基质力学通过调节丝素的动态定位来调节上皮对癌症的防御

在上皮细胞中，正常细胞通过竞争来识别和挤出新出现的转化细胞。这一过程是最基本的上皮防御癌症，其偶尔失败促进癌的发生。然而，对于决定这一辩护成败的因素知之甚少。在这里，我们报告了细胞外基质的机械强化削弱了上皮对hrA的防御能力。V12-转化细胞。通过光转换标记、蛋白质跟踪和功能缺失突变，我们将这种衰减归因于增强引起的细胞骨架蛋白丝素的核外固存。在模拟健康上皮的软基质上，丝素以动态的单种群形式存在，向正常细胞转化的细胞界面移动，启动转化细胞的挤出。然而，在类似纤维上皮的硬基质上，丝素再分配成两个动态不同的群体，包括一个新的核周池，它不能移动到细胞-细胞界面。基质刚度依赖于丝素cdc 42和丝素周围细胞骨架相互作用的差异控制这种独特的丝素定位，因此，决定了在软基质和硬基质上上皮防御的成败。综上所述，我们的研究揭示了在癌发生的最初阶段，病理基质的僵硬是如何导致上皮防御失败的。

在上皮组织的微生态系统中，面对转化细胞的不断发芽，上皮细胞表现出非凡的维持组织同源性的能力。1,2,3,4。一般来说，任何新出现的转化细胞都会被邻近的正常细胞从组织中主动挤压出来。2,3,5,6,7,8。这个过程是基本的免疫系统独立的上皮防御癌症(Edac)。1,2,4,9,10,11,12,13属于更大的组织质量控制过程，统称为细胞竞争。1,3。一般来说，细胞竞争是指两个细胞群体之间争夺空间的过程，其中“赢家”群体以非细胞自治的方式消除了“失败者”群体。它在果蝇翼上皮发育2,3,14，哺乳动物组织动力学15，皮肤发育16胸腺肿瘤抑制17。另一方面，EDAC专门指的是消除缺乏抑癌蛋白的转化细胞。18或表达癌基因的一种构成性活性形式，如hras。1,9,12,19。表达癌基因的转化细胞只有当这些细胞被正常的上皮细胞包围时，才会以根尖挤压或基底脱层的形式离开上皮层。9。重要的是，EDAC偶尔的失败会导致增生和癌症。1,2。尽管最近在发现EDAC分子分子方面取得了一些进展9,12,19,20关键的生化和生物物理因素决定了新出现的转化细胞是从组织中提取出来的，还是可以继续属于组织的？7.

然而，很明显，edac介导的移除转化细胞需要广泛重组周围正常细胞中的承载力细胞骨架元素，特别是在正常细胞和转化细胞之间的交界处。5,19,21,22,23。这些观测表明，EDAC可能存在机械调制。5,6,9,21,22,23,24,25。然后可以推测EDAC可能对组织微环境的力学特性(包括细胞外基质(ECM)刚度)作出反应，这一参数可能是决定EDAC成败的关键因素。事实上，基质刚度在晚期肿瘤的发生发展和转移中起着至关重要的作用。26,27,28,29。在此阶段，癌相关的增强促进细胞转化，破坏上皮的单层结构，在不受接触抑制的情况下增殖，并迁移出原发肿瘤。26,28。相反，基质刚度在包括EDAC在内的癌变初期的作用仍然是未知的。这种缺乏知识是令人惊讶的，因为人们应该期望在最初的转化事件中，基质刚度的影响非常明显，其中转化后的细胞仍然承受宿主组织微环境施加的调节。有趣的是，纤维化、过度活跃的伤口愈合、肥胖和衰老等病理条件都会导致组织僵硬，所有这些疾病都与高癌症风险相关。30,31。然而，这种预先存在的纤维组织或病理组织是否会影响EDAC的成功或失败，如果确实如此，那么连接的分子机制可能是什么呢？

在这里，我们发现矩阵力学是决定EDAC成败的一个关键的微观环境因素。我们进一步阐明了它的分子机制，特别证明了基质刚度依赖于丝素的胞内定位是调节EDAC的关键。

基体刚度对HRAS挤出的调节作用V12-EDAC中的转化细胞

首先，为了检验矩阵刚度是否真的能改变edac的结果，我们使用了一个建立良好的哺乳动物模型的edac。9,13,32(无花果)1A，b)并对满足健康和纤维上皮基质生理和病理弹性范围的不同刚度的ECM进行了EDAC实验。30,33(无花果)1C)。EDAC模型涉及正常上皮细胞与表达HRAS蛋白的转化细胞竞争和消除。V12)(图1.1A，b)。四环素诱导启动子控制HRAsV12表达，这使我们能够启动竞争过程时，打算。我们首先将正常或野生型上皮细胞(mdck-wt)和四环素诱导的gfp标记hras细胞混合在一起。V12稳定整合到基因组中(mdck-gfp-hras)V12)比例为40：1(附图)。1A)并在不含四环素的情况下培养这些种群的花叶单层。随后，在介质中加入一种稳定的四环素衍生物，多西环素，引发hra。V12诱导后30 min表达明显。HRASV12-转化后的细胞在3小时后开始聚集，大部分细胞在8至10小时内挤压出来(附图)。1B，补充录像1、图1.1B)。我们在六种不同刚度值的I型胶原包覆水凝胶基材上进行了实验，弹性模量为1.2、4、11、23、35或90 kPa。30,33(无花果)1C)。对于每个刚度，我们计算了HRAs的分数。V12-表达在诱导后6h产生的集落(见图)。1C)和诱导后4h(附图)。1C)并观察到，在比11 kPa更硬的衬底上，这一比例急剧下降(图1)。1C)。与此相关的是，这一结果不依赖于ECM蛋白涂层，因为我们在层粘连蛋白和基底膜提取物(BME)涂层上进行实验时，也观察到ECM刚度对EDAC有类似的抑制作用(附图)。1D)。因此，我们将1.2，4和11 kPa底物归类为“软”的，类似健康的上皮，以及23，35和90 kPa的底物为“刚性”模拟纤维上皮(图1)。1C)。有趣的是，以前的研究发现，在健康的上皮中，ECM的硬度从0.1 kPa增加到5 kPa，在纤维上皮中增加到25-100 kPa。34,35，证明了我们的分类和刚度转换值(>11 kPa)是正确的。我们进一步发现，突变细胞在没有多西环素的情况下，在软底物上的挤出率很低(附图)。1E)通过与强力霉素诱导挤出的比较，证实了HRAs的主动挤出。V12-在软底物上表达细胞。接下来，我们想知道转化后的细胞发生了什么变化，这些细胞没有在坚硬的基底上突出。这些细胞停留在单层，最终显示长的基底突起和明显的基底肌动蛋白纤维(见图)。1D)。这些特征在正常细胞中缺失。在诱导60小时后观察这些细胞时，我们注意到V12-转化后的细胞留在单层中，开始分裂，菌落尺寸扩大(附图)。1F，补充录像2)。为了进一步验证ecm刚度对edac的影响是否不是细胞特异性的，我们在正常人和hra之间进行了细胞竞争实验。V12-在另两种上皮细胞系Eph4和CaCO-2中表达细胞，分别在4 kPa(软)或90 kPa(刚性)ECM上生长。在这两种细胞系中，我们观察到明显较少的挤压集落的hra。V12-在90 kPa ECM上表达细胞，4 kPa ECM上表达细胞(附图)。1g)，巩固了我们观察到的MDCK细胞的一般性。这些结果表明，ECM刚度对EDAC相关细胞竞争的有效性有决定性的影响，其中刚性ECM抑制了转化细胞的消除。

aGFP-HRAS荧光图像V12在软基片(4 KPa)和硬基片(90 KPa)上表达菌落挤出XY-平面；接着是一幅插图，描绘用于量化挤压的视觉度量。表达gfp-hra的圆形细胞V12(如软ECM所见)被视为挤压。非挤压GFP-HRAsV12细胞与其他细胞保持在同一平面内，这在僵硬的ECM中很明显.(底板)黄色虚线在视觉上引导上皮表面XZ-飞机。GFP-HRASV12在软ECM表面挤压的细胞(顶)而在刚性ECM表面(底部)。白色箭头表示GFP-HRAsV12细胞。b表示转化单元挤压的不同阶段和EDAC的刚度依赖结果的图表。c描述GFP-HRAs分数的散点图V12在6 HPI时在不同刚度的基片上表达菌落。随着衬底刚度的增加，转化细胞的挤出率明显降低。计数的菌落数显示在每个酒吧内。数据平均为±S.E.M。收集了三个独立的生物复制体。统计学意义用mann-Whitney评估。t-试验(二尾)。p=2.8490e−08。d24 HPI时刚性ECM上非挤压集落的细胞骨架形态。白色箭头表示与HRAs相关的基底肌动蛋白纤维V12-刚性ECM(90 KPa)上的细胞，用AlexaFluor647-Phalloidin染色。镶嵌：用白色箭头指向的肌动蛋白纤维的黄色盒状区域的放大图。标尺=20μm(a，XY-view)，10μm(a，XZ-视图；d).

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纤维素在软基质和硬基质上的差异定位决定了EDAC的疗效

接下来我们将探讨刚性ECM抑制EDAC诱导的细胞挤出的分子机制。转化细胞的挤压需要重塑正常细胞中的肌动蛋白细胞骨架，这些细胞与前一种细胞直接接触。19,21,22,23。由于ECM刚度改变了许多力敏感的细胞骨架相关蛋白的细胞定位。36,37,38我们首先检查是否有肌动蛋白结合蛋白或肌动蛋白交联蛋白在正常细胞中软的和硬的ECM上有定位差异(补充图)。2)。一种肌动蛋白丝交联蛋白，FilaminA(FLNA，以下简称丝素)，是最有希望的候选蛋白。2A)，考虑到它在正常细胞中的刚度敏感的核周定位(如图所示)。2A，b，补充图。3A)。在软ECM上，丝素定位于细胞质和细胞-细胞界面，而在刚性ECM上，有相当一部分丝素分子定位于核周区域(图1)。2A，b，补充图。3A)。肌动蛋白反染色及随后的共聚焦显微镜(附图)。3B)和超微结构扩展显微镜(U-exm)39(无花果)2C，补充图。3C)表明核周丝素分子与核周肌动蛋白细胞骨架共同定位于刚性底物上。而以前的工作已经报道了丝素在正常细胞转化的细胞界面上的积累和正常细胞中丝素的耗竭，从而消除了EDAC。19，这种对刚度敏感的核周定位是一个独特的发现。与之相关的是，在刚性ECM上，丝素比软衬底上的界面局域化减弱，核周定位增强(图1)。2B)。接下来，我们询问这种丝素定位模式是否与EDAC有关。在正常细胞中与HRAs接口V12-表达细胞，丝素显示界面分数增加。2B)，表明在竞争中，丝素重新定位到细胞-细胞界面。19。因此，我们假设，刚性ECM上的核周丝素可能会隔离这个界面池，使很大一部分丝素无法用于EDAC。为了验证这一假设，我们在正常细胞中稳定地过表达丝素，以弥补刚性ECM界面分数的损失(图1)。二维空间, 左边)。丝素过度表达的细胞在刚性ECM上同时表现出清晰的界面和核周丝素池(图1)。二维空间, 左边，补充图。三维空间)。然后，我们量化了挤压HRAs的含量。V12-在丝素过度表达的正常细胞与HRAs竞争中表达集落。V12-表达细胞(图1.二维空间, 正确的)。丝素过度表达确实挽救了转化菌落在刚性ECM上的挤压，使EDAC对衬底刚度不敏感(图1)。二维空间)。最后，我们通过探索丝素在MDCK细胞中的定位，以及生长在层粘连蛋白或BME(补充图)的软硬ECM上，验证了丝素在软、硬ECM上的差异定位是非基质涂层的。3E)。我们还通过在Eph4和CaCO-2细胞中复制依赖于刚性的丝素定位来验证同样的细胞株特异性(补充图)。3F)。这些结果共同表明丝素在软、硬ECM上的差异定位在EDAC中起着至关重要的作用。

然后，我们进行了直接实验，研究了EDAC过程中丝素定位在软、硬ECM上的动力学，并阐明了EDAC期间丝素核周围固存对硬ECM的影响(见图)。2E，补充录象带3和4)。为此，我们在正常细胞中表达了绿色到红色可转换荧光蛋白mEos 2标记的适量丝素，并选择了至少与一种hra连接的mEos 2丝素表达细胞。V12-表达细胞。然后，我们将一个由mEos 2标记的丝素分子组成的群体从绿色变成红色，在细胞-细胞界面和细胞核之间的一个接近一半的位置(图1)。2E)。我们随后研究了在EDAC中那些光转换丝素分子的位置.在反复的光转换循环中，丝素分子总是移动到软ECM上的细胞-细胞界面(图1)。2E, 顶板，补充录像3)。然而，在僵硬的ECM上，光转换的丝素主要移动到核周围区域(图1)。2E, 底板，补充录像4)。此外，一组单独的光漂白实验表明，在刚性ECM上，丝素有两个动态不同的种群--界面和核周(附图)。3G，h)光漂白后的恢复速度。在刚性ECM上，核周粒子比界面基团更动态，恢复更快(附图)。3G，h)。通过对刚性ECM和软ECM中丝素种群动态的比较，发现刚性ECM上的核周池与软ECM上的界面种群非常吻合。3H)。这表明，从动力学的角度看，刚性ECM上丝素的核周居数与软ECM上丝素的界面布居数比刚性ECM上的界面布居数更相似。3H)。重要的是，光漂白实验并没有揭示丝素定位在软ECM上的任何动态分化，在软ECM上，一个显著的核周围群体无论如何都会缺失。固定细胞实验和动态实验都提供了一致的证据，证明核周细胞骨架的作用就像刚性ECM上的水槽，减少了EDAC在正常细胞和转化细胞之间的界面上可用的丝素分子的比例。因此，在刚性ECM中，正常细胞与转化细胞之间的相互作用不能启动转化细胞的挤出。

Cdc 42和核周细胞骨架鉴别丝素定位

接下来，我们询问哪些分子信号通路决定了在软和硬的ECM上的差异丝素定位。为此，小型Rhogtp酶cdc 42是String蛋白质相互作用数据库中最强的丝素结合蛋白之一，其相互作用评分高达0.979。Https://string-db.org/)。鉴于RhoGTPases在机械转导中起重要作用，我们推测Cdc 42对软ECM和刚性ECM是否有不同的激活作用。基于frster共振能量转移(Fret)的cdc 42活性传感器转移正常细胞40确实显示了cdc 42活性与刚度有关的差异(如图所示)。3A)。Cdc 42在细胞-细胞界面上的活性更广泛和更强(见图)。3B)软ECM比硬ECM。作为cdc 42活性的替代代表，对cdc 42激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子(Cff)tuba进行染色。41，还表明Cdc 42具有较高的界面活性。3C)。Tuba在细胞-细胞界面的定位在软ECM上明显比在刚性ECM上更为明显(图1)。3C)。然后我们询问丝素在软ECM上的界面定位是否是Cdc 42界面激活的结果。为此，我们用Cdc 42-活性抑制剂ML 141处理在软ECM上培养的正常细胞，并研究了丝素在这种抑制剂作用下的定位。三维空间)。本实验表明，在ML 141处理下，丝素的界面定位消失，而在软ECM上也出现一个微弱的核周丝素环(图1)。3D，e。补充图4A)。有趣的是，我们还可以通过反向操作在刚性ECM上诱导界面局域化，其中我们表达了一种构成活性的cdc 42。Q61L在一些细胞中(如图所示)。3F，补充图。4B)。与周围未转染的细胞相比，cdc 42Q61L-表达细胞在软的和硬的ECM上均显示丝素的界面定位增强。此外，在cdc 42中，刚性的ecm专一的核周丝素环也消失了。Q61L-表达细胞(图1.3F, 左边)。相反，cdc 42Q61L在刚性ECM上，其本身表现出明显的界面和核周局部化(如图所示)。3F, 中间)。因此，这些实验证明Cdc 42的活化驱动了丝素的界面定位，特别是在软电解加工上。然而，考虑到丝素和Cdc 42Q61L没有在核周区域共同定位(图)。3F, 正确的表明Cdc 42可能不直接影响丝素在刚性ECM上的核周定位。虽然这些实验描述了cdc 42和丝素之间的细胞自主相互作用，但细胞竞争是一个非细胞自主的事件。考虑到在竞争过程中丝素在正常细胞和转化细胞之间的聚集，我们询问Tuba是否也有类似的积累。在正常和hra之间的交界处确实促进了tuba膜的定位。V12转化的细胞，丝素积累的地方(补充图)。4C).

然后，我们询问了在僵硬的ECM上，是什么招募了丝状蛋白加入到核周细胞骨架中。在非上皮细胞中，rfilin家族蛋白FAM101B或refilinB通过与丝素结合而稳定核周肌动蛋白网络。42(无花果)4A，补充图。4D)。因此，FAM101B似乎是一个可能的候选人，招募丝素在硬的ECM核周细胞骨架。作为初步证据，我们确实发现在软ECM上，FAM101B分布在细胞质上(补充图)。4E)。然而，在硬的ECM上，它与丝素共同定位，主要在核周区域(补充图)。4E)。为了检验丝素-FAM101B相互作用是否与丝素的核周定位有关，我们产生了突变型丝素，FLNA-[19-22]或dnNA，只携带四个丝素重复序列。据了解，dnFLNA对内源性丝素与FAM101B之间的相互作用有明显的负效应。42。在正常细胞中稳定表达dnFLNA确实降低了内源性丝素的核周定位，增加了内源性丝素的界面库。4B，f)。此外，我们还产生了一个显性阴性的FAM101B(DnFAM101B)突变体。42缺乏丝素结合域之一的BD2。该突变体的稳定表达也降低了丝素的核周定位，增加了其界面库。4C，f)。这些实验表明，丝素-FAM101B相互作用在丝素对核周肌动蛋白细胞骨架的定位中起着至关重要的作用。有趣的是，核周肌动蛋白细胞骨架通过连接核骨架和细胞骨架的连接物连接到核层。这种连接使细胞外信号(如矩阵力学)能够直接传递到核力感应机器。43,44,45(无花果)4A)。实际上，使用了一个基于fret的分子张力传感器模块。46，插入LINC复合物蛋白Nesprint 1的中间，我们测量了较低的FRET效率(附图)。4F)。这一结果表明，刚性ECM的LINC复合张力高于软ECM(附图)。4F)。因此，我们询问细胞骨架-核骨架机械连接是否是丝素的刚度敏感的核周定位的一个关键因素。为此，我们首先通过破坏缺乏细胞骨架结合域的显性阴性nesprint 1(dnNesprint 1或nesprint 1-kash)的linc复合物，将核周细胞骨架与核层分离。44。在另一组实验中，我们用LaminB 1突变体(dnLaminB 1或XLaminB 1∆2+)破坏了核骨架。47拆除了核膜。因此，正常细胞稳定表达dnNesprint 1或dnLaminB 1(图1)。4D，e)内源性丝素核周定位降低(图1)。4F表明除了FAM101B的上游外，核周细胞骨架-核骨架的机械连接确实是丝素核周定位的关键因素。

a丝素结构的图式表示，描述其与FAM101B和F-actin的相互作用.丝素-FAM101B-肌动蛋白在核周空间的定位是通过配合物与LINC复合物的相互作用来实现的，后者响应于细胞外的作用力信号。B-EMhp-dnFLNA-MDCK的免疫荧光图像(英文)b)，MDCK-MApple-dnFAM101B(c)、MApple-dnNesprin1-MDCK(d)和MApple-dnLaminB1-MDCK(e)染成丝素。红色箭头表明界面丝素在刚性ECM上的局部化。标尺=10μm。f盒晶须图描绘了刚性(90 KPa)ECM上丝素平均荧光强度在核周和界面区域的平均荧光强度；n3个独立实验分别为56(模拟)、43(DnFLNA)、26(DnFAM101B)、30(DnNesprin1)和24个(DnLaminB 1)细胞。用一个未配对的学生来评估统计学意义t-韦尔奇校正试验(二尾)。重要价值：p=2.56898e−16，1.13087e−09(模拟-dnFAM101B)，6.35474e−09−-dnNesprin1，6.62199e−10(模拟-dnLaminB 1)。对于盒图，中线表示中间值，框显示中间四分位数范围，晶须表示范围不包括异常值(1.5×四分位数范围)。源数据(B-E)作为源数据文件提供。

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这些实验包括操纵Cdc 42活性，抑制FAM101B-丝素相互作用或破坏LINC配合物，为丝素的界面定位和核周定位提供了分子基础。他们进一步暗示，丝素-Cdc 42相互作用与丝素-核周细胞骨架相互作用之间可能存在微妙的竞争(补充图)。4G)。丝素-Cdc 42相互作用推动丝素分子向细胞-细胞界面方向移动，在软ECM上比在刚性ECM上更强(补充图)。4G)。相反，丝素-核周细胞骨架相互作用驱使它们向核周区域移动，在刚性ECM上比在软ECM上强(补充图)。4G).

刚性电解加工中EDAC的抢救

在确定了在刚性ECM上有利于丝素定位到核周细胞骨架的分子信号通路后，我们终于怀疑这种定位是否能恢复硬ECM上的EDAC。为此，我们产生了稳定表达改变的修饰正常细胞，从而消除了丝素的核周定位，增加了刚性ECM上的界面丝素(图1)。4B-E，补充图。5A)，包括dnFLNA、dnFAM101B、dnNesprin1或dnLaminB 1。我们创建了每个突变体三个克隆，以消除任何克隆特异性偏见(克隆A：图)。4B-E；无性系B和C：补充图。5F-I)。然后，我们测试这些细胞与增加的界面丝素是否能挤出转化的细胞在刚性ECM时，前者包围后者(图一)。5A)。在此实验条件下，我们确实观察到转化物在刚性ECM上的挤压明显增加。5B-E、补充图。5J-m)。例如，稳定的dnFLNA在HRAs周围的正常细胞中表达。V12-表达的殖民地确实拯救了HRAS的挤压V12-转化后的菌落在刚性ECM(图1.5B，补充图。5J)。同样，稳定表达dnFAM101B的正常细胞也能分泌hRAs。V12-表达集落，不论底物硬度如何，效果相同(见图)。5C，补充图。5K)。最后，在正常细胞中稳定表达dnNesprint 1或dnLaminB 1也可以挽救转化细胞在硬底物上的挤压(图)。5D，e；补充图。5L，m分别)。因此，所有四个突变体都降低了丝素的核周定位。4B-E通过干扰丝素-FAM101B相互作用(dnFLNA和dnFAM101B)或破坏核机制传导(dnNesprint 1和dnLaminB 1)，也使细胞竞争对ECM刚度或多或少不敏感(图1)。5B-E)。这些实验共同确定了丝素在刚性ECM上的核周定位，是导致EDAC在刚性ECM上失效的一个明确的分子原因，并提出了今后可能的治疗靶点。巩固我们的实验结果，我们发现并建立了矩阵力学作为一个关键的微观环境因素，决定了EDAC的成败，并阐明了基质力学调控EDAC的基本分子机制，从而整合了发生在多个长度尺度上的过程(图1)。5F).

多年来，各种研究都暗示或证明机械力可能是edac和细胞竞争各个阶段的关键因素，包括细胞-细胞感应、细胞重组和细胞挤出。1,5,6,21,24,25。这些研究进一步表明，在特定的组织和突变背景下，机械力可以对细胞竞争产生间接或直接的影响。5。例如，力可以通过调节细胞的形状和细胞-细胞界面的几何形状，间接地影响转化细胞的消除。21。或者，它们可以通过压缩‘失败者’细胞并触发其凋亡，直接诱导转化细胞的挤压。24。然而，由于细胞和细胞基质力在上皮组织中受到严格的调节，机械力对edac的作用可以简单地推断出上皮细胞密度的均匀度和上皮结构的限制。29,48。为此，先前的工作已经阐明了细胞-细胞连接在细胞竞争中的动态调节。21,22,23，细胞-基质相互作用的精确作用仍然难以确定。具体来说，大多数人猜测的是肿瘤微环境的作用。1并对EDAC的强度和结果进行了力学分析。为此，在寻找可能决定edac成功或失败的微环境因素的同时，我们的研究表明，异常强化的ecm阻止了edac介导的hras的消除。V12-上皮单层转化细胞(图1)。1A)。因此，ECM刚度成为肿瘤微环境调节基本免疫系统的一个关键力学参数--独立的EDAC(图1)。5F).

重要的是，在过去的二十年中，还出现了源自ECM的机械信号在干细胞分化和器官发生过程中对细胞的命运、形态和功能起着决定性作用。27,33,37,45,49,50。我们还知道，生物化学信号和机械信号的协同整合受组织硬化的影响，支持已发展的肿瘤的转移进展。5,27,28。例如，在经过充分研究的乳腺癌进展案例中，过度的胶原交联使基质变硬，破坏了乳腺上皮正常的腺泡结构，促进了浸润性表型，并在晚期癌变期突出突出。26,27。相反，我们的工作进入了一个以前未被探索过的领域，即现有的异常强化的微环境如何在癌发生的最初阶段失调EDAC。虽然我们的发现对edac和癌症的预防有几个重要的意义，但这种刚度敏感性在其他与edac相关的突变中，包括src激酶中的突变，一般还有待探讨。51和转录辅助激活剂YAP52,53。此外，鉴于我们的研究仅限于继发性上皮细胞株，我们还有待于观察其在原代细胞系中的作用机制。最后，人们会很感兴趣地问，这种僵硬的敏感性在体内是否是组织特异性的。

此外，与强化的ECM的起源有关，我们注意到纤维化、过度活跃的伤口愈合、慢性炎症、衰老和肥胖有一个共同的生理特征--组织基质异常僵硬，尽管在每一种情况下，硬化的根本原因可能是不同的。30,31。有趣的是，所有这些病理条件也与癌症风险升高有关。鉴于EDAC消除突变包被细胞的机制在病理强化的ECM上失败，人们很容易推测这些癌前细胞可能会留在组织中，获得更多的突变，并最终发展成为一个侵袭性肿瘤。事实上，在小鼠模型中，高脂饮食诱导的肥胖抑制了EDAC介导的HRAs的根尖消除。V12-肠和胰腺上皮转化细胞54。研究人员发现，这种抑制包括脂质代谢和慢性炎症。虽然他们推测免疫细胞和成纤维细胞分泌的可溶性因子可能影响正常上皮细胞与转化上皮细胞之间的竞争相互作用，但其分子机制尚不清楚。54。因此，炎症诱导的ECM刚度可能是这里的一个关键因素，特别是考虑到炎症过程中活性氧(ROS)的增加可以交联和加强ECM。

有趣的是，纤维上皮是异质性的，其中硬和软的ECM斑块可以安排在镶嵌方式。为了探索这种异质性如何影响EDAC，我们创建了一个混合ECM凝胶系统，其中一个4 kPa凝胶直接与90 kPa凝胶作为一个连续的凝胶表面(补充图)。6a，b，补充录像5)。在这种情况下，HRAV12-转化后的细胞位于离界面很近的地方，确实显示出明显的从ECM软到硬的迁移，可能是杜罗氏菌的迁移。此外，当它们迁移到更坚硬的一侧时，这些转化的细胞在强力霉素诱导后48小时的整个过程中仍停留在单层中。因此，这个实验表明V12-经历异质ECM刚度的转化细胞可以避开EDAC，迁移到一个更有利的物理微环境中。

分子方面的一个迫在眉睫的问题可能是了解Cdc 42-丝素相互作用在软ECM上的进一步上游，以及在刚性ECM上的核周细胞骨架-丝素相互作用。众所周知，由ECM刚性激活的整合素调节多种下游效应，包括粘着斑激酶(Afk)和rho-gtp酶，它们有助于肌动蛋白聚合和细胞收缩。55。因此，Cdc 42在软、硬ECM上的差异激活可能是差异整合素激活的结果。此外，刚度介导的细胞内蛋白定位的模式在这一领域具有很大的兴趣，我们在这里的工作为这一方向提供了一个方向。由于已知转录辅助激活剂Yap/TAZ作为ECM刚度的机械传感器44其在细胞内的差异定位可为丝素的刚度敏感差异定位提供线索。YAP/TAZ的胞质定位激活软ECM上的Cdc 4256，它可能导致cdc 42在细胞-细胞界面上的活性增强。这使丝素在软电解加工表面的界面局部化程度增加。另一方面，越来越多的证据也指出了核细胞骨架反应的耦合，这些反应调节通过linc复合物介导的从基质到核的力传递。43。因此，我们可以推测，刚性ECM激活与LINC复合物和FAM101B有关的核机械转导通路，调控丝素的核周围定位，这一点在我们的工作中已经被详细阐明。另外，值得注意的是，先前的一项研究表明，外力的应用会在独特的Ca中组装核周肌动蛋白。2+-和INF2-依赖于Form的方式57。有趣的是，最近的一项研究发现，钙波从将转化的细胞挤出到周围的正常细胞中爆炸性地传播，导致肌动蛋白在INF2依赖的途径中重组。32。考虑到这些结果，了解钙波在EDAC过程中如何与丝素依赖性通路相互作用将是很有趣的。考虑到cdc 42和formin活性共同决定了细胞的最终骨架结构，我们可以推测cdc 42丝素轴应该与Ca有一些有趣的交点。2+-INF2轴与EDAC有关。

最后，回到原来的微环境因素可能决定EDAC成功与否的问题，我们认为我们在此阐明的分子机制为防治EDAC提供了治疗的靶点。一些能够软化组织基质的分子已经在阻止转移进展的临床试验中。27。我们现在建议，这些分子也许也可以用来预防癌症。此外，从细胞基质粘附到LINC复合体等不同层次的力传递中断，可能会提供其他治疗方案，以降低患癌症的风险。总之，这项研究开辟了一种新的可能性，将机械医学策略应用于癌症预防，并打算向成功的EDAC倾斜平衡。