主要的

作为细胞类型特异性身份和功能的基本驱动因素，异常的TF代表了不同癌症类型之间的一类重要的遗传依赖性1。儿童癌症几乎没有全基因组突变，但通常包含改变TF蛋白的前哨突变2,3,4,5。突变型转录因子可以劫持野生型谱系特异性转录因子进入自我强化的前馈核心调节回路(CRCs)6,7,8,9,10,11,12,13,14。例如，MYCN在MYCN-腺泡状横纹肌肉瘤中扩增的神经母细胞瘤和Pax 3–foxo 1和Pax 7–foxo 1融合蛋白通过劫持肿瘤类型特异性CRC TFs促进肿瘤生长15,16,17,18,19。然而，还不知道携带突变型TF的不同癌症类型在多大程度上依赖于这种特定类型的电路。

尤文肉瘤是第二种最常见的儿童骨癌，其定义为特征性染色体易位，将RNA结合蛋白FET家族的基因成员与TF的ETS家族成员融合20,21。在85-90%的情况下，易位融合了EWSR1和FLI1编码EWS-FLI融合蛋白的基因。EWS-FLI蛋白在含有串联ETS 5′-GGAA-3′基序重复序列的微卫星上显示出作为从头增强子先锋的新形态能力22,23,24,25,26,27,28,29,30,31通过染色质修饰复合物的多聚化和募集，进而导致基因表达程序的改变20,32.

建立尤因肉瘤关键依赖性的努力已经优先确定了EWS-FLI的特定基因靶点。研究已经描述了细胞类型特异性的转录因子，它们被EWS-FLI激活并与之合作以加强致癌程序23,24,32,33,34,35,36,37,38,39，包括在CRC中40。然而，为了揭示尤因肉瘤特有的重要疾病机制，需要无偏见的系统方法。

在这里，我们描述了基因组规模的CRISPR–cas 9筛选的结果，揭示了野生型ETS TF ETS变体6(et V6；也称为TEL)是关键的尤文肉瘤选择性TF依赖性。我们在体外和体内验证了这种依赖性。与在其他癌症类型中增强突变TF致癌程序的选择性TF依赖性相反，ETV6的抑制活性抑制了肿瘤的生长EWS–FLI5′-GGAA-3′重复增强子基因激活促进尤文肉瘤生长。因此，我们发现了一种以前未描述的促进癌症的机制:致癌融合TF和“抑制性”抑制TF之间在染色质上的竞争。

结果

ETV6在尤文肉瘤中是一种选择性TF依赖性

我们最近报道了一项在儿科癌症细胞系(儿科癌症DepMap)中进行的基因组水平的CRISPR–cas 9功能缺失筛查，该筛查将转录激活因子鉴定为几种儿科癌症亚型中高度富集的一类选择性依赖性(特定癌症类型特有的遗传脆弱性)41。其中最具选择性的相关性是激活神经母细胞瘤和横纹肌肉瘤中的CRC TFs(图。1a和补充表格1–3).MYCN在神经母细胞瘤(PHOX2B、HAND2、ISL1和GATA3)的CRCs中涉及的TF15,16以及腺泡状横纹肌肉瘤中的Pax 3–foxo 1和Pax 7–foxo 1融合蛋白(MYOD1、MYOG、SOX8和MYCN)17,18构成了每种肿瘤类型特有的最强依赖性。相比之下，尤文肉瘤中的选择性TF基因依赖是转录抑制因子，包括已知的依赖BCL11B和ZEB2(参考文献。36, 37)，这是由EWS-FLI和以前的非典型依赖激活ETV6(图。1a和扩展数据图。1a).这些TF也在独立的屏幕上评分(扩展数据图。1b). ETV6在尤因肉瘤中没有复发突变42,43,44，以及ETV6依赖性与特定的EWS-ETS融合(即EWS-FLI或EWS-ERG)无关。1c). ETV6在19个基因集中的18个中，没有被定义为受EWS-FLI规范的基因(补充表4)并且在细胞系中没有表现出独特的表达模式(图。1a)或原发性肿瘤45(扩展数据图。1d和补充表格5)的尤因肉瘤。相比之下，成神经细胞瘤和横纹肌肉瘤中的CRC TFs表现出肿瘤类型特异性表达(图。1a)，就像BCL11B和ZEB2尤因肉瘤45(扩展数据图。1e和补充表格5).

图1:抑制性ETS TF ETV6在尤文肉瘤细胞中是一种选择性依赖。
figure 1

a，散点图描绘了在dep map CRISPR–cas 9屏幕中查询的18，333个基因。–日志10(q值)的浓缩(x轴)测量每种肿瘤类型依赖性的特异性41(尤因，n= 14;神经母细胞瘤，n= 20;横纹肌肉瘤，n= 11).–日志10(q值)的浓缩(y轴)测量每种肿瘤类型的基因表达的特异性74(尤因，n= 20;神经母细胞瘤，n= 28;横纹肌肉瘤，n= 18).TF基因84是红色的，并标有如果x> 8(除了ZEB2= 3.28).虚线显示–日志10(0.05). b上图:描绘用CRISPR–cas 9构建体靶向转导的A673尤文肉瘤细胞中平均细胞存活力±标准差的线图ETV6(sgETV6-1至sgETV6-4)或对照单导RNA(sgchr 2.2切割；sgLacZ非切割) (n= 8个生物重复，双向方差分析(ANOVA)，Dunnett多重比较，P调整后< 0.0001)。代表两个独立的实验。下图:蛋白质印迹显示具有GAPDH加载对照的ETV6。c，柱状图显示了甲基纤维素中A673细胞集落的平均标准差。ETV6损失减少了菌落数(单向ANOVA，n= 3个生物复制，Sidak的多重比较，P调整后< 0.0001)。代表两个独立的实验。d，用于研究ETV6的dTAG方法示意图。Ub，泛素；冯·希佩尔·林道·VHL。e，Western blot证明et V6–fkbp 12F36V–HA蛋白降解和内源性ETV6A673 ETV6基因敲除–用dTAG处理的dTAG细胞V-1或DMSO小时。左侧显示了亲代A673裂解物。代表一个实验。f，柱状图显示了甲基纤维素中A673 et V6–dTAG细胞集落的平均±标准差数量(n= 3个生物重复，双尾t-测试，P < 0.0001). Represents two independent experiments. g，用DMSO或dTAG处理72小时的A673 et V6–dTAG细胞的细胞周期分析V-1 (n= 3个生物重复，双尾t-test，Sidak的多重比较；G1/G0期，P调整后= 5.20 × 10−8；s期，P调整后=4.16 × 10−7).代表两个独立的实验。h左图:肌内植入的A673细胞的蛋白质印迹。右图:平均全身生物发光量(n=每种条件下5只小鼠，生物复制)。与sgChr2.2相比，ETV6缺失降低了肿瘤生长(双向ANOVA，Tukey多重比较；sgETV6-1，P调整后= 0.0363；sgETV6-2，P调整后= 0.0254)。i离体切除的肝和肺的平均s.e.m. log(生物发光)测量值(n= 5).sgLacZ肝脏表现出比sgETV6-1更强的生物发光(Kruskal–Wallis检验，Dunn的多重比较；P调整后= 0.0418)或sgETV6-2肝脏(P调整后= 0.0028)。sgLacZ肺表现出比sgETV6-2更强的生物发光(P调整后= 0.0333)而不是sgETV6-1肺(不显著(NS)，P调整后= 0.2763)。密钥与相同h.

源数据

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我们验证了一个ETV6通过CRISPR–cas 9破坏对三种尤文肉瘤细胞系A673、EW8和TC32的依赖性。的损失ETV6体外细胞生长减少(图。1b和扩展数据图。1f)和在甲基纤维素中减少的非贴壁生长(图。1c和扩展数据图。第一代).我们建立了生化dTAG方法46,47通过精确的时间控制来干扰ETV6的丰度，而不会引起急性DNA损伤。FKBP12F36V-标记的蛋白质在暴露于dTAG小分子dTAG后会急剧降解V-1，其招募冯·希佩尔-林道E3连接酶来泛素化FKBP12F36V(参考46).在尤文肉瘤细胞系A673和EW8中，我们外源性表达了羧基末端标记有FKBP12的ETV6F36V和人流感血凝素(HA)表位(图。1d).同时，我们剔除了内源性的ETV6使得FKBP12F36V-标记的ETV6构成ETV6蛋白的主要形式。et V6–fkbp 12F36V降解减少了不依赖锚定的生长(图。1e，f和扩展数据图。1h).ETV6的降解(图。第一代和扩展数据图。2a)以及CRISPR–cas 9介导的内源基因敲除ETV6在亲代A673细胞中(扩展数据图。2b)导致G1/G0细胞周期停滞，但不诱导凋亡(扩展数据图。2c和补充图。1).

在体内，CRISPR–cas 9介导的基因敲除ETV6减少皮下TC32肿瘤的生长(扩展数据图。2d).使用原位样小鼠模型，其中后肢肌内植入的A673尤文肉瘤细胞能够转移48，我们观察到ETV6缺失降低了原发性肿瘤的生长(图。1h).ETV6缺失减少了肝组织转移(图。1i左)，并且肺组织在两个中的一个中显示出相同的趋势ETV6淘汰条件(图。1i，对)。

接下来我们问ETV6的DNA结合域(DBD)是否对其功能至关重要。我们淘汰了内源性ETV6和外源表达的野生型ETV6或者突变ETV6带有C-末端DBD缺失，这阻止了ETV6与染色质的结合并部分阻碍了其核定位。这一结果与ETV6蛋白核定位信号位于其C端的报道一致49(扩展数据图。2e).而野生型ETV6表情获救ETV6敲除，突变体的表达ETV6没有(扩展数据图。2f)，这表明ETV6对染色质的特异性活性对其在尤文肉瘤中的功能至关重要。

ETV6和EWS-FLI在全基因组范围内共占据基因座

ETV6和EWS-FLI拥有ETS家族DBD，其识别共有的5′-GGA(A/T)-3′基序。因此，我们询问它们是否共同定位在染色质上。我们利用靶下切割和标记(切割和标记)分析了亲代A673细胞的内源性ETV6结合位点50和概要et V6–fkbp 12F36V–et V6–dTAG细胞中的HA结合位点，使用抗HA染色质免疫沉淀和测序(ChIP-seq)。这些分析定义了ETV6结合位点的一致列表(扩展数据图。3a和图。2a).dTAGV-1处理降低了dTAG模型中染色质上的ETV6丰度(图。2b和扩展数据图。3b).在亲代尤文肉瘤细胞中，我们进行了组蛋白H3赖氨酸27乙酰化(H3K27ac)芯片-序列分析，并分析了公开的组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)芯片-序列数据26注释ETV6绑定站点。结果表明，这些位点出现在活性启动子和增强子(图。2c和扩展数据图。3c).我们通过免疫沉淀C末端FLI1结构域，对A673和EW8亲代细胞中的EWS-FLI进行了ChIP-seq。这是鉴定EWS-FLI结合位点的公认方法，因为野生型FLI1通常不在尤因肉瘤细胞中表达39,43。EWS-FLI在两个模型中普遍结合在ETV6结合位点(图。2c和扩展数据图。3c)，尽管共同占据的结合位点仅占全部EWS-FLI结合位点的一小部分(图。2d和扩展数据图。三维（three dimension的缩写）).EWS——FLI在GGAA重复微卫星上率先发现闭合染色质27，包括重复四次或更多次26。在尤因肉瘤中，ETV6定位于这些较长的连续GGAA重复序列的频率高于B淋巴细胞或K-562白血病细胞51,52，这表示ETV6 (P < 2.2 × 10−16)(图。2e和扩展数据图。3e).

图ETV6的急性丢失导致EWS-FLI结合增加。
figure 2

a–c的热图显示了以3，309个共有ETV6结合位点为中心的3-kb窗口，通过转录起始位点(TSS)的2.5 kb内的重叠进行了亚绘图，并且峰通过最大高度排序。a左图:A673亲代细胞中内源性ETV6的切割和标记(C&T)。右图:抗HA芯片-et V6–fkbp 12的序列F36V–EW8 et V6–dTAG单元中的HA。b在用DMSO或dTAG处理的A673 et V6-dTAG细胞中，抗HA切割和标记V-1小时24小时c，从左至右:内源ETV6切割和标记，EWS-FLI芯片-序列，H3K27ac芯片-序列和公开的H3K4me3芯片-序列26在A673细胞中。d维恩图显示了在A673细胞中ETV6共有结合位点与30，030个EWS-FLI结合位点的基因组位置。e堆积柱形图，显示了在结合位点出现的不同长度的串联5′-GGAA-3′基序重复序列，通过(从左到右):(1)亲代A673细胞中的内源性ETV6切割和标记；(2)et V6–fkbp 12F36V–HA芯片A673 ETV6中的序列–dTAG单元；(3)亲代A673细胞中的EWS-FLI芯片-序列；(4)et V6–fkbp 12F36V–HA芯片EW8 ETV6中的序列–dTAG单元；(5)亲代EW8细胞中的EWS-FLI芯片序列；(6)和(GM12878 B淋巴细胞中的内源性ETV6芯片-seq51,52；和(8)K-562慢性髓性白血病细胞中的内源性ETV6 ChIP-seq52。显示了每个数据集中结合位点的数量。与B淋巴细胞ETV6相比，ETV6在尤因肉瘤中与大于4个GGAA重复的百分比更高(2018) (A673 ETV6 C&T，P < 1 × 10−300；A673 ETV6芯片-序列，P= 5.41 × 10−214；和EW8 ETV6，P= 1.34 × 10−18；费希尔精确测试)。f，柱状图显示了在ETV6降解后6或72小时表现出显著改变的EWS-FLI结合的基因组区域的数量，et V6降解由CSAW (CSAW，使用edgeR广义线性模型；P < 0.05)89。FLI1 up网站显示EWS-FLI结合增加。FLI1羽绒部位显示EWS-FLI结合减少。g,h、EWS–FLI和H3K27ac芯片的热图-seq在EW8 et V6–dTAG中执行(g)和A673 et V6–dTAG电池(h)在DMSO或dTAG后6小时V-1次治疗。显示显著改变的EWS-FLI结合的基因座通过改变的方向(向上或向下)和与TSS、增强子或两者都不重叠而被细分。使用亲代EW8中的H3K27ac ChIP-seq确定增强子的位置(g)和A673(h)细胞。i中所示区域的FLI1结合元图g和h.

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失去ETV6增加了EWS-FLI的占用率

我们接下来问ETV6的缺失是否会改变EWS-FLI染色质的占有。我们降解了ETV6并通过ChIP-seq在6和72小时描绘了EWS-FLI结合。在6小时，在两个dTAG模型中，EWS-FLI占据的显著改变主要构成了结合的增加(图。2f).在72小时，变化更加动态，表现出增加和减少(图。2f).我们根据位点在6小时时是否获得或失去EWS-FLI结合，以及它们是否出现在转录起始位点(TSS)或H3K27ac确定的增强子上来对位点进行分类(图。2g，h).失去EWS-FLI结合的地区变化程度不如获得结合的地区大(图。2i).因此，ETV6的缺失导致了EWS-FLI结合的急剧增加，这为这些TF竞争结合的假说提供了支持。此外，在两种模型中，H3K27ac在6 h时的芯片序列(图。2g，h)展示了在获得EWS-FLI结合的增强子区域H3K27ac丰度的适度增加(扩展数据图。3f).

在串联的5′-GGAA-3′重复序列中，不同的EWS-FLI结合是高度动态的。3g).值得注意的是，与失去EWS-FLI结合的区域相比，获得EWS-FLI结合的基因组区域更可能包含2、3或4个基序的较短串联重复(P < P= 6.974 × 10−15).对于单个GGAA基序或> 4个GGAA重复序列，没有观察到一致的差异。

ETV6是尤文肉瘤中的转录抑制因子

我们接下来描述了ETV6调控的基因，et V6是一种报道的转录抑制因子53,54,55,56,57。我们在用二甲亚砜(DMSO)或dTAG处理后6、24和72小时，在两种dTAG模型中进行RNA测序(RNA-seq)V-1(图1e和扩展数据图。4a).总体而言，每个工程化dTAG细胞系的表达谱与其相应的亲代细胞系的表达谱近似(扩展数据图。4b).在6小时，大多数差异表达的基因上调，这表明ETV6在尤文肉瘤中主要作为转录阻遏物(图。3a).ETV6降解后，ETV6强抑制基因的表达随时间增加(图。3b).我们观察到dTAG模型之间调控基因的一致性(扩展数据图。4c)并鉴定了一组共有的85个ETV6抑制基因(图。3c和补充表格6).我们在用下列物质转导的亲代A673细胞上进行RNA-seqETV6CRISPR敲除(图。三维（three dimension的缩写）和扩展数据图。4d).结果显示，85个基因中的大多数也受到野生型ETV6(P= 2.66 × 10−20).与ETV6在活性启动子和增强子上的定位一致，et V6-阻遏的基因被表达并且没有完全沉默(扩展数据图。4e).此外，ETV6结合位点富含ETV6调节基因(图。3e和扩展数据图。4f).

图3: ETV6主要是尤文肉瘤中的转录阻遏物。
figure 3

a，用DMSO或dTAG处理的A673 et V6–dTAG和EW8 et V6–dTAG细胞中的RNA-seq火山图V-1用于6小时和72小时(n= 3个生物重复)。红色表示基因在dTAG中上调V-1-处理过的细胞(DESeq2 Wald试验Benjamin I–hoch BergP调整后< 0.05；A673:n= 6h时为423，72 h时为2，554；EW8:n= 6小时时为123，72小时时为1，614)。蓝色表示基因在dTAG中下调V-1-处理的细胞(P调整后< 0.05；A673:n= 6小时为221，72小时为2，556；EW8:n= 6小时时67，72小时时1，208)。b，行标准化RNA序列日志2(每百万转录本(TPM)+1)A673 et V6–dTAG细胞中25个差异最大的受抑制基因的热图，根据6小时数据确定，排序如下P价值(DESeq2P调整后< 0.05并记录2(褶皱变化)> 1.5)。c左上:在6小时(P调整后< 0.05)，鉴定出85个常见的et V6-阻遏基因。底部:行标准化的RNA序列日志2(TPM+1)A673 ETV6–dTAG和EW8 et V6–dTAG细胞中85种常见et V6抑制基因的热图。d。行标准化日志2(TPM+1)85个et V6-阻遏基因的RNA-seq热图，如所示排序c，在用CRISPR–cas 9载体转导的亲代A673细胞中，使用这种方法鉴定53个et V6-阻遏的基因(单侧超几何检验，P= 2.66 × 10−20). e上图:A673 ETV6–dTAG和EW8 ETV6–dTAG细胞中et V6结合基因富集et V6调节基因的基因集富集分析(GSEA)图。ETV6结合基因在A673细胞中由CUT&Tag和ChIP-seq定义，在EW8细胞中由ChIP-seq定义。ETV6调节基因由24小时RNA-seq定义。下图:ETV6抑制核心富集基因的RNA-seq热图。ES，浓缩分数；FDR，错误发现率；NES，标准化浓缩分数。时间和治疗的颜色编码与中的相同c. f，MSigDB c2途径的组合富集图，显著富集由RNA-seq定义的et V6-阻遏基因，在24小时，两种模型共有(超几何富集试验，P < 0.05). Gene sets are ranked by significance. Dot size indicates the number of genes in the overlap between the gene set and common ETV6-repressed genes at 6, 24 and 72 h (85, 251 and 832 genes, respectively). Missing dots indicate non-significance. ‘EWS–FLI’, ‘HDAC’ and ‘Lineage’ gene sets characterize genes regulated by EWS–FLI, genes regulated by histone deacetylase enzymes, and genes underlying tissue-specific development or function, respectively.

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ETV6是与神经和间充质谱系正常发育相关的主TF58,59。发育谱系特异性基因集中富含ETV6抑制基因(图。3f和补充表格6–11)和ETV6激活基因(扩展数据图。第四代移动通信技术和补充表格12–17).ETV6受抑制的基因，而不是激活的基因，被组蛋白去乙酰化酶(hdac)调控的基因高度富集，这可能反映了ETV6募集hdac的能力54,60,61,62,63。我们还观察到ETV6调节基因中EWS-FLI调节基因的强烈富集(图。3f)，与它们在染色质上的共定位一致。

ETV6的缺失改变了基因表达和染色质状态

接下来，我们试图将ETV6降解后染色质的位点特异性改变与差异基因表达联系起来。EWS-FLI结合在单个位点的改变在6小时持续到72小时，并且这些改变在dTAG模型之间相关(图。4a).一致地，获得EWS-FLI结合的基因座表现出最大程度的EWS-FLI结合差异；失去EWS-FLI结合的基因座在数量上表现出较小的变化(图。4a).这种模式与EWS-FLI结合位点H3K27ac丰度的变化相平行(图。4b和扩展数据图。5a)和染色质可及性的改变(图。4c).我们将EWS-FLI结合位点分配给附近的基因，并检测ETV6缺失后它们的表达(图。4d).获得或失去EWS-FLI结合的基因分别表现出显著增加或减少的表达(P < 1 × 10−10)，前一类基因平均表现出最大程度的变化(图。4d和扩展数据图。5b).因此，ETV6缺失最深远的后果是EWS-FLI结合增加，染色质开放和基因表达增加。

图4: ETV6抑制EWS-FLI诱导的基因表达。
figure 4

a–c，线条表示皮尔逊相关；皮尔逊相关值(R)显示。a，左侧和中间:对数的散点图2(折叠变化)在DMSO或dTAG后6和72小时的EWS-FLI结合V-1在A673和EW8 ETV6-dTAG细胞中的处理(n= 2个生物重复)。右图:比较模型的散点图。b，散点图对比日志2(倍数变化)在A673 et V6–dTAG细胞中通过6 h ChIP-seq检测到的FLI与H3K27ac的结合丰度(n= 2个生物重复)。c，散点图对比日志2(倍数变化)在转座酶可及染色质测序(ATAC-序列)实验的分析中的EWS-FLI结合(n= 3次生物复制),在A673 et V6–dTAG细胞中72小时。d，比较从改变的EWS-FLI结合位点绘制的基因图(CSAW，n= 2个生物复制)来记录2在A673 et V6–dTAG细胞中通过RNA-seq测量的表达(倍数变化(n灰色方框表示中间值、第一和第三四分位数。红色菱形和误差线表示平均值±标准偏差(向上翻转，n= 148，均值= 0.98；向下翻页，n= 542，均值=–0.19；没有变化，n= 4585，均值= 0.028)。P使用成对计算的值t-测试，本杰明-霍赫伯格校正。e,f，Gviz生成的视图FAS–acta 2 (e)和TRIB1 (f)loci。ETV6轨道显示et V6–fkbp 12的切割和标记F36V–A673 et V6–24小时dTAG细胞中的HA。FLI1轨迹显示EWS–FLI在6小时时的ChIP-seq，H3K27ac轨迹显示H3K27ac在6小时时的ChIP-seq，ATAC轨迹显示ATAC在72小时时的ChIP-seq。FLI1(EW8)轨迹显示EW8 et V6–dTAG细胞中EWS–FLI在6小时时的ChIP-seq。GGAA轨迹指示串联GGAA基序重复的位置。g上图:柱状图显示了用CRISPR–cas 9构建体靶向对照(sgChr2.2)转导的A673 et V6–dTAG细胞中的qPCR或EWS-FLI并用DMSO(黑)或dTAG处理24小时V-1(红色)。条形表示平均值2∏Ct关于n= 2个生物复制品，每个代表技术上三个复制品的平均值。h，Western blot A673 et V6–dTAG细胞显示于g用DMSO或dTAG处理V-1表示96小时。

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增加EWS-FLI占有率上调基因表达

我们被击倒了EWS-FLI在A673 ETV6–dTAG细胞中，评估EWS–FLI基因的缺失是否会改变et V6基因的表达。federation of american scientists 美国科学家联合会, ACTA2, TRIB1和SEMA5B被鉴定为et V6-抑制基因，在et V6-空出的位点表现出增加的EWS-FLI结合、H3K27ac和染色质可及性，其中一些出现在GGAA重复序列(图。4e，f和扩展数据图。5c).我们将这些基因与BCL11B因为它被EWS-FLI激活，但不被ETV6抑制，并且在ETV6丢失后没有表现出EWS-FLI结合的改变(扩展数据图)。5d).定量PCR (qPCR)证明ETV6的降解导致ETV6抑制基因的上调，而不是BCL11B(图。第四代移动通信技术顶部图)。EWS-FLI敲除显著降低ETV6抑制基因的上调(图。第四代移动通信技术底部曲线)。免疫印迹证实mRNA上调的减弱也影响蛋白质水平(图。4h).因此，ETV6和EWS-FLI对立地监管federation of american scientists 美国科学家联合会, ACTA2, TRIB1和SEMA5B表情。

ETV6在临床相关的尤文肉瘤模型中功能相似

成熟的癌细胞系可能使用与原发性肿瘤细胞不同的生物学机制。因此，我们在两个新衍生的尤文肉瘤细胞系中测试了我们发现的相关性:CCLF PEDS 0009T(peds 0009)和CCLF PEDS 0010T(peds 0010)64. ETV6敲除损伤了体外细胞生长和甲基纤维素中的集落形成(图。5a、b和扩展数据图。6a、b).此外，我们检测了来自最小传代的尤文肉瘤患者来源的异种移植物(PDX): ES-PDX-001(参考文献。65, 66).再次击倒ETV6体外细胞生长受损(扩展数据图。6c).在PEDS0009细胞中，我们观察到ETV6和EWS-FLI在先前定义的EWS-FLI共有结合位点结合(图。5c).与我们的细胞系数据一致，ETV6与GGAA微卫星结合(图。5d)，ETV6的丢失导致在细胞系中EWS-FLI占据率增加的相同位点上EWS-FLI结合增加(图。5e–g和扩展数据图。6d，e).与失去EWS-FLI的区域相比，获得EWS-FLI结合的基因组区域更可能含有较短的2、3或4的GGAA重复序列(扩展数据图)。6f) (P= 5.186 × 10−11).在最小传代细胞中的这些观察结果与来自成熟细胞系的数据一致。

图5: ETV6在临床相关的尤文肉瘤模型中与EWS-FLI竞争结合。

a,b新衍生的尤文肉瘤细胞系PEDS0009(a)和PEDS0010(b)CRISPR–cas 9淘汰赛之后ETV6(红色)或者EWS-FLI(蓝色)与sgChr2.2和sgLacZ质控品(黑色)相比。线形图显示平均细胞生存力n= 6个生物重复)；击倒ETV6和EWS-FLI与sgChr2.2相比，两种细胞系的生存力都降低(双向ANOVA，Tukey的多重比较，P调整后< 0.0001)。柱状图显示平均细胞集落数n= 3个生物复制品)；ETV6和EWS-FLI敲除减少PEDS0009细胞中的集落数量(单向ANOVA，Tukey多重比较，P对所有显示的比较调整< 0.0001)和PEDS0010细胞(sgLacZ对sgETV6-1，P调整后= 0.0161，sgETV6-2，P调整后= 0.0029，sgFLI，P < 0.0001; sgChr2.2 versus sgETV6-1, NS P调整后= 0.1120，sgETV6-2，P调整后= 0.0182，sgFLI，P调整后= 0.0003)。c热图显示了以3，309个共有ETV6结合位点为中心的3-kb窗口，通过2.5 kb TSS内的重叠进行子绘图。用sgChr2.2对照CRISPR–cas 9构建体转导PEDS0009细胞，并通过CUT&Tag进行分析以检测内源性ETV6(左)，并使用核酸酶(CUT&RUN)进行切割和释放以检测EWS–FLI(中)和组蛋白标记H3K4me3(右)。d的堆积柱形图显示了PEDS0009细胞中ETV6(左)和EWS-FLI(右)结合位点出现的不同长度的串联5′-GGAA-3′基序重复序列。e对数的散点图2ETV6降解72小时后A673 et V6–dTAG细胞中EWS–FLI结合的(倍数变化)y轴)与CRISPR–cas 9转导的PEDS0009细胞相比ETV6 (x轴)。线表示皮尔逊相关；皮尔逊相关值(R)显示。f，在控制或中执行的FLI1切割和运行的热图ETV6敲除PEDS0009细胞。图中定义了所示的基因座。2h在A673 ETV6–dTAG细胞et V6缺失后EWS–FLI结合增加的区域。g、对照中FLI1结合的元图或ETV6在基因组区域敲除PEDS0009细胞，如所示f(上)。FLI1在图中定义的基因座结合的元图。2g在EW8 ETV6–dTAG细胞中et V6降解72小时后，显示EWS–FLI结合增加的区域。

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ETV6和EWS-FLI对抗SOX11功能正常

我们接下来询问EWS-FLI和ETV6之间的拮抗关系是否是尤文肉瘤细胞依赖ETV6的原因。几乎一半富含ETV6抑制基因的基因组与发育途径相关(扩展数据图。7a和补充表格18)，其中46项包括SOX11(补充表格19). SOX11表达对癌细胞的存活、生长和转移产生上下文相关的影响67,68. SOX11在套细胞淋巴瘤中作为一种癌基因69并促进乳腺癌的转移70,71。相反，它也减少前列腺癌的增殖和转移72并诱导神经胶质瘤细胞的分化73。在尤文肉瘤细胞中，外源性表达SOX11细胞生长受损，而DBD缺失突变体的表达没有(扩展数据图。7b).这些结果为SOX11活性的肿瘤抑制作用提供了支持。

我们在远端增强子处观察到不同的EWS-FLI结合SOX11作为最近表达的基因(图。6a，左)。来自癌细胞系百科全书的RNA-seq数据74表明邻近的基因，SILC1和LOC400940，在尤文肉瘤中不表达。这种增强子出现在串联GGAA重复序列中，并在ETV6缺失后表现出增加的EWS-FLI结合、H3K27ac丰度和染色质可及性(图。6a，对)。RNA-seq证实SOX11被ETV6-FKBP12抑制F36V在dTAG细胞中以及通过亲代A673细胞中的内源性ETV6(扩展数据图。7c).EWS——FLI是必需的SOX11ETV6丢失后上调(图。6b，c).击倒SOX11在A673 et V6–dTAG电池中(图。6d)挽救了ETV6降解的影响(图。6e).此外，淘汰SOX11在A673和TC32细胞中(图。6f和扩展数据图。7d)获救ETV6敲除(图。6g和扩展数据图。7e，f).在体内，我们在作为小鼠皮下肿瘤生长的TC32细胞中观察到拯救(图。6小时).这些发现支持了ETV6依赖是尤文肉瘤细胞特有的假设，因为ETV6抑制了EWS-FLI激活SOX11表情。

图ETV6阻遏基因的敲除SOX11拯救ETV6缺失的表型。

a，左图:Gviz生成的SOX11轨迹。顶部四个轨迹显示A673 ETV6–dTAG单元中生成的数据:et V6、24 h ETV6-FKBP12F36V–HA切割和标记；FLI1，6h EWS-FLI芯片-序列；H3K27ac，6 h H3K27ac芯片-seq；ATAC，72 h ATAC。FLI1 (EW8)显示了EW8 et V6–dTAG单元中的6h EWS–FLI芯片序列。ETV6 (PEDS0009)和FLI1 (PEDS0009)在PEDS0009单元中分别显示ETV6和EWS-FLI的剪切和标记。GGAA显示串联GGAA基序重复序列。红色箭头表示分配给的增强器区域SOX11，最近表达的基因；SILC1和LOC400940没有用灰色表示和标注74。右图:增强器的放大图。b, SOX11通过qPCR的表达，如图。第四代移动通信技术. c中所示的细胞的蛋白质印迹b在96公顷，EWS-FLI，GAPDH带也显示在图。4h. d在DMSO或dTAG中培养的sgChr2.2转导的或sgSOX11转导的A673 et V6–dTAG细胞的蛋白质印迹V-1.代表两个独立的实验。e，左侧:单元格在d沾有结晶紫。右上:柱状图显示了每个孔的中值染色强度的平均值±s . e . m .(单向ANOVA，n= 3个生物重复，Sidak的多重比较；DMSO与dTAGV-1个sgChr2.2，P调整后< 0.0001，sgSOX11，P调整后= 0.0459；sgChr2.2与sgSOX11 dTAGV-1, P调整后< 0.0001)。右下:比较dTAG的相对中值强度V-1-用DMSO处理的孔处理(双尾t-测试，n= 3,P < 0.0001). Represents two independent experiments. f联合用CRISPR–cas 9构建体转导的TC32细胞的蛋白质印迹。代表一个实验。g描绘平均体外存活力的线图(n= 6个生物复制，标准误差较小，无法描述)f. ETV6与对照(黑色)相比，单独敲除(红色)降低了生存力(双向ANOVA，Tukey多重比较，P调整后< 0.0001)。同时发生的ETV6和SOX11与相比，敲除(蓝星)不会降低生存能力SOX11单独击倒(灰色)(NS，P调整后= 0.8847)并表现出比ETV6单独击倒(红色) (P调整后< 0.0001)。h左图:描绘平均皮下肿瘤体积(mm3)s.e.m .(n= 6个肿瘤，生物复制)，由中所示的细胞形成f. ETV6单独敲除减少了肿瘤体积(双向ANOVA，Tukey多重比较，P调整后< 0.0001)。同时发生的ETV6和SOX11敲除没有减少肿瘤生长(NS，P调整后= 0.9892)并显示出比ETV6单独击倒(P调整后< 0.0001)。右图:每种情况下的代表性肿瘤。

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最后，我们问共同监管是否在SOX11到了2005年，EWS-FLI可能会重演EWS-FLI的异位表达.在横纹肌肉瘤RD细胞中，我们外源性表达了野生型EWS-FLI或EWS-FLI的R340N DNA结合突变体，它们不能结合DNA75。SOX11蛋白的表达是由野生型EWS-FLI诱导的，而不是突变型。7g).击倒ETV6进一步上调野生型EWS-FLI的SOX11丰度，但不包括突变型EWS-FLI的表达(扩展数据图。7g).这些发现表明，EWS-FLI的DBD是其激活所必需的SOX11表达，一种被ETV6抑制的活动。

讨论

在这项研究中，我们发现了儿童癌症尤文肉瘤的致癌机制。我们证明ETS TF ETV6在尤文肉瘤中是一种选择性依赖，因为它拮抗ETS基序上EWS-FLI的转录活性。据我们所知，这份报告首次描述了染色质上融合TF的转录抑制是肿瘤生长的关键驱动力。

尽管先前的研究已经描述了特定的转录因子作为增强尤文肉瘤中EWS-FLI转录程序的依赖性32,33,34,35,37，包括在CRC中40在DepMap筛选中，这些靶标没有被鉴定为选择性基因依赖性。相反，我们发现ETV6抑制EWS-FLI活性，这突出了一种独特但同样重要的表观遗传机制，这种机制驱动肿瘤生长，并揭示了尤文肉瘤和其他儿童肿瘤之间意想不到的差异，在这些肿瘤中，CRC在功能上占主导地位。

癌细胞经常利用正常发育的基础机制76。EWS-FLI和ETV6在尤文肉瘤中的竞争与ETS TF在发育过程中控制细胞命运决定的竞争机制相似果蝇。人Ets-1的激活直向同源物Pointed与ETV6的抑制直向同源物Yan竞争结合特定增强子内的Ets基序，以调节不同组织中关键分化基因的表达77,78,79,80,81。在这里，我们描述了一个相似的机制，该机制在癌症中被增选来调节融合TF的转录输出。

除EWS-FLI外，ETS TFs的表观遗传活性可能导致ETV6缺失的表型。值得注意的是，ETV7，的同系物ETV6，在尤文肉瘤细胞中不表达(补充表20)，我们没有观察到ETV6缺失的其他ETS TFs表达的强烈变化。一个基因表现出的最大变化大约是三倍，在评估的模型中，只有五个基因表现出显著的表达变化。此外，在尤文肉瘤的DepMap中，没有一个表现出表达变化的基因被评分为依赖性或肿瘤抑制基因。

尽管大多数人类TF家族包含在不同细胞类型中共表达的旁系同源物82,83,84对它们在共有主题上的相互作用缺乏了解。我们开始解开钥匙独联体区分ETV6和EWS-FLI特异功能的调节原则，其对染色质的拮抗作用经常发生在较短的5′-GGAA-3′重复序列。由于EWS-FLI的发病机制通常与其在较长重复序列或真微卫星上的活性相关，我们强调了一个以前没有描述过的独联体较短的GGAA重复序列在该疾病中的调节作用，这有利于ETV6微调EWS-FLI。尽管用于生化分析的EWS-FLI的重组对该领域来说是一个挑战，但未来的工作需要描绘出决定每个TF活性的精确的GGAA重复代码。类似地，ETV6和野生型FLI1蛋白可以参与抑制性异二聚体85ETV6的氨基末端(PNT)结构域介导的相互作用，需要进一步的研究来确定ETV6和EWS-FLI是否参与蛋白质相互作用。然而，值得注意的是，我们使用ETV6的ETS DBD缺失突变体(具有完整的PNT结构域)的实验证明ETV6的DNA结合活性对其在尤文肉瘤中的功能至关重要。

ETV6在正常发育中是主要的TF，在癌症中反复突变。ETV6突变包括涉及30个不同基因伴侣的缺失和染色体易位53。种系和体细胞功能缺失突变经常发生在恶性前疾病和白血病中。例如，在B细胞急性淋巴细胞白血病中，ETV6删除经常与ETV6–RUNX1重排，导致ETV6蛋白的双等位基因缺失86,87。染色体易位也将ETV6的N末端与来自许多受体酪氨酸激酶的酪氨酸激酶结构域融合，这促进了组成性自磷酸化和生长信号传导53. ETV6然而，还没有关于尤文肉瘤复发突变的报道42,43,44。此外，ETV6不受EWS-FLI法案的管制(补充表4)并且不表现出对这种癌症类型特异的显著表达模式(扩展数据图。1d).尽管如此，我们发现了它在调节EWS-FLI活性中作为一种关键的肿瘤类型选择性依赖的作用。因此，本报告重申了进行大规模无偏见功能筛选的重要性，以揭示由野生型蛋白维持的致癌机制。

我们的发现表明，尤因肉瘤生物学的一个标志可能涉及依赖抑制EWS-FLI活性的机制来促进肿瘤生长。事实上，我们之前描述了由E3连接酶(TRIM8)和粘附蛋白介导的抑制EWS-FLI活性的机制48,66,88。在这里，我们发现了支持EWS-FLI金发女孩现象的独特机制66对染色质起作用。未来的翻译努力可能最终通过降低或矛盾地增加其活性来调节这种具有药理学挑战性的蛋白质的活性。

总之，我们发现了一个突变体TF和一个野生型旁系同源物之间在染色质上TF竞争的致癌作用。我们的工作有助于理解可以促进癌症的失调的表观遗传机制，提高了类似机制在其他疾病背景下相关的可能性。