CD5 嗨 幼稚CD8 + T细胞由表型异质亚组组成。 幼稚的CD8 + T细胞，CD5 嗨 结果显示，与cd5相比，细胞表现出更复杂的表型，并能诱导更多的抗原特异性免疫应答。 罗氏 细胞 7 。为了探讨这种现象的机制，我们首先比较了CD5之间的表型差异。 罗氏 和CD5 嗨 CD 44亚群 罗氏 幼稚CD8 + C57BL/6(B6)小鼠T细胞。在被评估的各种标记中，Ly6C和CD 183(在较小程度上CD 103)表现出最显著的差异(CD5的~2-6倍)。 嗨 比CD5 罗氏 细胞；附图 1A )。事实上，CD 44的一小部分 罗氏 幼稚细胞表现出较高的Ly6C和CD 183的表达，而CD 103的表达较低，尽管这种特征在CD 44中是典型的。 嗨 记忆表型(MP)细胞(图)。 1A )。大约所有Ly6C + 、CD 183 + ，CD 103 − CD 44亚群 罗氏 CD8 + 细胞来源于CD5 嗨 细胞(~90%~95%) 1B )。尽管表达了这些记忆标记，但这些细胞仍表现为表型和功能上的幼稚，表现为CD 44、CD 122、Ly6C和CD 183的表达明显低于MP细胞(或细胞因子、IL-7和IL-15)，而PMA和离子霉素刺激5h后产生IFN-γ的能力低于MP细胞(附图)。 1B-d
图1：外周幼稚CD8 + T细胞具有典型的异质性。 a Ly6C、CD 183和CD 103在B6CD44上的表达 罗氏 和CD 44 嗨 CD8 + T细胞 b Ly6C百分比 + 、CD 183 + ，CD 103 − CD5细胞 罗氏 和CD5 嗨 B6幼稚CD8 + T细胞( n =12只Ly6C小鼠 + 和CD 183 + , n =5只CD 103小鼠 − ). c 占CD 183的百分比 + 和CD 103 − Ly6C细胞 − 和Ly6C + CD5 嗨 B6幼稚CD8 + T细胞( n =12只CD 183小鼠 + , n =7只CD 103小鼠 − ). d 占CD 183的百分比 + 和Ly6C + CD 24细胞 嗨, CD 24 罗氏 CD5 罗氏 ，以及CD 24 罗氏 CD5 嗨 B6CD4 − CD8 + 胸腺细胞( n =12只Ly6C小鼠 + , n =6只CD 183小鼠 + ). e 脾胸腺Ly6C + B6幼稚CD8 + T细胞在出生后随时间变化(每组3只)。 f 脾胸腺Ly6C + B6幼稚CD8 + 青年和老年小鼠T细胞( n =每组3只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实 t -测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
在分析Ly6C之间的血缘关系时 + 、CD 183 + ，CD 103 − CD5中的子集 嗨 细胞，CD 183的大部分 + 和CD 103 − 在Ly6C中观察到的亚群(80~85%)。 + 细胞(图1. 1C )。同样，在胸腺里，几乎所有的Ly6C + CD5细胞 嗨 成熟CD 24细胞 罗氏 (但不是不成熟的CD 24 嗨 )CD4 − CD8 + 单阳性(SP)胸腺细胞(图)。 1D )。在这些CD 24中 罗氏 SP胸腺细胞CD 103 − 细胞主要见于CD5。 嗨 细胞(~85-90%)；附图。 1E )。CD 183 + 细胞，不像Ly6C + 和CD 103 − 细胞，很少在胸腺中观察到(如图所示)。 1D )，意味着胸腺后世代。
接下来，我们检查了外周Ly6C的程度。 + 子集来自胸腺对应体。在新生和幼龄B6小鼠中，胸腺Ly6C所占比例 + 细胞保持不变，约占CD4总数的5-10%。 − CD8 + SP胸腺细胞，直到出生后第40天(图1. 1E ，左)。然而，脾Ly6C + 细胞占CD 44总数的20% 罗氏 CD8 + T细胞在出生后立即上升到30%，在第5天增加到30%，在第7天略有下降，随后保持在20-30%(如图所示)。 1E ，左)。因此，脾Ly6C + 细胞数量在新生儿时期(1-7天)仅略有增加。但在第40天，其数量显著增加(~6倍于胸腺Ly6C)。 + 细胞 1E ，右)。脾脏CD 183异常高频率 + 细胞(约占幼稚CD8总数的40%) + 细胞在第1天开始观察到，第3天(~10%-20%)和第40天(<10%)细胞数急剧下降，但在此期间细胞数逐渐增加(补充图1)。 1F )。这些数据表明外围天真的Ly6C + 子集来自胸腺和周围(分别为33%和67%)，其中CD 183部分。 + 细胞来源于周围。
外周血Ly6C比例 + (CD 183) + )子集随着时间的推移(>1年)保持相对不变，尽管由于胸腺退化，老年小鼠的实际细胞数量减少(如图所示)。 1F 和补充图。 1g )。值得注意的是，脾脏幼稚的Ly6C + CD5 嗨 − CD5 嗨 细胞(甚至在Ly6C中) − CD5 罗氏 细胞；附图 氢 )。这些结果表明外周幼稚的CD8 + T细胞表现为典型的异质性，尤其是在CD5方面。 嗨 罗氏 Ly6C − 、CD5 嗨 Ly6C − ，和CD5 嗨 Ly6C + 细胞(以下简称CD5) 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + (分别为细胞)。
幼稚CD8 + T细胞持续接触Ⅰ型干扰素，处于稳定状态。 考虑到外围天真的Ly6C + 细胞处于稳定的维持状态，我们研究了影响细胞稳态的因素。证明I型干扰素能影响CD4中Ly6C的表达 + 和CD8 + T细胞群 16 ,17 。事实上，Ly6C的百分比和数量 + 幼稚CD8 + 缺乏Ⅰ型干扰素受体的小鼠T细胞显著降低( 伊夫纳 −/− )或Ⅰ型干扰素和干扰素-γ( 伊夫纳 −/− .Ifngr −/− )和缺乏STAT 1的小鼠( STAT 1 −/− )，这是IFN信号的重要组成部分，比野生型(WT)小鼠更重要。 2A )。这种减少在脾脏，甚至在胸腺中观察到(分别减少4~5倍和20倍)，如图所示。 2B )。不像Ly6C + 细胞，CD 183 + 这些小鼠的细胞百分比和数量保持不变(补充图)。 2A )。Ly6C也需要Ⅰ型IFN信号 + 新生小鼠的细胞生成(附图。 2B )，显示他们一生中持续接触I型干扰素。此外，用干扰素-β体外培养，但不与其他细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23和TGF-β)共同诱导纯化的Ly6C表达。 − 幼稚CD8 + T细胞(图1. 2C 和补充图。 2C )。此外，很大一部分WT，但不是 伊夫纳 −/− 、Ly6C − 幼稚CD8 + T细胞能转化为Ly6C + 细胞在过继转移到B6宿主后的第7天(见图)。 二维空间 )。相反，CD 183 + 虽然细胞水平较低，但在WT和 伊夫纳 −/− 供体细胞，两个捐助者仍保留CD 44 罗氏 幼稚表型(附图) 2D，e
图2：Ⅰ型干扰素和自身TCR对诱导Ly6C的发生至关重要。 + 幼稚CD8 + T细胞 a B6 Ly6C百分比 + 幼稚CD8 + 不同I型IFN缺乏小鼠脾脏T细胞。 b B6 Ly6C的百分比和绝对数 + 幼稚CD8 + 不同I型IFN信号缺乏小鼠脾脏和胸腺T细胞 n =6对于WT， n =6 伊夫纳 −/− n =4 STAT 1 −/− n =3 伊夫纳 −/− Ifngr −/− 老鼠)。 c 诱导Ly6C百分比 + B6Ly6C细胞 − 幼稚CD8 + T细胞体外( n =每组3只)。 d 诱导Ly6C的百分比和绝对数 + 来自WT和 伊夫纳 −/− B6 Ly6C − 幼稚CD8 + 体内T细胞( n =每组4只)。 E， f 诱导Ly6C百分比 + CD5细胞 罗氏 和Ly6C − B6幼稚CD8 + 用干扰素-β培养的T细胞( n =每组6只)。 g MRNA表达 Ly6 c1 来自CD5 罗氏 和Ly6C − B6幼稚CD8 + 用干扰素-β培养的T细胞(n=3只，每组3只)。 h CD5中STAT 1和STAT 2的磷酸化 罗氏 和Ly6C − 用干扰素-β培养的细胞。 i 诱导Ly6C百分比 + B6Ly6C细胞及Ly6C MFI − 幼稚CD8 + T细胞转移到WT或 TAP 1 −/− 寄主( n =每组4只)。 j 诱导Ly6C百分比 + B6，P14或OT-I Ly6C的细胞 − 幼稚CD8 + T细胞转移至B6或P14宿主( n =每组4只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实 t -测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
Ⅰ型干扰素诱导的幼稚CD8中的Ly6C + T细胞依赖于tcr自相互作用 Ⅰ型干扰素对Ly6C选择性影响的原因分析 + 细胞生成，仅限于CD5 嗨 而不是CD5 罗氏 细胞，不清楚。鉴于自身反应性与细胞因子反应性之间的已知相关性 6 我们假设涉及两个参数，即TCR自身相互作用的强度和对Ⅰ型干扰素的相对敏感性。为了研究这个，纯化的Ly6C − CD5 罗氏 和CD5 嗨 幼稚CD8 + T细胞在不同剂量的干扰素-β存在下培养。 2e-h 和补充图。 2F )。CD5 嗨 细胞对Ⅰ型干扰素的敏感性明显高于CD5。 罗氏 细胞，导致Ly6C在蛋白和mRNA水平的表达(见图)。 2e-g )。这种不同的敏感性并不归因于IFNAR的不同水平(IFNAR 1和IFNAR 2；补充图)。 2G )而是下游信号程度的变化，如rn-β诱导的cd5中较强的STAT 1/2磷酸化所证明的那样。 嗨 比CD5 罗氏 细胞(图1. 2H
考虑到cd5的自我反应能力更强 嗨 细胞(NURE 77) 嗨 ；补充图。 2H 18 ，我们接下来研究了自身TCR信号是否确实影响T细胞对I型干扰素的敏感性。以下三项意见证实了这一现象。第一，用可溶性抗CD3(补充图)治疗后，IFN-β诱导的Ly6C表达水平显著升高。 2I )。第二，Ly6C + 细胞合成不良 TAP 1 −/− 通过Ly6C进行传输的主机 − CD8 + 供体细胞(图1. 2I )。第三，最重要的是，当Ly6C − B6，P14和OT-I CD8 + T细胞共转染B6宿主，Ly6C。 + 细胞发生与供体细胞的内在自我反应性成正比(即B6<P14<OT-I)。 2J ，左)。然而，当共同转移到p14宿主时，p14供体显示出~2-3倍的Ly6C。 + 细胞发生(可能是由于供体和宿主P14细胞之间对同一自配体的强烈的克隆内TCR竞争而减少的自我相互作用)，而OT-I和B6供体要么保持不变，甚至增加(图一)。 2J )。与这些发现一致的是，OT-i供体细胞被移植到 TAP 1 −/− 宿主或OT-Ⅰ宿主显示Ly6C显著降低。 + 细胞产生和干扰素-β-诱导STAT 1磷酸化(附图)。 2J，k )。这些结果强烈地提示，自tcr信号对于促进Ⅰ型干扰素的敏感性是至关重要的，并且是Ⅰ型干扰素诱导的Ly6c的正调节因子。 + 细胞生成。
由于Ⅰ型干扰素是病原体感染过程中产生的一种促炎细胞因子，即使在稳态状态下，诱导Ⅰ型干扰素产生的刺激类型仍未确定。Ly6C + 幼稚CD8 + 在无菌(GF)和无抗原(AF)条件下饲养的小鼠，在常规的无病原体(SPF)小鼠中也能看到类似的T细胞(补充图)。 2L )，暗示一个自我的角色，而不是一个外来的成分。总的来说，我们建议天真的CD8 + T细胞池持续接收I型干扰素和自配体的补强信号.这一机制可归因于CD5。 嗨 对这些提示可能比CD5更敏感的细胞。 罗氏 细胞和作为Ly6C的主要生产者 + 子集。
Ⅰ型干扰素对幼稚CD8转录体的影响 + T细胞处于稳定状态 为了进一步了解补药Ⅰ型干扰素的作用，我们纯化了b6幼稚CD8。 + CD5 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + 细胞(附图) 3A )并通过RNA-Seq分析比较了它们的基因表达谱。许多基因在cd5中要么上调要么下调。 嗨 细胞与CD5比较 罗氏 细胞(图1. 3A )。在Ly6C中，大约56-75%的基因受到了类似程度的调控。 − 和Ly6C + 而~15%的细胞在Ly6C中受到更多的调控。 + 比Ly6C − 在Ly6C细胞中，有9~30%的细胞受到较多的调控。 − 比Ly6C + 细胞(图1. 3B )。在微阵列分析中也观察到了类似的结果(补充图)。 3B，c )。特别是， Tbx 21 , 埃梅斯 , Il18RAP ，和 CCL 5 已知在CD5中有较高表达的基因 嗨 比CD5 罗氏 细胞 7 , 10 ，在Ly6C中的表达水平是Ly6C的2-5倍。 + 比Ly6C中的子集 − 子集(图) 3C )。胸腺Ly6C也有类似的增加。 + 与Ly6C比较的子集 − 子集(来自CD5) 嗨 CD 24 罗氏 CD4 − CD8 + SP胸腺细胞；附图 三维空间 )。这些数据表明Ly6C + 子集容易获得独特的转录，从胸腺发育的SP期开始。
图3：Ⅰ型干扰素对幼稚CD8转录的影响 + T细胞处于稳定状态。 a 被上调的基因的热图( n =328个基因)(左面板)或下调( n =225个基因)(右面板)在FACS中-纯化的B6幼稚CD5 嗨 (Ly6C) − 和Ly6C + )CD8 + T细胞与CD5细胞的比较 罗氏 细胞。颜色标度是基于 Z -得分从-1.2(绿色)上升到1.2(红色)。 b 饼图展示了Ly6C中受到类似或不同调控的基因 − 和Ly6C + 细胞上(左)或下调(右)基因。 c RT-PCR结果 Tbx 21，Eomes，Il18 RAP 和 CCL 5 CD5基因 罗氏 、Ly6C − 和Ly6C + 细胞。 Y 轴代表相对mRNA的表达( n =每组3只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实 t -测试。结果为平均±SD。代表两个独立实验的数据。 d , e CD5之间的GSEA结果 罗氏 和Ly6C − ，或Ly6C − 和Ly6C + 细胞通路：调节细胞因子介导的信号通路(GO：0001959) d )和调节I型干扰素介导的信号通路(GO：0060338) e ). f CD5中上调或下调基因间的Venn图 嗨 细胞和干扰素-β调节基因。 g 用或不加干扰素-β培养的细胞间的谷胱甘肽能产生上(右)或下调(左)基因。 h 在CD5之间进行GSEA。 罗氏 和Ly6C − 、CD5 罗氏 ，和Ly6C + ，或Ly6C − 和Ly6C + 为指明的路径。GSEA浓缩分数(ES)代表最小或最大运行浓缩分数的绝对值。颜色标度是基于ES，从0(白色)到1.0(红色)。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们研究了Ly6C的不同转录序列 − 和Ly6C + 亚群是由于对Ⅰ型干扰素的不同敏感性而产生的。由基因集富集分析(GSEA)确定，Ly6C。 + 与调节细胞因子反应相关的基因，特别是Ⅰ型干扰素反应，细胞的富集分数高于Ly6C。 − 细胞，含CD5 罗氏 细胞的浓缩分数最低(图)。 3D，e 和补充图。 3E-g )。因此，有些基因，而不是所有基因，在Ly6C中受到不同的调控。 + (相对于Ly6C − )细胞对I型强直性干扰素信号反应相对较高。为了检验这个假设，天真的CD8 + T细胞经干扰素-β培养1d后，进行RNA-Seq检测.随后，与图中所示的RNA-Seq数据进行了再分析. 3A 。约30%的基因在cd5中上调或下调。 嗨 细胞(包括Ly6C) − 和Ly6C + )与CD5中的比较 罗氏 细胞与干扰素-β治疗所调控的基因重叠(如图所示)。 3F )。这些重叠的基因确实表现出较高的富集分数，这些基因被IFN-β以类似的方式调控(如图所示)。 第三代
了解上述转录数据与cd5功能特性的关系。 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + 细胞及其对Ⅰ型干扰素的反应，我们利用公共GO和IMMGEN RNA-Seq数据库连接各种T细胞功能反应。 10 ,19 。Ly6C + 与cd5相比，Go和IMMGEN定义的功能反应使细胞表现出更高的基因富集分数。 罗氏 细胞甚至Ly6C − 细胞(图1. 3H 1 和补充表 1 ；Eq. 1 还有Eq。 2 )。这些数据共同强化了天真的CD8的观点。 + T细胞对补药Ⅰ型干扰素的反应取决于其内在的自我反应性，不仅影响其表面表型，而且影响转录，可能导致不同的功能特性。
表1干扰素-β对CD5间异基因簇核心富集基因的影响 罗氏 和CD5 嗨 幼稚CD8 + T细胞 Ly6C + 细胞以一种依赖于干扰素的方式表现出增强的功能特性。 考虑到Ⅰ型干扰素对转录的不同影响，我们研究了CD5 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + 细胞的功能特性确实不同。为此，我们研究了幼稚CD8的先天功能。 + T细胞 20 。用IL-12和IL-18(±IL-2)培养B6脾细胞12-24 h，检测CD5中IFN-γ的产生。 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + 细胞(图1. 4A 、顶部)。Ly6C + 细胞产生的干扰素-γ量高于CD5。 罗氏 细胞甚至Ly6C − 细胞(图1. 4A )，虽然Ly6C的这种反应水平 + 细胞数远低于CD 44细胞。 嗨 MP细胞(附图) 4A )。在P14 CD8中也有类似的结果。 + 对应方(附图) 4B )。然而，胸腺Ly6C + 白细胞介素-12/白细胞介素-18不能产生干扰素-γ(补充图). 4C )，建议与此属性相关的胸腺后编程。
图4：Ⅰ型干扰素对Ly6C功能的影响 + 幼稚CD8 + T细胞 a 干扰素-γ分泌CD5的研究 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + B6幼稚CD8 + T细胞( n =每组3只)。 b 干扰素-γ分泌CD5的研究 罗氏 和CD5 嗨 幼稚CD8 + T细胞来自WT或 伊夫纳 −/− 老鼠( n =每组6只)。 c 相对IFN-γ分泌CD5的研究 罗氏 、Ly6C − ，诱导的Ly6C + (InLy6C) + )供体细胞和宿主Ly6C + 细胞( n =每组4只)。 d 干扰素-γ分泌CD5的研究 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + B6幼稚CD8 + 用对照抗体或抗IFNAR1Ab在体内处理T细胞。 n =每组6只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实 t -测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们研究了Ly6C的增强反应 + 细胞依赖于I型IFN，WT和 伊夫纳 −/− 用IL-12/IL-18培养脾细胞，分析其产生干扰素-γ的情况。 4B 、顶部)。值得注意的是CD5 罗氏 细胞与CD5比较 嗨 细胞，如Ly6C + 幼稚CD8 + 细胞缺失 伊夫纳 −/− 老鼠。WT和 伊夫纳 −/− CD5 罗氏 细胞对IFN-γ的产生无明显影响。 4B )。然而，在CD5中 嗨 细胞内，干扰素-γ的产生明显降低。 伊夫纳 −/− 细胞比WT细胞减少了26%-50%；如图所示。 4B
降低干扰素-γ产生能力 伊夫纳 −/− CD5 嗨 细胞提出的问题是，这些细胞需要多长时间暴露在I型干扰素中才能完全发挥作用。因为Ly6C的一小部分 − 细胞转化为Ly6C + 细胞在一周内在周围(图)。 二维空间 )，我们检查了Ⅰ型干扰素是否是新诱导的(In)Ly6C。 + 细胞(InLy6C) + )还获得增强的功能能力。为此，纯化了Ly6C − 幼稚CD8 + 将细胞转移到B6宿主，7d后用IL-12/IL-18处理脾细胞，进行干扰素-γ的产生分析。 4C 、顶部)。Ⅰ型干扰素诱导供体来源Ly6C + 细胞(InLy6C) + )证实的干扰素-γ的产量可与先前存在的宿主来源的Ly6C相当(或略低)。 + 细胞(宿主Ly6C) + )，两者的γ产量均高于cd5。 罗氏 和Ly6C − 捐献者(图1. 4C
为进一步证实上述发现，用抗IFNAR治疗小鼠体内失去Ⅰ型干扰素信号的小鼠B6脾细胞，用IL-12/IL-18进行培养，并进行IFN-γ产生分析(图一)。 4D 、顶部)。抗IFNAR治疗Ly6C + (但不是CD5 罗氏 或Ly6C − )细胞与对照组相比，干扰素-γ的产生减少了18~47%。 + 细胞(图1. 4D )。此外，与发现自tcr信号是一种正调节的补药Ⅰ型干扰素反应，幼稚的cd8的发现是一致的。 + T细胞转移到 TAP 1 −/− 与转移到B6宿主的细胞相比，宿主细胞IL-12/IL-18诱导的IFN-γ产生显著降低(附图)。 4D )。这些数据表明Ly6C增强的功能适应度 + 细胞是自我驱动和获得后胸腺，至少在一定程度上，通过一种机制依赖于长期持续接触紧张型干扰素在一个稳定的状态。
Ly6C + 细胞比Ly6C诱导更多的抗原特异性扩增。 − 细胞对LCMV感染的反应 考虑到明显不同的功能能力，我们测试了对病原体感染的实际免疫反应。为此，B6幼稚的CD5 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + CD8 + T细胞共转染B6宿主(第1组，CD5)。 罗氏 +Ly6C − ；第2组，CD5 罗氏 +Ly6C + 第3组，Ly6C − +Ly6C + 按1：1比例，其次为淋巴细胞性脉络膜脑炎病毒(LCMV)感染，并于感染后第7天(7 Dpi)分析供体扩张情况(图7)。 5A 、顶部)。总体来看，CD8 + 供体细胞，同时涉及Ly6C − 和Ly6C + 细胞，显示出比CD5更多的膨胀 罗氏 共同转移的细胞(如图所示)。 5A (第1组和第2组)，这与先前使用未分馏的CD5进行的研究结果一致。 嗨 细胞 7 。令人惊讶的是，当比较被分割的CD5的反应时 嗨 Ly6C − 和Ly6C + Ly6C细胞 + 细胞比Ly6C表现出更多的膨胀 − 细胞(图1. 5A ，第3组)。LCMV GP 33-和NP 396特异性CD8也有类似的结果。 + 供体细胞(图1. 5A 、1~3组及附图。 5A
图5：Ly6C + 细胞在LCMV感染后表现出更大的扩张能力。 a CD 44中每个捐助方子集的比例 嗨 CD8 + (上)或CD 44 嗨 CD8 + GP 33-四聚体 + B6供体细胞(下) n =组1的12只小鼠， n =11只小鼠(第2组和第3组)。 b 共转P14亚群的百分比和捐助者回收率( n =21只小鼠，第1/2/3组， n =7只小鼠(1组、2组和3组)。 c 捐助方恢复P14 CD5 嗨 相对于P14 CD5的子集 罗氏 细胞( n =21只小鼠CD5 嗨 (共计) n =7只Ly6C小鼠 − 、Ly6C + CD 183 − ，和Ly6C + CD 183 + ). d 单独转移的P14子集的百分比和捐助者回收(n =20只CD5小鼠 罗氏 n =21只Ly6C小鼠 − , n =25只Ly6C小鼠 + ). e 占P14 CD 44的百分比 嗨 CD8 + BrdU + 供体细胞( n =每组7只)。 f 先前停泊在B6主机上的P14亚群的百分比和捐助者回收( n =8只小鼠CD5 罗氏 n =8只Ly6C小鼠 − , n =4只小鼠为inLy6C + (D7)和InLy6C + (D21) n =8只小鼠为FreshLy6C + )。两尾未配对学生的统计显着性得到证实 t -测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
Ly6C的高膨胀率 + 细胞与Ly6C的比较 − 和CD5 罗氏 细胞并不是由于同源肽的TCR亲和力不同所致，几乎相同的TCR与GP 33-或NP 396-MHC四聚体的结合证明了这一点(补充图1)。 5B )。进一步排除多克隆B6CD8在TCR特异性和前体频率上的细微差异 + 捐献者，我们使用了P14 CD8 + 细胞。P14(A) Rag1 −/− 背景)幼稚的CD5 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + (CD 183) − 或CD 183 + )亚群共同转移到B6宿主(第1组，CD5)。 罗氏 +Ly6C − ；第2组，CD5 罗氏 +Ly6C + CD 183 − 第3组，CD5 罗氏 +Ly6C + CD 183 + 在1：1的比例下，接着是LCMV感染，并在8dpi进行分析(见图)。 5B 、顶部)。尽管TCR特异性和输入细胞数相同，但P14 CD5 罗氏 细胞恢复的程度比他们的P14 CD5要小得多 嗨 对应方(图1. 5B ，1/2/3组)。然而，并非所有CD5 嗨 子集显示了这种增长(图)。 5B，c， (第1、2和3组)；与CD5比较 罗氏 Ly6C细胞 + (均为CD 183) − 和CD 183 + )细胞数量显著增加，而Ly6C细胞则显著增加。 − 子集没有。
为了避免捐献者之间不必要的竞争，p14幼稚的cd5。 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + 将细胞分别转移到B6宿主，7dpi时进行LCMV感染和分析(见图)。 5D 、顶部)。再说一遍，Ly6C + 细胞比CD5表现出更大的膨胀。 罗氏 细胞甚至Ly6C − 细胞，而Ly6C − 细胞没有(如图所示)。 5D 和补充图。 5C )。Ly6C的扩大 + 细胞分裂增强与BrdU摄取增加有关，在6 dpi时，BrdU在体内作用2h后摄取增加(如图1所示)。5E )，Ki-67表达增强(附图)。 5D )，并增加细胞微量紫(CTV)染料稀释(补充图。 5E )。这些数据表明，尽管TCR和前体频率相同，Ly6C + 子集不同于Ly6C − 与诱导抗原特异性扩增有关的子集，作为cd5的主要应答者。 嗨 整体细胞。
Ly6C + Ⅰ型干扰素诱导的细胞在LCMV感染过程中抗原特异性扩增增强。 Ly6C反应增强 + 细胞相对于Ly6C − 细胞是有趣的，因为它们是相同的p14衍生的cd5。 嗨 细胞。在GP33肽/MHC四聚体结合方面，两者均无明显差异(附图)。 5F，g )。因此，Ly6C的更大扩展 + 细胞与Ly6C的比较 − 细胞对于同源异物(和自身)肽在TCR亲和力上的差异可能不能完全解释。
另外，我们测试了iIFN的作用，这是因为Ly6C有很好的反应性。 + 该细胞因子的子集，并检测了Ⅰ型干扰素驱动的新诱导的Ly6C。 + 细胞在体内具有较好的扩张能力。Ly6C − 将p14细胞转移到B6宿主中，并在B6宿主中停留7天和21天，产生Ⅰ型IFN诱导的Ly6C细胞。 + 细胞(d7-和D21-在Ly6C) + 分别；图1. 5F 、顶部)。供体来源的CD5 罗氏 、Ly6C − ，D7-和D21-在Ly6C中 + 细胞，作为对照，预先存在的Ly6C + 新鲜分离的P14小鼠细胞(新鲜Ly6C) + )纯化，转移到B6宿主，感染LCMV，并在7 dpi时进行供体扩增分析(图1)。 5F 、顶部)。而CD5 罗氏 和Ly6C − 捐助者表现出类似的反应，如Ly6C + 细胞表现出不同的反应取决于体内暴露时间(如图所示)。 5F 、底部)。因此，D21-inLy6C + 供体细胞，但不是d7-inLy6C + 与Ly6C相比，细胞的抗原特异性扩增明显增强。 − 供体，可与宿主来源的已存在的新Ly6C相媲美。 + 细胞(图1. 5F ，表明Ly6C的响应较高。 + 子集与Ly6C的表达本身并不直接相关，而是反映了其在体内停留的时间。这些数据表明Ly6C的扩展能力增强了 + 细胞是在胸腺后以一种时间依赖的方式获得的，可能需要长时间暴露于强直性Ⅰ型干扰素信号中。
CD5 罗氏 、Ly6C – ，和Ly6C + 细胞对LCMV感染有独特的分化命运。 根据不同的扩张反应，我们在lcmv特异性免疫反应高峰时，观察了效应细胞(如短命效应细胞(Slecs)与记忆前效应细胞(Mpecs)的命运)。 21 。P14幼稚CD5 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + 将亚群转移到B6宿主，然后感染LCMV，7 dpi分析供体分化情况(见图)。 6A )。SLEC的百分比(CD 127) 罗氏 KLRG 1 嗨 )是CD5中最低的 罗氏 Ly6C中间体细胞 − 细胞，在Ly6C最高 + 细胞(图1. 6B )。相反，MPECs的百分比(CD 127) 嗨 KLRG 1 罗氏 )是CD5中最高的 罗氏 Ly6C中间体细胞 − 细胞，Ly6C最低 + 细胞(图1. 6B )。基于CD 27和CX3CR1的表达也观察到类似的结果。 22 (无花果) 6C )；CD 27的百分比 − CX3CR1 嗨 (SLEC偏斜)和CD 27 + CX3CR1 罗氏 (MPEC偏斜)在Ly6C中最高。 + 细胞和CD5 罗氏 细胞分别。B6CD8的实验也证实了这一现象。 + 作为捐献者，KLRG 1所占比例最高和最低 嗨 Ly6C细胞 + 细胞和CD5 罗氏 细胞，分别在7 dpi(补充图)。 6A
图6：CD5 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + 细胞在LCMV感染过程中表现出明显的效应。 a 实验方案 b –f) . b 占CD 127的百分比 − KLRG 1 + 和CD 127 + KLRG 1 − P14 CD 44 嗨 供体细胞( n =6只小鼠CD5 罗氏 n =7只Ly6C小鼠 − 和Ly6C + ). c 占CD 27的百分比 + CX3CR1 罗氏 、CD 27 + CX3CR1 INT ，以及CD 27 − CX3CR1 嗨 P14 CD 44 嗨 供体细胞( n =每组5只)。 d , e SLEC的GSEA概况( d )和MPEC( e )P14CD5的标记基因 罗氏 和P14 Ly6C + 供体细胞或P14 Ly6C − 和P14 Ly6C + 供体细胞。 f P14 CD 44的百分比和捐助者回收率 嗨 120 dpi供体细胞( n =5只CD5小鼠 罗氏 n =6只Ly6C小鼠 − 和Ly6C + ). g 占CD 44的百分比 嗨 CD62L 嗨 和CD 44 嗨 CD62L 罗氏 P14供体细胞在120 dpi( n =5只CD5小鼠 罗氏 和Ly6C − , n =6只Ly6C小鼠 + ). h 占P14 CD 44的百分比 嗨 BrdU + 35 dpi供体细胞( n =9只T小鼠 纳 、T 厘米 ，和T 埃姆 n =5只CD5小鼠 罗氏 n =6只Ly6C小鼠 − 和Ly6C + )。数据是至少两个独立实验的累积值( b –i )。两尾未配对学生的统计显着性得到证实 t -测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
为了获得更多支持这种不同命运的证据，rna-seq在p14供体子集(7 Dpi)上进行了测试，并与对slecs和mpecs进行分析的公共rna-seq数据集进行了比较。 23 ,24 继续进行GSEA(如图所示)。 6d，e )。Ly6C + 与CD5相比，细胞表现出更多的SLEC特征基因富集。 罗氏 和Ly6C − 细胞(图1. 6d )。相反，CD5 罗氏 MPEG标记基因比Ly6C富集得多。 − 和Ly6C + 细胞(图1. 6E )。这些数据强烈表明，尽管对同一同源抗原Ly6C表现出相同的P14 TCR反应 + 和CD5 罗氏 亚群经历了明显不同的分化程序，即SLECs与MPEC，分别。
为了进一步研究记忆细胞的产生，P14幼稚CD5 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + 将细胞转移到B6宿主，然后在120 dpi处进行LCMV感染和分析(见图)。 6f 、顶部)。符合增强的MPEC倾斜，CD5 罗氏 细胞数和百分率均高于Ly6C。 − 和Ly6C + 细胞(图1. 6f )，与7 dpi时观察到的峰值反应形成鲜明对比(图1)。 5D )。此外，CD5 罗氏 和Ly6C + 120 dpi供体细胞CD 44较高。 嗨 CD62L 嗨 中央存储器(T) 厘米 )和CD 44 嗨 CD62L 罗氏 效应器存储器(T) 埃姆 )表型。 6g )。CD5增强能力 罗氏 细胞分化为T细胞 厘米 上T 埃姆 与它们较高的自我更新能力有关，如p14 cd5的Brdu吸收量增加就证明了这一点。 罗氏 供体源性记忆细胞35 dpi与Ly6C的比较 − 和Ly6C + 对应方(图1. 六小时 和补充图。 6B + T细胞本质上是预先决定的，不管它们的抗原特异性如何，而不是在免疫应答过程中随机选择。
补药Ⅰ型干扰素天生形成高SLEC但低MPEG偏斜的Ly6C + 细胞 鉴于固有的不同命运，我们检查了其他内在性质，如凋亡，细胞因子的产生和代谢。为此，P14 CD5 罗氏 、Ly6C − ，和Ly6C + 将细胞转移到B6宿主，7dpi后进行LCMV感染和分析(见图)。 7A )。活性半胱氨酸天冬氨酸酶3，CD5的测定 罗氏 细胞死亡率低于Ly6C − 和Ly6C + 细胞(图1. 7b )。肽体外再刺激5h，CD5后细胞因子的产生 罗氏 细胞比Ly6C具有更高的IL-2生成能力。 − 和Ly6C + 细胞，虽然干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的产生保持不变(图)。 7C 和补充图。 7A )。颗粒酶B和CD107a的表达无显着性差异(附图)。 7b )。测定耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)，CD5 罗氏 细胞的ECAR低于Ly6C，OCR高于Ly6C。 − 和Ly6C + 细胞，随着CD5中OCR：eCar比值的增加 罗氏 细胞(图1. 7D )。与降低的糖酵解活性(ECAR)相一致，CD5 罗氏 细胞对mTOR信号通路的基因集富集评分明显低于Ly6C。 − 和Ly6C + 细胞(附图) 7C )。因此，在CD5中观察到的上述特征 罗氏 与低分化MPECs相似的细胞 25 ,26
图7：补药Ⅰ型干扰素塑造Ly6C的固有能力 + LCMV感染细胞可获得高SLEC而低MPEC。 a 实验方案 b –d ). b Caspase 3切割百分率 + 供体细胞( n =每组3只)。 c IL-2(左)和IFN-γ(右)产生P14 CD 44 嗨 供体细胞(每组6只)。 d P14 CD 44的OCR和ECAR谱 嗨 供体细胞( n =5只小鼠OCR(SRC)和最大OCR/最大ECAR， n =6只小鼠进行ECAR(GR)。 e 实验方案 f , g )。F , g 占P14 CD 44的百分比 嗨 供体细胞( f )和CD 127的百分比 − KLRG 1 + 或CD 127 + KLRG 1 − 供体细胞( g )以前用控制抗体或IFNAR抗体在体内( n =每组6只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实 t -测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
为了研究稳定状态下的补药Ⅰ型干扰素是否与不同命运的形成有关，我们在体内进行了抗IFNAR治疗的体内阻断实验。P14小鼠注射对照或抗IFNAR抗体，10天后，cd5。 罗氏 和Ly6C + 细胞被分离并共同转移到b6宿主(以1：1的比例混合对照抗体和抗IFNAR处理的CD5)。 罗氏 或Ly6C + 其次是LCMV感染，并在7 dpi进行分析(见图)。 7E )。Ly6C + ，但不是CD5 罗氏 抗IFNAR处理的细胞与对照组相比，抗原特异性扩增明显减少(图1)。 7F )。同样，早期Ⅰ型IFN阻断10天后，SLEC减少，而Ly6C的mpeg偏斜增加。 + 细胞，而CD5的命运 罗氏 细胞保持不变(图)。 7g )。CD 27和CX3CR1表达的分析结果相似(补充图)。 7D )。与外周P14Ly6C形成鲜明对比 + 胸腺细胞Ly6C + 细胞(相对于胸腺CD5) 罗氏 和Ly6C − 在LCMV感染时，效应细胞的扩张或分化命运无明显差异(附图)。 7E )。综上所述，这些数据表明，在周围连续照射I型干扰素对形成幼稚细胞，特别是Ly6C细胞的独特分化特性有着深远的影响。 + CD8 + T细胞
