DNA修复蛋白DNA-PKcs抑制剂调控的结构研究

Dna依赖蛋白激酶催化亚基(Dna Pkcs)在非同源端连接中起着核心作用，这是人类检测和修复dna双链断裂(Dna)的两条主要途径之一。1,2。Dna-pkcs在修复病理性dSBs中具有重要意义，因此dna-pkcs抑制剂与dsb诱导放化疗联合应用对肿瘤治疗有吸引力。3。许多已开发的选择性dna-pkcs抑制剂具有治疗各种癌症的潜力。4。本文报道了从HeLa细胞核提取物中天然纯化的人dna-PKcs的冷电镜(cryo-EM)结构，该结构与腺苷-5‘-(γ-γ)-三磷酸腺苷(ATP-γS)和4种抑制剂(Wortmannin，NU7441，AZD 7648和M 3814)配合使用，包括正在进行临床试验的候选药物。这些结构揭示了在催化前ATP结合在活性位点的分子细节，并对竞争性抑制剂的作用方式和特性提供了深入的见解。值得注意的是，配体的结合导致了Pikk调控域(PRD)的运动，揭示了p环和珠三角构象之间的联系。电泳迁移率测定和冷电镜对DNA依赖的蛋白激酶全酶的研究进一步表明，配体结合对酶复合物的组装没有负的变构或抑制作用，抑制剂通过与ATP的直接竞争发挥作用。总之，本研究中所描述的结构将大大有助于今后针对DNA-PKcs的合理药物设计工作，显示出制冷-EM在结构导向药物开发中的巨大和挑战性目标的潜力。

DNA双链断裂(DSBs)是最具毒性的DNA损伤形式.两种主要途径，同源重组(HR)和非同源端连接(Nhej)，修复dbs。1。HR需要dna末端切除，并且在细胞周期的S期和G2期是活跃的，当姐妹染色单体可以作为修复模板时。5。相反，在没有任何模板的情况下，nhej直接连接dna末端。2.

DSBs导致基因组不稳定性增加，引发细胞死亡。这在电离辐射放疗和拓扑异构酶Ⅱ抑制剂化疗中都得到了广泛的应用。2,3。然而，固有的DNA损伤反应和修复为肿瘤细胞提供了一定的保护作用。IR和拓扑异构酶Ⅱ抑制剂引起的病理性DSBs主要由nhej修复，这需要dna依赖蛋白激酶(Dna Pk)，由dna pkcs和ku 70 ku 80杂合二聚体组成。6,7,8。Dna-pkcs属于磷酸肌醇3-激酶(Pi3k)相关蛋白激酶(Pikk)家族，在nhej的调控中起着核心作用。9。结合IR或基因毒性化疗，抑制dna-pk激酶活性可改善肿瘤治疗。4。针对dna-pkcs的ATP结合位点的小分子抑制剂的开发已经有了很多的努力，这在早期合成的小分子PI3k抑制剂的研究中得到了证实。10。包括CC 115、KU-0060648、LY 294002、LY 3023414、NU7026和NU7441在内的老代dna-PK抑制剂均有效，但对PI3K和Pikk成员(特别是mTOR和PI3Kγ)的选择性不同。新一代抑制剂是在大规模筛选的基础上发展起来的，包括vx-984、m 3814和azd 7648，它们对dna-pkcs具有较好的选择性。4,10,11.

到目前为止，我们还没有发现与ATP或任何抑制剂配合使用的DNA-PKcs的结构。这限制了对ATP与DNA-PKcs的结合以及抑制剂的作用方式，包括药物候选物的理解，并构成了领导发展的一个主要障碍。在此，我们报道了与腺苷-5‘-(γ-硫)-三磷酸腺苷(γ-γS)和其他抑制剂(包括广谱PI3K抑制剂Wortmannin)、老一代DNA-PKcs选择性抑制剂NU7441和新一代AZD 7648和M 3814的配合物中dna-pkcs的结构。该结构允许了解DNA-PKcs在底物结合和催化前与ATP的结合，抑制剂的作用方式以及它们实现特异性的机制。它们也为未来针对dna-PKcs的药物设计提供了结构指导，展示了cryo-EM在基于结构的药物发现方面的巨大潜力。

从HeLa细胞提取液中纯化的dna-pkcs与atpγS共同孵育，并与自制单层氧化石墨烯(扩展数据图)一起加载到先前制备的网格上。1)。Dna-pkcs-atpγS配合物的整体分辨率为3.40av，催化核心区的局部分辨率优于3γS，表明了用2mg模拟atpγS的清晰密度。2+与同系物mTOR的结构相似。1A以及扩展数据图。2A)12。P环(残基3729-3735)与ATPγS.的磷酸基团密切相互作用，这是β-磷酸酯与Arg 3733的主链NH基团以及Ser 3731侧链的相互作用。Lys 3753与ATP的α-磷酸酯相互作用，Asn 3927，Asp3941和Glu3756协同Mg。2+离子。AtpγS的γ-磷酸酯指向底物结合位点.N叶和C叶之间的“铰链环”和两个叶构成疏水表面，由Leu 3751、Tyr 3791、Trp 3805、Leu 3806和Ile 3940的侧链和Glu3804的主链构成，ATPγS的腺嘌呤结构可与其结合。因此，ATPγS和Mg2+离子在dna-PKcs的ATP结合槽中结合，协调N-和C-叶，包括激酶的p环、激活环和催化环.构象变化包括Trp 3805和Met3929向外旋转，打开口袋以容纳ATP(图1)。1B)13，以及α-螺旋在蛋白质的头部单位中的协调运动(图)。1C)。值得注意的是，珠三角(残基4009-4039)不干扰dna-pkcs与ATP和Mg的相互作用。2+。然而，dna-pkcs的α-螺旋(残基4009-4023)在α结合后被移离底物结合位点，部分缓解了珠三角对后续催化所需底物结合位点的阻断(图1)。1C).

a，dna-pkcs-atpγS-(Mg)的库仑电位图2+)2复杂。扩展视图显示atpγS-(Mg)2+)2在ATP结合槽中结合。三磷酸腺苷γS(淡灰色)，加两毫克2+离子(荧光绿)，协调N-和C-叶，特别是DNA-PKcs(灰色)的p环(李)、催化环(巧克力)和激活环(天蓝色)。γ-磷酸基团指向底物结合位点.左上角图像显示清晰的库仑势图，用于γS-(Mg)的建模。2+)2，下面的示意图强调了DNA-PKcs的三个单元和头部单元的详细组成。b，打开ATP结合槽入口。ATP结合槽入口Trp 3805和Met3929两侧的残基显示出向外旋转，允许ATPγS.ApoDNA-PKcs(蛋白质数据库)的腺嘌呤部分对接。6ZFP)呈粉红色，表面呈网状。c，ATPγS-(Mg)2+)2对珠三角的管制。珠三角阻断底物结合位点。当ATP结合时，珠三角会倾斜，并离开其在apo结构中的位置。

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Dna pkcs与几种具有不同特异性的dna pkcs抑制剂(wortmannin，nu 7441，azd 7648和m 3814)共同孵育，以研究蛋白质与配体的相互作用(补充表)。1)。这些结构的总体分辨率从2.96奥姆到3.33奥米不等。在所有的结构中，激酶核心具有最高的局部分辨率，允许明确地模拟抑制剂(如图所示)。2A).

a、参展商及其相应的库仑势图。b，将Wortmannin(绿色)与ATP结合位点结合，由Lys 3753的伯胺基团共价修饰。c，NU7441(蓝色)与ATP结合位点的结合。d，AZD 7648(紫色)与ATP结合位点的结合。e，M 3814(青色)与ATP结合位点的结合。DNA-PKcs以灰色显示。

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Wortmannin是用于抑制激酶的早期dna-pk抑制剂之一。14。在冷电镜结构中，Wortmannin主要是针对dna-PKcs的N叶(Leu 3751，Ile 3803和Trp 3805)，另一侧则是C叶(Met3929和Asp3940)。2B)。化合物的一个边缘面对ATP结合部位的深层口袋，相反的边缘暴露在溶剂中。Lys 3753的伯胺(ε-氨基)与C19形成共价C-N键。2A)，不可逆地抑制激酶活性。DNA-PKcs的ATP结合位点与Wortmannin具有紧密的结构互补关系.C14甲基位于由Leu 3751、Ile 3803和Trp 3805形成的口袋中，而C10甲基则位于由Met3729、Pro3735和Leu 3751形成的口袋中(图1)。2B)。与猪PI3Kγ(ExtendedData图)的配合物中的Wortmannin的结构中观察到，与Wortmannin的C11没有对应的乙酰氧基的密度。3A)15.

与Wortmannin相比，NU7441是由广谱蛋白激酶类黄酮抑制剂槲皮素衍生的早期抑制剂NU7026和LY 294002研制而来的一种选择性较强的抑制剂。16。由Leu 3751、Tyr 3791、Ile 3803、Trp 3805、Leu 3806、Ile 3940和Met3929形成的NU7441色核和吗啡环在最深的口袋中央形成氢键，其中NU7441的O1和O27与Asp3941和Leu 3806的肽骨架形成氢键。2C)。二苯并噻吩基团在Met3729、Pro3735和Leu 3751的疏水沟槽中与N叶和码头相互作用。2C).

AZD 7648是最近开发的dna-pk抑制剂，具有很高的选择性，可以提高阿霉素和IR的疗效。11,17。此外，AZD 7648被确定为与PARP抑制剂olaparib联合治疗的潜在药物，目前正在进行晚期恶性肿瘤的临床试验(试验标识符，NCT 03907969)11。AZD 7648的开发人员利用了先前公布的AZD 7648与PI3Kγ结合的晶体结构。17。在DNA-PKcs-AZD 7648配合物中，化合物与铰链环结合。二维空间)。含甲基的三唑吡啶基位于Tyr 3791、Ile 3803、Leu 3806和Ile 3940形成的深层疏水口袋中。由Trp 3805、Leu 3806和Met3929组成的狭窄隧道中的嘌呤基码头。类似于PI3Kγ-AZD 7648配合物，AZD 7648(苯胺NH)的N3氢与Glu3804的主链氧形成键，N7接受Leu 3806骨架NH基团的氢(参考文献)。17)。三唑吡啶基中的N6也与Asp3941的主链NH基团结合。在DNA-PKcs-AZD 7648：N5中还存在进一步的氢键，与伯胺基团Lys 3753形成键。这两种结构的比较表明，PI3Kγ中Trp 812的吲哚环相对于DNA-PKcs中的Trp 3805旋转了90°，这不仅提供了更好的疏水结合表面，而且与AZD 7648嘌呤环很好地对齐，导致了π相互作用，增强了亲和力(扩展数据图)。3B).

M 3814(peposertib或nedisertib)是另一个最近开发的dna-pk选择性抑制剂。18,19。临床前的研究显示，它与阿霉素和依托泊苷的放疗和化疗有协同作用。20。在第一阶段的临床试验结果中，该化合物被证明耐受性好，对未被选择的肿瘤有温和的疗效(试验标识符，NCT 02316197)19M 3814目前正处于针对不同癌症的四阶段2临床试验(试验标识符，NCT 03770689, NCT 04068194, NCT 04071236和NCT 04172532)。根据我们的结构，该化合物的喹唑啉和吗啡基很好地符合Leu 3751、Tyr 3791、Val3793、Ile 3803、Trp 3805、Leu 3806、Ile 3938和Ile 3940等侧链以及Glu3804和Asp3941主链形成的最深、疏水的口袋。2E)。氯氟苯环旋转约60°，指向N叶，向Met3729、Ser3731、Pro3735、Leu 3751和Lys 3753的侧链方向移动。含有吡啶嗪环的残基随后向后旋转，几乎与喹唑啉平面平行，位于Met3729、Trp 3805、Thr 3811、Asn 3926和Met3929的凹槽中。

所有的抑制剂都针对dna-pkcs的ATP结合沟，与ATPγS-结合位点重叠(图1)。3)。其中，Wortmannin的重叠程度最大。与ATPγS相比，Wortmannin与该结合位点具有更强的互补性。3A)，与ATP腺嘌呤分子口袋结合得更深，其两个突出的甲基更适合于N叶表面的疏水口袋。

aATPγS-(Mg)结合方式的比较2+)2以及dna-PKcs中的Wortmannin。ATPγS-(Mg)的顶部、结合构象2+)2(浅灰，ATPγS；荧光绿色，Mg2+离子)和虫草素(绿色)。γS-(Mg)与dna-pkcs结合沟的构象差异2+)2(灰色)和华尔曼宁(绿色)。bATPγS-(Mg)结合方式的比较2+)2以及DNA-PKcs中的NU7441。ATPγS-(Mg)的顶部、结合构象2+)2和NU7441(蓝色)。γS-(Mg)与dna-pkcs结合沟的构象差异2+)2和NU7441(蓝色)。cATPγS-(Mg)结合方式的比较2+)2和AZD 7648的DNA-PKcs。ATPγS-(Mg)的顶部、结合构象2+)2和AZD 7648(紫色)。γS-(Mg)在dna-pkcs结合槽处的构象差异2+)2和AZD 7648(紫色)。dATPγS-(Mg)结合方式的比较2+)2以及DNA-PKcs中的M 3814。ATPγS-(Mg)的顶部、结合构象2+)2和M 3814(青色)。γS-(Mg)在dna-pkcs结合槽处的构象差异2+)2和M 3814(青色)。

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NU7441与ATPγS的结合方式有很大的不同.NU7441的色核和吗啡环结合在ATPγS的腺嘌呤基和γ-磷酸酯基所占据的口袋上(如图所示)。3B)。二苯并噻吩部分与ATPγS核糖重叠，插入p-环与铰链环之间的沟槽中，由Met3729的120°内摆形成。

在AZD 7648中，含有甲基基的三唑吡啶基在同一口袋中比ATPγS的腺嘌呤部分更深(图1)。3C)。当四氢吡喃环与ATPγS核糖占据相同的空间时，AZD 7648的嘌呤环很好地与Trp 3805和Met3929之间的空槽相吻合。

M 3814在结合槽中与ATPγS重叠最少。喹唑啉和吗啉部分深入到ATPγS的腺嘌呤基和磷酸根的口袋中。三维空间)。此外，当化合物结合时，Trp 3805的侧链向内移动，将开放的腺嘌呤结合位点转变为封闭的疏水口袋，其中充分容纳M 3814的吗啡环。氯氟苯环与ATPγSα-磷酸酯重叠，指向N叶，引起p环和Lys 3753附近区域的隆起。吡嗪环毗邻ATPγS核糖，但更靠近C叶，Asn 3926向M 3814旋转，形成一个小槽来对接药物。

不同的抑制剂导致不同的构象变化，每一个改变表面性质，以优化与配体的结合作用。构象变化有两个关键区域。一种是p-环，其构象由残基引导，其侧链面向ATP结合槽。在apoDNA-PKcs中，p环的位置受侧面β片和Arg 3733与Asp3587之间静电相互作用的抑制。4A)。Met3729、Ser 3731和Pro3735的构象随配体化学性质的不同而变化，导致p环向上向下运动，就像“春叶”。这一运动引起了相应的构象变化，在侧翼的β-板被传递到dna-pkcs头部区域的疏水核心(如图所示)。4B)。由此产生的DNA-PKcs的构象变化，特别是珠三角的运动，似乎是一致的(图)。4C)。构象变化的另一个关键区域是铰链环上的Trp 3805，它保护主口袋的入口(如图所示)。4B)。Trp 3805的吲哚侧链参与了配体的堆积效应和疏水作用，其运动影响了结合位点的结构。

a，APODNA-PKcs(粉红色)中的p环构象是由侧面的β-片和Arg 3733与Asp3587之间的静电相互作用所固定的。b，两个视图，通过轮换120进行关联。o不同配体的结合对p环构象的影响。这些构象变化类似于弹簧叶的运动。侧翼β片的相应运动将构象变化传递到核心的DNA-PKcs激酶区域.灰色，ATPγS；绿色，蠕虫蛋白；蓝色，NU7441；紫色，AZD 7648；青色，M 3814。c、调节dna-pkcs激酶区域构象的p-环构象的正交观察，包括珠三角。

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近年来，对dna-pkcs在DNA修复中的作用机制的研究，通过晶体学和冷电镜的结构研究，取得了新的进展。13,21,22,23,24,25,26。然而，技术挑战和限制一直是生化和结构研究的主要障碍。DNA-PKcs-ATPγS-(Mg)的结构2+)2本文介绍了ATPγS和2mg是如何实现的。2+离子占据ATP结合槽，协调p环、激活环和催化环.ATPγS-(Mg)的存在2+)2结果珠三角在催化前部分解除了底物结合位点的堵塞.这与dna-pkcs在没有dna-pk全酶组装的情况下在体外具有活性的观察相一致，并解释了为什么ku 70-ku 80和dna不能刺激dna-pkcs C末端的激酶活性。27。结合dna-pkcs-抑制剂复合物的结构，揭示了春叶状p环运动对珠三角构象的调节作用。此外，我们还得到了dna-pk-atpγS-(Mg)的结构。2+)2复杂，中等分辨率为4.3aA(扩展数据图)。4A，b)。在此结构中，dna-pkcs的激酶结构域与dna-pk-atpγs-(Mg)的对应区域很好地吻合。2+)2表明DNA-PKcs单肽链配体与全酶的结合模式相似。此外，我们进行了电泳迁移率转移试验(EMSA)，以确定抑制剂并不阻止DNA-PK全酶的形成(扩展数据图)。4D)。此外，结构和单分子研究表明，配体的结合不影响dna-pkcs的长距离nhej配合物的二聚。24,28。因此，dna-pkcs抑制剂不应在结构上干扰高阶复合物的形成.它们通过直接ATP竞争发挥作用。

目前的候选药物已从针对ATP结合位点的大规模筛选中成功开发出来，但这些候选药物的作用方式的分子细节尚不清楚。4,10。在我们的结构中，所有被研究的抑制剂都比ATP长得少，并且不会延伸到α-磷酸酯基的位置之外。然而，这些抑制剂更有效地针对ATP的腺嘌呤分子所在的深层疏水囊。这些抑制剂都有大量的疏水基团，它们深深地结合在这个口袋里，从而达到了很高的占用率。口袋的占用率与选择性有关：NU7441、AZD 7648和M 3814的占用率高于Wortmannin。比较老一代抑制剂NU7441和新一代抑制剂AZD 7648和M 3814的结果表明，探索N叶和C叶与C叶边缘区域之间的入口通道也可以提高选择性(如图所示)。3C，d)。DNA-PKcs-配体配合物与mTOR-配体配合物的结构比较表明，抑制剂特异性与p环构象和组成有关(扩展数据图)。2A-C)。Dna-pkcs和mTOR的配体结合区非常相似，主要区别在于p-环(扩展数据图)。2B)。在dna-pkcs中，p环比mTOR更接近C叶.Dna-pkcs的p-环与Met3729的延伸侧链一起，创造了一条通向绑定口袋的更窄的路径，其效果可以通过atpγS-(Mg)的比较来显示。2+)2绑定模式(附图)2A，b)。虽然腺嘌呤在这两种结构中有很好的重叠，但由于p环的差异，核糖基和磷酸酯基有不同的结合模式(扩展数据图)。2B).

未来的抑制剂开发也可以通过我们的内部热点映射程序来指导。29。热点可以被定义为蛋白质中对小分子的整体结合做出重要贡献的区域。30。预测的DNA-PKcs催化中心热点图在中心有一个大的非晶区，与极性氢键供体和受体区并列(扩展数据图)。5A)。疏水核与ATPγS的腺苷结构以及抑制剂的中心杂环支架重叠。在这个疏水核附近可以观察到强极性区域，靠近p环，并与ATP磷酸基团结合位点重叠(扩展数据图)。5A)。在靠近催化环的ATP口袋的边缘可以看到第二个极地热点区域。值得注意的是，在本研究中研究的更有选择性的抑制剂AZD 7648和M 3814具有与该区域相接触的功能基团(扩展数据图)。5A，b)。由Thr 3811的侧链和Asn 3926的主链羰基介导的极性接触使化合物AZD 7648和M 3814分别采用与ATP、Wortmannin和NU7441不同的结合方式，在ATP结合槽外延伸(扩展数据图)。5B)。推测ATP口袋的这一部分，靠近催化环的相互作用，除了p环构象外，还可能进一步促进DNA-PKcs的选择性抑制。因此，在该活性位点的这一区域引入功能基团参与Asn 3926、Asn 3927、Thr 3811和Thr 3809，可能有助于进一步增强DNA-PKcs的选择性抑制作用。

此外，现在有可能获得高分辨率的dna-pkcs配体配合物的结构(扩展数据图)。6)，结构导向药物的发现可以利用dna-pkcs的其他特定小孔来开发具有更强效力和选择性的变构抑制剂或蛋白水解靶向嵌合(Protac)药物。31,32。Dna-pkcs的降解不仅消除了它的激酶活性，而且也消除了下游nhej和dna损伤反应信号所需的阶段。13,32,33。然而，不能保证PROTAC药物是有益的，因为以前的研究表明，抑制激酶活性比敲除或敲除更有效。34。尽管如此，经过优化的样品制备和报道的冷冻-EM结构，未来的药物可以进一步发展成为变构位点的靶点，而不是或除了保守的激酶催化核心，以获得更好的DNA-PKcs特异性。