CD 19和CD 22双重靶向治疗复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的CAR T细胞1期试验

针对CD 19或CD 22的嵌合抗原受体(CAR)T细胞在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中表现出明显的活性。治疗失败的主要原因是抗原调节下调或丢失。双重抗原靶向可以潜在地阻止这一现象，但针对CD 19和CD 22的CAR T细胞的临床安全性和有效性尚不清楚。我们对复发性或难治性Ball的儿童和青年患者进行了一期试验(n15)检测AUTO 3，自体转导T细胞同时表达抗CD 19和抗CD 22 CARS(爱米莉亚试验，EUDRA CT 2016-004680-39)。主要终点是3~5级毒性在剂量限制期的发生率和剂量限制毒性的发生频率。次要终点包括形态学缓解率(完全缓解或完全反应，骨髓恢复不完全)，残余疾病-阴性反应最小，不良事件的发生频率和严重程度，AUTO 3的扩展和持续时间，B细胞发育不全时间，以及总体和无事件生存。达到了研究的终点。AUTO 3显示了良好的安全性，没有剂量限制毒性，或与AUTO 3相关的严重细胞因子释放综合征或神经毒性报告。治疗后1个月，缓解率为86%(13/15例)。1年总生存率为60%，无事件生存率为32%。复发可能是由于有限的长期AUTO 3持久性。提高CAR T细胞持久性的策略是充分发挥B-ALL双重靶向CAR T细胞治疗的潜力。

CD 19和CD 22嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗复发性或难治性B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)具有良好的疗效。然而，CD 19阴性复发是抗CD 19 car T细胞治疗失败的主要原因，在25-42%的有反应患者中发生。1,2。同样，在抗CD 22 car T细胞治疗的第一阶段研究中观察到复发时CD 22抗原密度降低，表明CD 22下调也有可能逃脱。3,4。我们认为双抗原靶向可以防止复发，因为单个白血病干细胞不太可能同时下调CD 19和CD 22。双重的CAR靶向可以通过不同的方式实现：两种不同的CAR T细胞产品(CD 19 CAR T细胞和CD 22 CAR T细胞)的协同给药，T细胞与编码这两种不同CARS的载体的共转导，T细胞与编码两种CAR的双顺反子载体的转导，或使用串联CAR。最优策略尚未确定：每个策略都有其优点和弱点，目前都在调查之中。5,6,7。虽然协同给药或共转导允许两个单一的靶向载体结合在一起，且优化最小，但它导致了一个异质混合产品，其制造过程更加复杂和昂贵。相反，编码这两辆车的双顺反子向量和串联式汽车的制造成本更低，并能产生更加统一的同质产品，从而确保每个传感器单元都有能力同时攻击两个目标。

我们开发了AUTO 3，一种通过自身T细胞与编码人源化抗CD 19和CD 22 CARS的双顺反子γ逆转录病毒转导产生双重特异性的CAR T细胞治疗。这两种CARS都采用第二代格式，并包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)共刺激结构域.通过从软骨寡聚基质蛋白(COMP)中加入一种五聚螺旋线圈间隔物(COMP)，进一步增强了CD 22的功能。临床前实验证实了AUTO 3在CD 19 CAR上对双阳性和单阳性靶标的杀伤能力，并与FMC 63结合剂在组织学中的应用进行了比较。

根据临床前资料的结果，我们设计了一个第一阶段的临床研究，与AUTO 3的儿童和年轻人的复发或难治性B-谱系所有(阿米莉亚试验；NCT 03289455，EUDRA CT 2016-004680-39)。在这里，我们报告了与AUTO 3的临床前实验，以及这一阶段临床试验的安全性和有效性结果。

AUTO3CAR T细胞对CD 19和CD 22的识别作用

AUTO 3是通过自身T细胞与rd 114假型双顺反子γ逆转录病毒载体的转导而产生的双重CAR T细胞治疗，该逆转录病毒载体编码CD 19和CD 22 CAR，由自切2A肽分离，转录自单个启动子(如图1所示)。1A)。CD 19结合部分来源于HD 37抗体，针对的是与包括FMC 63在内的其他CD 19结合抗体共有的蛋白上的一个显性表位；CD 22结合部分来自LT22抗体，针对Ig样C2型5结构域(扩展数据图)。1A)。为了降低AUTO 3产物的免疫原性，CD 19和CD 22结合剂在维持与亲代鼠结合剂相似的生物物理特性的过程中被人性化(扩展数据图)。1B，c).

a，AUTO 3是一个双CD 19和CD 22 CAR T细胞，编码在同一启动子下的单双顺反子γ-逆转录病毒载体上。正如流式细胞仪所示，这两个CAR由一个允许平等表达的自切2A肽分离。NT，没有换能器。b、T细胞与NT(左)、CD 19共培养72h的细胞毒作用+(中间)或CD 22+(右)SUT 1目标以1：1的效应器：目标(E：T)比。数据被标准化为NT T细胞(n=4个生物独立样本)。c比较AUTO 3和FMC 63 CAR对Raji肿瘤细胞的杀伤作用。(左)AUTO 3和FMC 63 CAR T细胞与Raji共培养24h，按1：1的E：T比(n=4个生物独立样本)。(右)1：1E：T对WT Raji和CD19KO Raji细胞混合靶点的细胞毒作用72h(n=3个生物独立样本)。b,c，水平线代表来自健康个体捐献者的数据点的中位数。****P < 0.0001, ***P=0.0001，单因素方差分析(ANOVA)与邓尼特后特别检验进行多重比较.d，5×10处理后，AUTO 3在Nalm 6 NSG小鼠模型中的体内效应6汽车T细胞。生物发光成像。(左)CAR T细胞治疗后15d肿瘤植入动力学的总通量照度n=5辆快速消费品63车和AUTO3n=3只NT，生物独立动物)。***P=0.0006，*P=0.0437，所有6个时间点FMC 63和AUTO3之间的双向方差与Bonferroni校正.(右)CAR治疗后第6天骨髓CAR T细胞百分比(n=5种生物独立动物)。水平线代表中间线。P=0.260(NS，无显着性)，未配对t-测试。e，AUTO 3在CD19KO Nalm 6 NSG模型中5×10治疗后的体内疗效6汽车T细胞。(左)肿瘤植入动力学超过15d(n=5种生物独立动物)。****P < 0.0001, *P=0.0304，所有6个时间点FMC 63和AUTO3之间的双向方差与Bonferroni校正.(右)骨髓中的CAR T细胞在第15天(n=5种生物独立动物)。水平线代表中间线。*P=0.0216，未配对t-测试。

全尺寸图像

与CD 28共刺激结构域相比，tnfr共刺激域的使用是基于其维持car T细胞植入的能力。8,9。CD 19轿车包含一个OX 40共刺激域，CD 22轿车包含一个41BB域(如图所示)。1A)。OX 40具有与41BB类似的免疫功能(参考文献)。10)并利用类似的下游tnfr相关因子(Traf)信号分子。11,12。对编码OX 40或41BB共刺激域的CD 19 CARS进行比较，发现OX 40和41BB的活化基因表达谱与CD 28编码CAR相比，具有同等的功能和上调作用(扩展数据图)。2).

为了增强CD 22的靶向性，CD 22 CAR将COMP中的五聚线圈域用作汽车间隔器，从而提高了对CD 22(扩展数据图)的敏感性。3A)。AUTO 3的功能测试显示，表达CD 19或CD 22的工程细胞系受到特异性杀伤。1B)。在模拟Burkitt淋巴瘤细胞株CD 19抗原逃逸的体外实验中，AUTO 3能够有效地杀伤、诱导干扰素-γ分泌，并对CD 19产生增殖作用。−/CD 22+拉吉目标(扩展数据图)3B).

AUTO 3相对于FMC 63型轿车的优越性

当将AUTO 3与CD 19 fmc 63基41bb-Z汽车进行比较时，AUTO 3对CD 19的细胞毒性增强。+/CD 22+Raji细胞体外共培养(P=0.0001，图1。1C)。当细胞毒性试验时，CD 19的比例增加−/CD 22+目标：表达fmc 63的cd 19 car的car T细胞的细胞毒性逐渐降低，而由同一供体产生的auto 3对这两种CD 19均有很强的杀伤作用。+和CD 19−拉吉目标(图1.1C)。NOD/SCID/ɣ(NSG)小鼠CD 19+/CD 22+肿瘤模型，AUTO 3在FMC 63 CAR上显示了更好的疗效，其在骨髓中的持续存在是相当的(见图)。1D)。此外，这种优越的疗效保持在较低，次优剂量的CAR T细胞(扩展数据图)。4)。在一个重新描述CD 19(CD 19)损失的模型中−/CD 22+与FMC 63 CAR相比，AUTO3CAR T细胞能够抑制肿瘤生长，减轻肿瘤负担，骨髓CAR T细胞持久性高于FMC 63 CAR，与非转导T细胞相比无明显改善(图1)。1E以及扩展数据图。4).

第1阶段试验，AUTO3

在阿米莉亚试验的剂量发现部分，在2017年7月28日至2019年6月10日期间，三个英国中心登记了患有复发或难治性B-ALL(1-24岁)的儿童或青年患者。虽然最初计划，成人队列(25岁的≥)没有启动。最初的研究设计包括在儿童和年轻的成年患者群体中的第二阶段扩展队列，以进一步评估AUTO 3的有效性。2019年6月的一项研究修正案包括了成人患者的第1阶段(在儿童和青年患者中宣布的最高剂量水平)。研究结束发生在剂量上升阶段结束之前。方法一节概述了研究设计和资格标准。

本研究的主要终点是剂量限制毒性(DLT)期(AUTO 3输注后30d)3~5级毒性发生率和DLTS频率。继发终点包括：获得形态学缓解(完全缓解或完全反应，骨髓恢复不完全)的患者比例和AUTO 3输注后出现微小残留病(MRD)阴性反应的患者比例，以及不良事件发生的频率和严重程度、AUTO 3的扩展和持续时间、B细胞发育不全时间、总体和无事件生存。

共筛查23例，20例患者中19例(95%)产生一种产物，15例接受AUTO3输注(图3)。2)。随访时间为2020年6月1日数据中断，随访时间中位数为14个月(范围2~28个月)。中位年龄为8岁(范围4~16岁)，既往治疗线数中位数为2(范围1~4)。1例患者曾接受CD 19 CAR T细胞及盲瘤抗肿瘤治疗，其余14例为CAR T细胞幼稚。15例患者中有7例在异基因干细胞移植后复发，7例和8例分别被认为有高风险的第一次复发和第二次或更大的复发(图一)。3)。AUTO3CAR T细胞是在CliniMACS Prodigy上采用半自动工艺制造的.中位转导效率为17.7%(范围8.6~39.3%)，中间载体拷贝数为0.55个/细胞(0.26~1.46个/细胞)。AUTO 3主要表现为效应记忆表型，大多数患者的中枢记忆细胞贡献较小，耗竭标记物表达较低(扩展数据图)。5).

a,b，配偶流程图(a)和每个接受AUTO3治疗的患者的总AUTO3剂量和时间表(单一剂量和分割剂量)(b)。在20例接受白血球摘除术的患者中，15例因2例死亡而接受AUTO 3治疗，2例在任何研究治疗开始前因进展性疾病停止治疗，1例AUTO 3最终产品未通过质量控制释放(†(分类为制造故障)。15例患者中12例一次性滴注CAR T细胞。三名病人接受了分割的剂量。1例患者的剂量在d0和d3之间，2例患者的剂量在d0和d5之间，靶剂量为1×10。6，3×106和5×106每公斤细胞数。有三个异常值：病人001共收到0.3×106细胞每公斤，因为第一次剂量后发生了严重的副作用(脑病)，使他无法接受0.7×10的第二次剂量6每公斤细胞；病人003被登记在1×106每千克细胞和2×10细胞6每公斤制造细胞，但3×106每千克细胞在给药时被打开，因此他得到了可用的全部剂量(2×10)。6每公斤细胞数)；患者022白细胞分离产物差(70%以上)，Autolus可生产4.3×10。6每公斤细胞。F，女性；m，男性。

全尺寸图像

白血病疾病负担在淋巴消耗开始前一天进行评估。造血干细胞移植。

全尺寸图像

在淋巴滤过之前，14例可评价的形态学骨髓检查中，8例有形态复发(5~90%)，6例有MRD水平的疾病。15例患者均无伴髓外疾病。根据该方案，所有15名患者均接受了30 mg m的预适应。−2 d−1氟达拉滨4d和500 mg m−2 d−1在AUTO3输注前，环磷酰胺持续2d。本研究设计为剂量递增：4例患者接受0.3-2×10。6小汽车+T细胞/kg体重，5只接受3×106每公斤和六个细胞接受4.3-5×106每公斤细胞数(图1.2B)。大剂量队列(10×10)6(每公斤体重的细胞)未启动。为了减轻高疾病负担患者的严重毒性风险，并根据骨髓中白血病负荷在淋巴耗竭前一天(d−7)，将CAR T细胞作为单个剂量(<25%爆炸)或以分裂剂量(≥25%爆炸)注入。

毒性轻微的AUTO 3耐受性

在剂量上升到5×10期间615例中有9例(60%)出现3~5级细胞毒性，未见DLTs。DLTS的频率是试验的主要终点。未达到最大耐受剂量。15例患者中有12例(80%)出现细胞因子释放综合征(CRS)，中位时间为3d(范围1~12d)。CRS在所有病例中都是轻微的(1级，n =11例，2级，n =1例患者经Lee等人评定。13标准)。未观察到3~4级CRS。4C)。只有两名病人接受了托西利单抗治疗，没有病人因CRS(扩展数据图)而需要入院治疗。6)。与无严重CRS相一致，血清白细胞介素(IL)-6、IL-10、IFN-γ和肿瘤坏死因子-α水平升高不明显(图二)。4B)与报道的数据进行比较。14。4例患者均有AUTO3相关神经毒性，均为1级，症状包括头痛、感觉障碍、失语症和幻觉(图1)。4C以及扩展数据图。7A)。单次剂量0.3×10后6d 1例发生3级脑病1例6每公斤AUTO 3细胞，这可能与鞘内注射甲氨蝶呤有关。CAR T细胞输注前出现的神经症状，CRS症状完全没有，促炎细胞因子水平极低，以及非典型治疗相关白质脑病在磁共振成像上的额外表现，表明这不太可能是与汽车相关的神经毒性(扩展数据图g)。7b).

a对所有可评价的外周血样本进行CAR T细胞标记。输注后前90d用实时聚合酶链反应(左)检测每μg基因组DNA拷贝数，滴注后前30d用抗CD 19 CAR抗独特型作为CAR T细胞进行流式细胞仪标记(右)。b所有患者在CAR T细胞输注后的前30d血清细胞因子。c、免疫毒性和报告的细胞毒性事件报告后30d内注入AUTO 3。

全尺寸图像

15例患者中有9例(60%)在第30天出现3-4级毒性反应，包括发热(n=7例)，发热性中性粒细胞减少(n=4例中性粒细胞减少症(n=2名病人)，贫血(n=2例)，血小板减少症(n=1名病人)和感染(n=2例)。未观察到因不良事件造成的死亡。总的来说，最常见的3-4级治疗-紧急不良事件(在AUTO 3输注后的任何时候)是中性粒细胞减少(15例患者中有9例)、发热(15例中有7例)、发热性中性粒细胞减少(15例中有6例)、贫血(15例中有6例)和血小板减少(15例中有5例)。3级感染发生率为27%(15例中有4例)，未见4级感染报告。安全摘要、治疗不良事件和严重不良事件在扩展数据图中给出。8.

具有有限长期持久性的AUTO 3的扩展

实质性外周CAR T细胞扩张(最大浓度(C))马克斯15例患者中有10例(66%)检出>30,000份/g DNA)(图1)。4A)，最大扩展时间为12d(范围为7-15d)，曲线下平均面积(从d0到d28)。D0-28)每克DNA复制422,427份。在13例完全缓解或完全反应且骨髓不完全恢复的患者中，AUTO 3的初始扩张动力学与先前描述的体核亮氨酸相似。2(平均C马克斯，每μgDNA 46,717份与36,100份；D0-28分别对AUTO 3和tisagenlecleucel有反应的患者的每μgDNA拷贝数为453,477份和315,000份(扩展数据图)。9B)。两例无反应患者的CAR T细胞扩增情况较差.

就AUTO 3的持续性而言，队列2的患者(即AUTO 3剂量为3×10)6Car T细胞持续时间中位数(344 d；范围63~539 d)明显长于接受0.3~2×10细胞的患者。6每公斤细胞(中位数42天；范围20至257天)或接受4.3至5×10的病人6细胞每公斤(中位数，28天；范围，19-571天)(扩展数据图。9B)。在接受最高剂量的患者的扩张高峰时，PD1在CAR T细胞上的表达极小，表明衰竭并不是这个队列中持续不良的指标(扩展数据图)。10)。此外，对CAR T细胞记忆表型的后专案分析表明，最高剂量组为4.3-5×10。6每千克细胞中CD4-和CD8-幼稚细胞水平较低(中位数分别为0.94%和3.35%；范围分别为0.43%-3.2%和1.11-4.67%)(扩展数据图)。5)，这可能导致这个剂量组缺乏持久性。

值得注意的是，6例患者的CAR T细胞持续时间较长，其中至少5%为CD4-和CD8-幼稚细胞(中位数160 d；范围20~539 d)，6例患者中有3例持续时间超过6个月。与此形成对照的是，6例患者中只有1例接受了<5%CD4-和CD8-幼稚细胞的产品，其持续时间超过6个月。总的来说，在有反应的病人中，AUTO 3的持续时间低于Eliana研究中报道的组织凝集素的持续时间。1(血液中最后一次检测的中位时间(T))最后的分别为119天和168天)。

复发和缺乏CAR T细胞持久性

术后1个月，15例患者中13例(86%)骨髓恢复不完全或完全缓解。完全分子缓解率(<10)−4用聚合酶链反应(PCR)检测白血病特异性免疫球蛋白重排(IgH)，1个月为80%(12/15)，2个月为86%(13/15)。这包括在淋巴衰竭开始前CD 19阴性的7名患者。两名患者对治疗没有反应(见图)。5A)。13例完全缓解的患者中有9例复发(其中1例中枢神经系统(CNS)复发，骨髓MRD水平较低)，3例在完全缓解时接受了新的治疗(包括1例在完全分子缓解期间接受了巩固造血干细胞移植)，1例在AUTO3输注后18个月维持了完全的分子反应，未进行任何额外治疗(图3)。5A).

a、游泳者图显示个别患者注射AUTO 3后的反应、qPCR阴性反应的时间和反应持续时间。CR，完全响应。b、细胞形态和分子无事件生存(EFS)的Kaplan-Meier曲线。n=15)。形态EFS，无反应，形态学复发，或因任何原因死亡(以先发生者为准)；分子esf，无反应，形态复发，qPCR上的分子复发(≥10)。−4或因任何因由而死亡(以先发生者为准)。蓝色填充的恒星和红色填充的圆圈代表了经过审查的观测结果。c、Kaplan-Meier曲线，所有患者的总生存期(n=15)。蓝色填充的恒星代表了经过审查的观测结果。d流式细胞术检测白血病细胞表面CD 19和CD 22的表达密度(−7，淋巴耗竭前一天)，流式细胞术检测细胞表面CD 19和CD 22的表达密度。根据CD 45、CD3、CD 19、CD 20、CD 22、CD 10、CD 34、CD 73和CD 66的表达检测白血病细胞。以每细胞结合抗体作为抗原(Ag/细胞)的代用品，以BD型定量藻红蛋白珠为参照，计算CD 19和CD 22的密度。CD 19或CD 22平均荧光强度(MFI)低于2倍的细胞，T细胞上CD 19或CD 22的MFI或同型对照的CD 19或CD 22均为阴性。在有骨髓样本的情况下，在分子或形态学复发时测定正常B细胞在骨髓样本中的百分比。在分子或形态学复发时测定外周血中每μg的载体拷贝数，定义为在qPCR上检测到CAR T细胞的最后一次，或最后一次检测到零拷贝的CAR T细胞。B细胞恢复为正常B细胞≥，占骨髓淋巴细胞总数的0.1%。病人07例合并CD 19−CD 22+和CD 19+CD 22+每个群体分别进行抗原密度分析。15例复发的CNS病及极低水平的骨髓MRD(10例)−5(用qPCR法测定)。不，没有数据。

全尺寸图像

3例患者在复发时发现CD 19丢失。这包括在研究开始时患有CD 19阳性和CD 19阴性疾病的患者7；特别是在复发时CD 22也丢失了。患者11还复发CD 19阴性疾病，持续的CAR T细胞持久性>1,000拷贝每μg和B细胞发育不全。复发时CD 22抗原密度降低。与此形成对照的是，17例患者复发为CD 19阴性疾病，伴有低水平的CAR T细胞持续存在和B细胞恢复.在这种情况下，没有下降的CD 22密度(图)。5D).

截止截止日期，15名患者中有6名(40%)还活着。治疗6个月时总生存率为80%，12个月时总生存率为60%，接受≥3×10者的总生存率分别为90%和70%。6每千克AUTO3细胞(被认为是活性剂量)。使用Eliana研究标准定义的无事件生存率。1自AUTO 3注射至无反应、形态复发或死亡(以较早发生者为准)的时间，6个月和12个月分别为48%和32%(活动剂量的汽车天真组分别为57%和46%)。5B，c)。使用更严格的标准13在将事件定义为分子复发或死亡的情况下，分子事件在6个月和12个月时的无事件生存率分别为38%和23%(在具有活性剂量的汽车天真组中分别为58%和35%)。5B).

由于最大剂量为5×10的AUTO 3的持久性有限6儿童和青年队列剂量上升阶段的每公斤细胞以及高剂量与CAR T细胞持久性之间缺乏相关性，剂量水平为10×106未对每公斤细胞进行测试，也未启动成年队列。

在本研究中，我们证明了双顺反子CAR T细胞疗法(AUTO 3)对复发性或难治性B细胞ALL的儿童和青年患者进行CD 19和CD 22双重靶向治疗的可行性。我们的数据显示，没有证据表明双重抗原靶向增加了毒性，尽管14名患者中有8名接受了坦率的形态学复发治疗。与此相一致，我们发现少数患者的IFN-γ、IL-6和TNF-α水平仅略高于FMC 63 CD 19 CAR T细胞治疗。重要的是，在接受单剂量或分割剂量AUTO 3的患者中，安全状况是一致的，这与骨髓肿瘤负担或患者的临床状况无关。虽然接受单次治疗的病人样本较少(n=12名病人)和分次给药(n(3名患者)这两种剂量方案之间的比较非常困难，我们的数据并不表明AUTO 3分馏剂量可以防止CAR T细胞相关的不良事件的发生。然而，需要有更大样本的研究来证实这一点。

虽然较高的剂量水平为10×106未检测每公斤细胞，5×106每公斤剂量的细胞数与≤50公斤体重的复发或难治性B细胞的最大剂量范围相似。虽然我们的研究使用了Lee等人。比例尺13为CRS评分，而Eliana试验采用宾夕法尼亚大学量表15(这使得两项试验难以进行比较)，如果我们在阿米莉亚研究中应用宾西法尼亚大学量表，只有一名接受AUTO 3级CRS治疗的患者出现了CRS，而在Eliana研究中175例患者中有16例出现3级CRS，19例出现4级CRS。同样，在Eliana试验中，75名接受治疗的患者中，10名患者没有出现3级AUTO3相关的神经毒性。1中位CAR T细胞剂量中位数为3.1×106每公斤(射程0.2×10)6-5.4×106(每公斤细胞数)，表明AUTO 3具有良好的安全性。

15名接受治疗的患者中有13名对治疗有反应，不论疾病负担、细胞遗传学危险因素或先前治疗项目的数目。在所有剂量组中观察到高完全分子反应率，类似于组织凝集素的反应。值得注意的是，有5.5%CD 19的病人7−CD 22+在淋巴耗竭前发生爆炸，达到分子完全反应，显示CD 22 CAR的活性。

9名病人最终复发。其中8例复发时有较低的CAR T细胞(每μg<1,000拷贝)，5例骨髓抽吸液中有可检测到的正常B细胞。这表明治疗失败的主要原因是缺乏足够的长期CAR T细胞持久性。然而，观察到CAR T细胞调节靶抗原的迹象。例如，一位在治疗中患有CD 19阳性和阴性的患者复发了CD 19-和CD 22-双阴性疾病，这表明CD 19阴性亚克隆不足以生长，然后调节CD 22的表达。尽管每μg和B细胞发育不全有>1,000个CAR T拷贝，但仍有一个患者复发。该患者复发时CD 19阴性，CD 22表达减弱，如CD 22 car T细胞治疗后所述。3,4。因此，在未来的研究中，可能需要对CD 22汽车识别低抗原密度目标进行优化，以提高双特异性CARS的有效性。另有1例CD 19阴性疾病复发，CD 22表达无明显变化。在这种情况下，随着正常B细胞的回归，CAR T的持久性很低，这可能是由于CAR T细胞丢失而切断了进化的抗原逃逸。

在我们的研究中，AUTO 3的持久性降低的原因还没有完全确定。免疫排斥是不可能的，鉴于人性化的结合域和深刻的B细胞发育不全观察后，CAR T细胞治疗。此外，在硅分析预测免疫原性下降时，与结合域使用的组织-亮氨酸(扩展数据图)。1C)。由于不能在随后的时间点用流式细胞仪检测CAR T细胞，因此无法评估双重信号是否导致CAR T细胞衰竭。然而，定量PCR(QPCR)上所见的CAR T细胞的完全丢失，在9例患者中有4例表示反对，而且输注的产品没有一种精疲力竭的表型。我们认为AUTO 3在体内的有限持久性可能反映了大多数患者对该产品的分化表型(扩展数据图)。5)，这可能反过来反映所使用的制造方法。两种小鼠研究的数据16人T细胞过继转移后的整合位点分析17提示长期持续的T细胞主要来源于干细胞样记忆T细胞(T细胞)。供应链管理)和中央记忆T细胞(T细胞)厘米)注入产品的隔间。我们自己的数据表明，在CAR T细胞治疗后，这也可能是正确的。18.

在其他涉及CARS双CD 19和CD 22抗原靶向的方法中，也观察到缺乏长期的CAR T细胞持久性。在王等人的著作中。5联合应用CD 19和CD 22 car T细胞的研究，这两个细胞群的持续时间都很短(B细胞血球恢复的中位时间，4个月)，与此相一致的是，24例复发中有23例有CD 19复发。+CD 22+疾病，导致1年无进展生存率(52.9%)，类似于单用组织化学试剂。19。同样，西雅图儿童和青少年白血病过继治疗(PAAT)-05研究的早期数据也是如此。20与编码CD 19和CD 22 CARS的慢病毒载体共转导的T细胞和斯坦福-国家癌症研究所的研究7使用CD19-C22串联CAR表明，有限的CAR T细胞持久性使评估双重靶向对抗原阴性复发的影响具有挑战性。有趣的是，在另一阶段的临床试验中21双特异性CAR能同时识别复发或难治性B细胞淋巴瘤和大B细胞淋巴瘤患者的CD 22和CD 19，与我们的研究相比，没有任何复发与CD 22抗原丢失或低表达有关，表明在另一种双重靶向CAR结构中，对CD 22抗原的效力是不够的。综上所述，这些数据突出了增强抗CD 22抗原的效力和CAR T细胞持久性的重要性，以使患者从双重靶向策略中获得最大利益。目前正在研究一些可能的方法来实现这一目标，包括缩短制造时间。22并加入小分子，如AKT抑制剂23有利于早期T的保留供应链管理-T厘米表型

最后，我们证明了CD 19和CD 22双重靶向的可行性和安全性。虽然CAR T细胞治疗前有CD 19阴性疾病的患者7的完全分子反应和某些患者CD 22阴性或弱复发的出现证实了CD 22 CAR的活性，但由于AUTO 3的持续时间有限，无法评估双重靶向对复发率的影响。对于复发性和难治性B细胞ALL，AUTO 3似乎并不优于CD 19 CAR T细胞治疗。双CD 19和CD 22靶向治疗的1年总生存率为60%，无事件生存率为32%，表明AUTO 3在复发或难治性B细胞全凝治疗中具有重要的临床应用价值。然而，要充分发挥双靶向CAR T细胞治疗B细胞ALL的潜力，需要采取进一步提高CAR T细胞持久性和进一步靶向表达低水平CD 22的白血病克隆的策略。