生BRD 4 Y97/98磷酸化，而PARITinib则取消了这一磷酸化(图1)。4D), JAK 2击倒(图)4E或IL6和IL8中和抗体。4F)。值得注意的是，同时阻断IL6/IL8似乎是必要的，以保证更有效地消融BRD 4诱导(如图所示)。4F).
图4：癌相关成纤维细胞促进BRD 4磷酸化和稳定，这与CRC患者预后不良有关。a从原始CRC样本和共培养体系中建立PDC、CAFs、NFS的方案。bELISA分析(n(4)指示细胞培养的培养基中所指示的细胞因子。c代表性Westernblot分析(n(2)与CAFs或NFS共培养的患者源性癌细胞(PDC)。d代表性Westernblot分析(n(2)PDC 1细胞经单次培养或与CAFs共培养后所指示的蛋白质含量。细胞经2.5μM紫杉醇处理，20μMG 132处理。e代表性Westernblot分析(n=2)在PDC 1细胞中的指示蛋白JAK 2ShRNAs单独培养或与CAFs共培养。f代表性Westernblot分析(n(3)与CAFs共培养的PDC 1细胞中指示蛋白的含量。用2.5μM IL 6抗体、IL 8抗体或联合处理细胞。g有代表性的图像(左面板)和量化(右面板)，n(3)细胞在三维基质中生长。PDC 1细胞表达Tet on-shRNAs，用普通培养基或添加100 ng/ml多西环素(标尺，100μm)的CaF条件培养基培养。h有代表性的图像(左面板)和量化(右面板)，n(5)侵袭试验中的侵袭性细胞。PDC 1细胞表达Tet on-shRNAs，与100 ng/ml多西环素(标度条，50μm)单独培养或与CAFs共培养。iPJAK 2、pY 97/98-BRD 4和α-SMA在TMAs中的代表性IHC染色。每个TMA核的h评分用Slidepath组织IA软件(Leica Microsystems)测定。(标尺，100μm)。jPY 97/98-BRD 4、pJAK 2与α-SMA表达相关性的免疫组化分析。kPY 97/98-BRD 4、pJAK 2和α-SMA在32例原发和转移性结直肠癌标本中的定量研究。lKaplan−Meier分析248个大肠癌患者(Ⅱ期和Ⅲ期)与单个蛋白(pJAK 2和pY 97/98-BRD 4)的相关性。在……里面b, g，和h，数据表示为至少三个独立实验或生物复制的平均±SEM(误差条)。这个p数值是用双尾皮尔逊氏法确定的。χ2试验j，双尾对数秩(mantel-cox)检验l，和双尾学生的t测试(配对)k，未配对g和h).
我们进一步证明，caf可以促进pdc的生长、入侵和迁移，而pdc可以通过击倒JAK 2或BRD 4(无花果。4G，h，和S6a, b)。IL 6受体中和抗体对pDC细胞和IL 8受体抑制剂亚美辛治疗PDC细胞的上述表型均有不同程度的抑制作用(图1)。S6c–g)。此外，体内实验表明，与单个CRC细胞相比，PDC1或HT-29共植入CAF对异种移植瘤的生长有很强的促进作用(图一)。S6h)，这与免疫组织化学(IHC)检测CAF/CRC衍生异种移植瘤中较高水平的pJAK 2和pBRD 4相一致。S6I).
最后，我们验证了pJAK 2与BRD 4或pRD 4在CRC临床标本中的相关性。我们对由248个具有临床信息的大肠癌组成的组织芯片中的α-sma(caf标记物)、pJAK 2和pbrd 4进行了ihc分析。28(无花果)4I)。正如预期的那样，crc组织中较高的caf浸润(α-sma表达)与pbrd 4(Pearson‘s)显著相关。r=0.418，P < 1.0 × 10−11)(图1.4J)。PJAK 2和pBRD 4之间也有很强的正相关(与Pearson‘sr=0.607，P < 1.0 × 10−15)(图1.4J)。此外，对一组配对的原发性CRC和转移性CRC标本的检测显示，pBRD 4和pJAK 2水平较高，转移性肿瘤的CAF浸润水平高于原发肿瘤(图1)。4K)。这248例CRC患者的无病生存(DFS)分析表明，pJAK 2和pBRD 4的高表达与CRC患者的预后差有关(图一)。4L)。这些数据支持CAF介导的JAK 2-BRD 4在肿瘤微环境中的激活在CRC的进展中起着重要的作用。
CAFs通过IL6/8-JAK2-BRD4级联使BET抑制剂具有抗性。
针对bt家族bt家族的bt抑制剂，包括brd 4，被认为是很有希望的抗癌药物，但包括crc在内的实体肿瘤通常对beti耐药。29,30。先前的研究表明BRD 4水平的升高会导致对Beti的抵抗。8,9,10,11。考虑到CAF诱导BRD 4，我们下一步要确定CAF是否会引起Beti抵抗。为此，我们使用了三种不同的小分子bet抑制剂jq1、mz1和dbet 1，它们都是brd 4的有效抑制剂。13,14,17。虽然三种Beti都能有效地抑制CRC的增殖，但与CAFs的共培养大大降低了它们的作用(图1)。5A)。在体内，单独植入CRC的异种移植瘤对JQ 1有抑制作用，但当CRC与CAFs共同移植时，这一效应减弱(如图所示)。5B)。这些发现支持CAFs在促进CRC对Beti的抵抗方面的作用。与这一假设一致的是，在CRC/CAF共培养物中对Betis的抗药性通过与紫杉醇联合处理而得到了充分的逆转(见图)。5C)。同样，用Tocilizumab和Reparisin阻断IL6/8受体也可以消除对Beti的抗性。5D).
图5：CAFs对BET抑制剂产生抗性，而BET抑制剂可被IL6/8-JAK 2信号传导共同抑制而消除。aPDC1-Luc细胞的细胞活性n=6)和HT-29-Luc细胞(底部，n(3)单独培养或与CAFs共培养，然后用不同浓度的BET抑制剂处理。bNOD/SCID小鼠移植PDC 1或HT-29肿瘤细胞(左)或CAF细胞(右)。肿瘤达100 mm时，小鼠腹腔注射JQ1(100 mg/ml，每日一次)。3。在每个实验中，在不同处理之间使用相同数量的小鼠：pdc 1(n=6)，PDC 1/CAF(n=7)，HT-29(n=10)和HT-29/CAF(n=10)。cPDC1-Luc细胞的细胞活性(左，n=3)，HT-29-Luc细胞(中，n和SW480-Luc细胞(右，n=3)，与CAFs共培养3天，再用指示抑制剂处理3天。dPDC1-Luc细胞的细胞活性(左，n=3)和SW 480-Luc细胞(右，n(3)与CAFs共培养，再用指示抑制剂处理。e免疫缺陷NOD/SCID或裸鼠移植PDC 1肿瘤细胞和CAF细胞。小鼠采用方案1：载体、JQ 1(100 mg/ml)、紫杉醇(100 mg/kg)或联合或方案2：载体、JQ1(100 mg/ml)、Tocilizumab(50 mg/kg)/察利欣(150 mg/kg)，或肿瘤达到100 mm时联合用药。3. (n指示每个组中使用的鼠标数)。f左面板：pJAK 2和pY 97/98-BRD4在代表的HT-29异种移植物中的IHC分析e(鳞片，20μm)。右面板：量化左面板中的pJAK 2和pY 97/98.BRD4(n=每组6例独立异种移植标本)。在……里面a, c，和d，给出了三个独立实验的平均±SEM(误差条)数据。这个p数值是用双尾学生的t测试。NS表示无意义。
此外，在与CRC和CAF共同移植的几种异种移植瘤小鼠模型中，我们发现JQ 1与紫杉醇或Tocilizumab/Reparisin联合使用可显著抑制肿瘤的生长，而JQ 1、紫杉醇或Tocilizumab/Reparisin单独作用不明显(见图)。5E)。该处理对CAFs和IL6、IL8的产生有一定的影响(图5)。S7a, b)。与肿瘤抑制相一致，联合治疗使异种移植瘤的pJAK 2和pBRD 4较单一药物治疗明显降低(图1)。5F)。这些发现表明阻断IL6/8-JAK 2级联可能是克服肿瘤微环境所致Beti耐药性的一种潜在策略。
在Y97/98时BRD 4磷酸化导致与Beti的结合减少而与染色质的结合增加
BRD 4的溴结构域(BD1和BD2)需要识别和结合组蛋白和其他细胞蛋白的乙酰化赖氨酸残基，以发挥其作为染色质调节因子的功能。值得注意的是，以前有报道称Y97位于jq 1的绑定口袋中，这对于jq 1抑制brd 4活性非常重要。16,17。因此，我们的发现提出了一个有趣的可能性，即JAK 2在Y97/98诱导的BRD 4磷酸化可能影响JQ 1与BRD 4的结合，从而导致对JQ 1的抗性。为了检验这一假设，我们进行了NanoBRET报告子分析，其中Jq 1与Nanoluc-brd 4融合蛋白的亲和力可以在细胞系统中用Bret发光示踪剂测量。31。我们发现单独转染Nanoluc-BRD4的293 T细胞与JQ1具有较高的结合活性，与JAK2-V617F共转染的细胞与JQ1的结合活性明显降低(图一)。6A)。此外，与Nanoluc-BRD4相比，转染细胞的Nanoluc-BRD4-Y97/Y98E突变体完全失去与JQ1的结合(图1)。6B)。这些数据表明，JQ 1的结合需要Y97/98，JK 2的磷酸化使其与JQ 1结合。为了进一步巩固这一发现，我们还使用了brd 4降解剂dbet 1，它是一种针对chimera(Protac)版本的蛋白水解，它与brd 4结合并诱导brd 4降解。13。正如预期的那样，虽然dBET 1随着浓度的增加会导致BRD 4的降解，但在与JAK2-V617F共转染的细胞中却没有做到这一点(见图)。6C)。同样，BRD 4磷酸化模拟BRD4-Y97E/Y98E也表现出对dBET 1诱导降解的抗性。6d)。综上所述，使用不同方法的这些发现表明JAK 2诱导的BRD 4磷酸化在Y97/98废除了它与Beti的结合。
图6：Y97/98处BRD 4磷酸化调节其与染色质和BET抑制剂的结合。aNanoBRET法检测JQ1与BRD 4在293 T细胞中的结合能力，转染BRD 4和活性JAK2-V617F或空载体。bNanoBRET法检测JQ 1与BRD 4野生型或BRD4-Y97/98e转染293 T细胞的结合能力。c代表性Westernblot分析(nDBET 1(1.25μM，2.5μM)转染293 T细胞中指示蛋白的表达。d代表性Westernblot分析(n(3)转染标志-BRD 4或标志-BRD4-Y97/98e的293 T细胞中指示蛋白的表达量，然后经dBET 1处理。e纳米BRET™BRD 4/组蛋白H3.3相互作用测定293 T细胞在不同条件下BRD 4与组蛋白H3.3的相互作用。将BRD 4-NanoLuc和组蛋白H3.3-HaloTag分别转染293 T细胞，分别加入或不含活性JAK2-V617F抑制剂。f代表性Westernblot分析(n(2)20 ng/ml rIL 6作用于PDC 1细胞胞浆和细胞核的指示蛋白。g代表性Westernblot分析(n(3)5 0ng/ml rIL 6/8和(或)2.5μM紫杉醇处理PDC 1细胞的WCL、染色质和上清液中所指示的蛋白质。h代表性Westernblot分析(n(2)20 ng/ml rIL 6处理的PDC 1细胞染色质中的指示蛋白，然后用JQ 1处理。在……里面e，数据表示为三个生物复制的平均±SD(误差条)。这个p数值是用双尾学生的t测试。
BRD 4通过与乙酰化组蛋白结合调节染色质活性32。接下来，我们进行了NanoBRET实验，以监测JAK 2激活背景下BRD 4和组蛋白3.3(H3.3)的接近程度。如预期的那样，BRD 4和H3.3之间的相互作用通过竞争结合被JQ1所削弱，而JAK2-V617F则增加了作用(图1)。6E)。在JAK2-V617F存在下，BRD 4-组蛋白3相互作用对JQ 1不再敏感，但被紫杉醇逆转。6E)。有趣的是，细胞分馏分析表明，rIL 6诱导了pJAK 2的核积累。6f)；它还能使pJAK 2、BRD 4和pRD 4在染色质组分中富集，而PARITinib则能使pJAK 2富集(图1)。6g)。此外，虽然JQ 1能够取代染色质中的BRD 4蛋白，但它不能取代染色质中磷酸化的BRD 4(图1)。六小时)。这些数据表明JAK 2诱导BRD 4磷酸化使其与染色质结合，同时减少与JQ 1的结合。这些观察为富含炎性肿瘤微环境的肿瘤的Beti耐药性提供了一个合理的解释。
PBRD 4与STAT 3相互作用增强抑癌活性
为了确定CaF激活的JAK 2-BRD 4信号通路诱导的关键转录程序，我们在与CAF共培养或不加CAF的PDC中进行了转录组分分析，并与紫杉醇、JQ 1或两者联合处理。我们鉴定了371个基因，其表达被CAF上调，但被JQ 1、紫杉醇或两者降低(使用2倍的截止时间，p≤0.0 5)(图1.7A)。与JQ 1和紫杉醇在CRC生长中的联合作用相一致，我们发现该基因集在联合处理时表现出协同下调作用，表明该基因集是由JAK 2和BRD 4协同调控的。不出所料，对上游调控器的巧妙分析显示，STAT 3是这个基因集的顶级上游调控者(图一)。7b)。鉴于STAT 3以前已被证明与其他表观遗传调节剂相关联，以调节染色质的活性。33我们询问STAT 3是否作为JAK 2的转录效应，与BRD 4协同调节染色质活性。因此，我们进行了相互免疫共沉淀，发现pSTAT 3和pBRD 4在rIL 6/8处理的PDC细胞中有稳定的相互作用，而pSTAT 3和pBRD 4之间有稳定的相互作用。7C)。提示IL 6/8激活的STAT 3与pBRD 4协同调节染色质活性。
图7：BRD 4磷酸化促进与pSTAT 3的相互作用，诱导染色质重新编程，增强致癌活性。a热图显示371个基因被上调(超过2倍，p < 0.05) by coculture with CAF in PDC1, but suppressed (more than 2 folds, p < 0.05) by combination of pacritinib and JQ1. b371个基因的IPA上游调控子分析a显示前5种转录因子。上游最高调整器用红色突出显示。c代表性Westernblot分析(n(2)50 ng/ml rIL 6/8和(或)2.5μM紫杉醇和20μMG 132作用于PDC 1细胞的抗BRD 4或抗STAT 3抗体的WCL和免疫共沉淀物。d–gH3K27ac的染色质结合位置重叠(左面板)、平均强度曲线(中间面板)和热图(右面板)芯片-seq读取(rpkm；每百万个映射读取的每千字节读取)d)，BRD 4(e)，pBRD 4(f)，以及pSTAT 3(gRIL 6/8治疗前后PDC 1细胞采用片-seq进行治疗。h–jBRD 4芯片读出的平均强度曲线(h)，pBRD 4(i)，以及pSTAT 3(j在rIL 6/8处理前后的PDC 1细胞中，在超增强子(左面板)和典型增强子(右面板)上，基于芯片seq。kVenn图显示了rIL 6/8作用于PDC 1细胞中H3K27ac、BRD 4、pBRD 4和pSTAT 3在染色质上的重叠基因。共鉴定出176个常见基因。l176种常见基因芯片-seq平均强度曲线k对于H3K27ac，BRD 4，pBRD 4和pSTAT 3。mCXCL 1、CXCL 2和MYC位点BRD 4、pBRD 4、pSTAT 3和H3K27ac归一化芯片-seq信号的基因组浏览器观察和rIL 6/8处理的PDC 1细胞。nQRT-PCR分析(n(2)在单培养或共培养条件下，用指示的化学物质处理PDC 1细胞中的指示基因。数据表示为技术三项的平均±SEM(误差条)。
已知brd 4与基因增强子和超增强子结合以调节基因的表达。34,35。为了了解BRD 4和pSTAT 3在染色质水平上的相互关系，我们对rIL 6/8处理的PDC细胞中的总BRD 4、pRD 4、pSTAT 3和活性增强子标记H3K27ac进行了染色质免疫共沉淀(芯片-seq)，虽然rIL 6/8不能诱导H3K27ac标记的芯片-seq信号(见图)。7D)，可显著增加pBRD 4和pSTAT 3与染色质的结合。相反，与染色质结合的BRD 4总量变化不大(如图所示)。7e-g)。这表明，pBRD 4和pSTAT 3对IL6和IL8信号的响应对BRD 4的染色质活性有明显的调节作用。
我们进一步研究了rIL 6/8对典型增强子和超增强子的响应。36(无花果)S8a)。类似于整个H3K27AC信号(图)。7DRIL 6/8治疗似乎没有引起总超促进剂和典型促进剂的明显变化(图1)。S8a, b)。然而，rIL 6/8处理引起的超增强剂或典型的增强子信号被pBRD 4、pSTAT 3结合，但BRD 4的作用程度较小(如图4所示)。7H-j)。进一步的分析发现，在rIL 6/8的作用下，BRD 4、pBRD 4、pSTAT 3和H3K27ac共同调控了176个位点，提示一组由BRD 4、pBRD 4和pSTAT 3同时调控的增强剂(图3)。7K)。相关基因的信号分布分析表明，虽然BRD 4似乎主要与这些基因的启动子区结合，但pBRD 4和pSTAT 3与基因体的增强子有广泛的结合(图一)。7L和S8c)。有趣的是，几个著名的癌基因与侵袭性和转移性癌症表型相关，包括CXCL 1, CXCL 2, MYC，和Bmp4表明BRD 4和STAT 3可以协同调节肿瘤的促癌活性，促进肿瘤的进展。值得注意的是，这些癌基因被扩展的增强子簇占据，显示H3K27ac、pBRD 4和pSTAT 3峰横跨基因体，而BRD 4则更多地出现在启动子区域(图1)。7米).
因此，这些发现表明，旁分泌炎症信号促进了pBRD 4和pSTAT 3的相互作用，从而增强了增强子的活性，使其具有更强的致癌转录活性。与此相一致的是，RT-PCR验证了其中几个癌基因的表达，表明CAFs诱导了它们的表达，这需要联合使用JQ 1和紫杉醇来消除它们的表达(图一)。7N)有效。芯片-qPCR分析表明pBRD 4与CXCL 1, CXCL 2, MYC与BRD 4相比，JQ1对JQ1的抗性更强，JQ1和PARITinib的结合大大降低了两者的结合(图1)。S8d)。综上所述，这些数据表明肿瘤微环境提供了一种机制来促进pBRD 4和pSTAT 3的结合，从而增加促癌基因转录的活性，并且需要一种共同靶向策略来废除或恢复这一过程。
