鳞状细胞肺癌和恶性胸膜间皮瘤中具有致癌特征的EPHA2突变
鳞状细胞癌和恶性胸膜间皮瘤(MPM)是胸部恶性肿瘤，预后极差，治疗选择有限。众所周知，大多数实体肿瘤都过度表达EPHA2受体酪氨酸激酶。已知EPHA2在癌症进展中表现出相反的作用。它通过配体和酪氨酸激酶依赖性信号传导(Y772)抑制癌症存活和迁移。而已知通过与配体无关的信号传导来促进肿瘤进展和细胞迁移(S897)。我们分析了ephrin受体A2的表达谱和突变状态(EPHA2)在鳞状细胞癌和MPM细胞系以及主要患者标本中。在鳞状细胞癌和MPM发现EPHA2受体过表达、突变或扩增。特别是EPHA2突变体A859D和T647M值得探索，A859D Y772死亡突变体在Y772显示出比T647M突变体更低的磷酸化水平。分子动力学模拟研究表明构象的差异变化可能是EPHA2活化水平差异的结构基础。因此，与对照组和T647M突变体相比，A859D突变体细胞显示出增加的增殖和细胞迁移。金组学分析表明STAT3和PDGF通路上调，而通过CBL的信号传导受到抑制。综合考虑，目前的工作揭示了癌症的特征EPHA2SSC和MPM的突变恢复了EPHA2癌症。这项研究还表明，多沙唑嗪和其他旨在抑制相关信号成分的EPHA2抑制剂的组合可能是MPM和非小细胞肺癌患者的一种新的治疗策略EPHA2或者CBL变更。
鳞状细胞癌是非小细胞肺癌中第二常见的组织学类型，占所有非小细胞肺癌病例的20-30%，通常在诊断时表现为晚期疾病。1然而，与晚期肺腺癌相比，目前已有靶向治疗，特别是如果出现可操作的突变，晚期鳞癌的治疗选择有限，无论是在一线治疗还是复发/难治治疗。在过去的几年中，一些新的药物已经被批准用于治疗鳞状细胞癌，这些药物包括necitumumab(抗EGFR单克隆抗体)和标准化疗，以及免疫检查点抑制剂如nivolumab、pembrolizumab或atezolizumab。2尽管反应令人鼓舞，但仍然需要新的更有效的药物。
恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一种起源于胸膜、腹膜和心包浆膜表面的肿瘤。这是一种罕见的疾病，在美国，每年大约有十万分之一的人被诊断出患有这种疾病。这种疾病最常影响接触石棉的人；然而，遗传因素也可能起作用。从诊断开始的中位生存期约为9.2个月。治疗选择包括手术和/或化疗。3,4不幸的是，只有一种化疗药物(培美曲塞)被美国食品和药物管理局批准用于治疗这种疾病。5,6因此，为了对MPM病患者的治疗和总体生存产生重大影响，需要确定新的生物学机制，并在治疗上加以实施。
代表受体酪氨酸激酶(RTKs)最大家族的产生红细胞生成素的肝细胞癌(Eph)受体，7根据结构同源性和配体结合亲和力分为EPHA类和EPHB类。8Eph-ephrin系统的一个独特特征是信号被受体(正向信号)和配体(反向信号)转导，形成一个重要的细胞通讯系统，在胚胎发育过程中的各种生物过程中起着关键和不同的作用。
EPHA2是一种由976个氨基酸组成的130 kDa蛋白质。这EPHA2基因位于染色体1p上，包含17个外显子，跨越31千碱基。EPHA2受体的胞外区由配体结合结构域、一个富含半胱氨酸的结构域和两个纤连蛋白-ⅲ结构域组成(图。1)。细胞质区域由酪氨酸激酶结构域和不育α基序组成。激酶结构域和近膜区含有多个酪氨酸残基。这里的两个关键位点是Y772和S897，Y772一旦被激活，就能抑制癌细胞的存活和迁移，S897有助于癌症的发展。9,10,11,12这些酪氨酸残基的磷酸化为含有SH2/SH3结构域的信号蛋白(如Fyn、Src、Nck和Crk、RasGAP、LMW-PTP、PI3激酶和衔接蛋白Grb2、Grb10和SLAP)创造了停靠位点。这些蛋白质中的许多调节肌动蛋白细胞骨架的解聚13而另一些调节细胞粘附。14几个S/T/Y残基在细胞内磷酸化，在血管组装、血管生成和细胞迁移中发挥重要作用。15
EPHA2受体由配体结合结构域、富含半胱氨酸的结构域、两个纤连蛋白-ⅲ结构域、酪氨酸激酶结构域、无菌α基序和PDZ结合基序组成。最近我们在配体结合域和TK域发现了新的突变(黄色)和已知的单核苷酸多态性
以前，研究表明EPHA2在肺癌中表达，并且它也是该疾病的预测者。12此外，我们以前对非小细胞肺癌中EPHB4的研究表明，当EPHA2过表达时，诱导了对EPHB4抑制剂的抗性。16在这项研究中，我们研究了与以下相关的表达、激活和基因改变EPHA2以及调节EPHA2在这两种疾病中的潜在治疗作用。基于突变发生的地方，EPHA2突变表现不同，因为突变不同地影响EPHA2磷酸化和下游信号传导。我们还观察到多沙唑嗪的抑制作用17对细胞毒性化疗如顺铂有附加作用。
首先，我们询问了SCC和MPM肿瘤样品和细胞系中的基因改变EPHA2。来自35个SCC、39个MPM患者肿瘤和6个MPM细胞系(H28、H513、H2052、H2373、H2461和H2596)的基因组脱氧核糖核酸用于突变和扩增分析。百分之二十八(11/39)的MPM患者样本EPHA2突变(图2)但除了突变体R876H外，在SCC中没有观察到。大约10% (4/39)的MPM患者样本和33% (2/6)的MPM细胞系EPHA2基因扩增(图3)。
正常(N)和肿瘤(T)样本。方框表示肿瘤样本中的杂合子突变。a在SSC肿瘤组织中检测到新的突变(R159G和R876C)和已知的单核苷酸多态性(SNPs) (P350T、G391R、M631T、R876H和R890Q)。b在MPM肿瘤组织中检测到新的突变(T140I、D184Y、T647M和A859D)和已知的单核苷酸多态性(R195C、D232G、T647T和R876H)。第3外显子发现R159G、T140I、D184Y、R195C和D232G，第5外显子发现P350T，第10外显子发现T647T/M，第11外显子发现M631T，第15外显子发现A859D/A和R876H/R。和R876C、R876H和R890Q在外显子16中发现
35个SCC、39个MPM肿瘤样本和6个细胞系已用于测定EPHA2基因扩增。相对于参考基因LINE-1的折叠变化
接下来，我们评估了EPHA2蛋白在多种MPM细胞系中的表达。来自六个MPM细胞系(H28、H513、H2052、H2373、H2461和H2596)和正常间皮细胞系Met-5A的总细胞裂解物用于通过免疫印迹测定蛋白质表达。与Met-5A相比，H28和H2461 MPM细胞系的EPHA2表达较低，而H513、H2052、H2373和H2596 MPM细胞系的EPHA2表达较高。总之，EPHA2在66.7% (4/6)的MPM细胞系中过表达(图4a)。
a用EPHA2抗体免疫印迹六种MPM细胞系和间皮对照细胞系Met-5A的裂解物。b在MPM东京都市区使用了65个MPM肿瘤和9个正常间皮样本的免疫组织化学代表性图片。c在MPM东京都市区使用65个MPM肿瘤和9个正常间皮样品的蛋白表达量。d48份非小细胞肺癌组织标本和24份相邻正常标本的蛋白表达量用于小细胞肺癌组织中。H&E、EPHA2、磷-(p-)EPHA2和ephrin A1染色并评分。正常，肿瘤
利用组织微阵列(TMA)通过免疫组织化学(IHC)分析肿瘤标本中EPHA2的表达(图1)。4b)。65个MPM肿瘤样本和9个正常间皮样本的总体IHC评分分别为2.74和2.06，表明EPHA2在MPM过度表达。我们进一步测定了磷酸-EPHA2和配体ephrin A1 (EFNA1)在同一TMA中的表达。结果表明，与正常组织相比，磷酸-EPHA2表达较低，而EFNA1过表达(图4c)。48个SCC肿瘤样本和44个相邻正常样本的总IHC分数分别为1.74和0.5(图4d)。这些结果表明，与正常组织相比，在MPM肿瘤样品中磷酸-EPHA2的表达较低，而EFNA1的表达较高。
在确定EPHA2过表达后，我们接下来确定了过表达对细胞增殖和迁移的影响。如图所示5a，在HEK293中EPHA2同基因细胞相比，与低EPHA2表达的HEK239细胞相比，细胞增殖增加。此外，细胞具有EPHA2与野生型细胞相比，A859D和T647M突变显著增加了增殖EPHA2(图5a)。EPHA2A859D突变细胞的表现优于T647M细胞。伤口愈合试验用于确定HEK293的细胞迁移EPHA2表达WT和突变体(Mt)的等基因细胞EPHA2。伤口愈合在2小时和5小时进行监测，在这两种情况下，细胞迁移在EPHA2A859D突变体与T647M突变体和HEK239细胞的比较(图5b)。
a在72小时内，每24小时测量一次细胞活力b通过伤口愈合试验在0、2和5 h测量细胞迁移
了解EPHA2、BEAS2B的化疗和药理抑制作用EPHA2用化疗药物紫杉醇和顺铂以及小分子抑制剂(包括MET抑制剂SU11274和mTOR抑制剂雷帕霉素)处理具有WT和Mt受体(G391R)的等基因细胞。EPHA2与传统化疗药物相比，Mt细胞对小分子抑制的敏感性更高EPHA2重量电池(图6a–d)。HEK293EPHA2同源细胞系和MPM细胞系也用于确定顺铂的有效性。过度表达EPHA2的MPM细胞系(H513、H2052和H2596)对顺铂抑制表现出敏感性(图7a)。相反，低EPHA2表达的MPM细胞系(H28和H2461)显示对顺铂治疗的抗性(图。7a)。此外，HEK293EPHA2等基因细胞显示出小分子抑制剂多沙唑嗪的抑制作用。相比之下，治疗HEK293EPHA2-含有多沙唑嗪的A859D Mt细胞显示出对多沙唑嗪的显著抗性(图7b)。在T647M突变体中没有观察到这种抗性，EPHA2重量，或空矢量控制。
BEAS2BEPHA2用等基因细胞治疗a紫杉醇，b顺铂，cSU11274，和d雷帕霉素。突变G391R细胞显示出对顺铂抑制的抗性，但对MET抑制剂SU11274和mTOR抑制剂雷帕霉素敏感。电动汽车:空矢量
a用顺铂、1、5和10微米处理MPM细胞系H28、H513、H2052、H2373、H2461和H2596小时bHEK293EPHA2多沙唑嗪处理等基因细胞48小时
为了阐明其机理，我们接下来测定了EPHA2A859D和T647M突变体，有或没有多沙唑嗪处理。分析表明，与空载体对照相比，负责磷酸化EPHA2 Mts大多数肽的酪氨酸激酶活性被下调。用野生型多沙唑嗪治疗后EPHA2组和T647突变体显示显著上调(p%3C 0.05)比EPHA2A859D Mts组。补充图中显示了每组与空矢量组相比的变化1。
为了理解受影响肽的网络，通过独创性途径分析(IPA)软件工具(加利福尼亚州雷德伍德市奇根)预测并创建了具有显著下调和上调肽的信号转导网络(补充图。2a)。分析表明，Tec激酶信号传导、STAT3信号传导、轴突导向信号传导、T细胞受体信号传导和PDGF信号传导是最常见的通路(p%3C 0.001)参与所有有或没有多沙唑嗪治疗的组。此外，癌症、翻译后修饰、细胞间信号传递和相互作用是网络，其中涉及的肽受影响最大(补充表1和图2b)。
EPHA2激酶结构域中的残基Y772在配体结合时自动磷酸化，导致EPHA2的催化激酶活性。我们的磷酸化分析(图8)显示突变体A859D显示出低水平的磷酸化，并且突变体T647M显示出与野生型EPHA2相比中等水平的磷酸化。为了使这一实验结果合理化，我们对EPHA2激酶结构域结构进行了分子动力学模拟，从EPHA2自抑制构象的晶体结构开始，在显式水中进行，如方法部分所述。我们还在与野生型相同的条件下对A859D和T647M两个突变进行了分子动力学模拟。我们的假设有两个方面:(EPHA2中的残基Y772应该接近γ-PO(在4以内)4促进磷酰基转移到Y772的三磷酸腺苷基团。(2)突变A859D和T647M会影响γ-PO的动态邻近性4从而降低Y772的磷酸化。此外，三磷酸腺苷结合位点的形状可能受到突变的影响，从而影响三磷酸腺苷与EPHA2的结合亲和力。K702是结合在γ-PO附近的残基4因此我们用这个残基来定位三磷酸腺苷结合位点。数字8a表明Y772和K702之间的距离在EPHA2自抑制状态的晶体结构中为23.7埃。数字8b显示了在纵向模拟过程中达到的Y772和K702之间的最小距离。这表明野生型EPHA2的动力学使Y772足够接近三磷酸腺苷而被磷酸化。数字8c显示了在野生型和两个突变体的分子动力学模拟期间Y772和K702之间的距离分布。可以看出，野生型和T647M突变体显示Y772和K702之间的距离更近，突变体A859D在激酶结构域的动态过程中没有使Y772接近K702。与野生型相比，这可能会削弱A859D突变体中Y772的磷酸化。T647M的距离分布比野生型广。我们还计算了三磷酸腺苷结合腔的体积，如图2所示8d，以及体积的分布3)野生型和从分子动力学模拟的快照计算的两个突变体的三磷酸腺苷结合位点显示在图1中。8e。对于A859D，三磷酸腺苷结合位点的体积分布最广，其次是T647M，然后是野生型。这表明，在A859D突变体中，三磷酸腺苷结合位点非常灵活，这可能导致更快的三磷酸腺苷脱率，从而降低三磷酸腺苷的结合亲和力，因此在突变体A859D EPHA2中磷酸化Y772是可能的。由分子动力学模拟捕获的构象差异变化为Y772磷酸化水平的差异提供了结构基础，并解释了观察到的表型变化趋势。
aEphA2在自抑制构象中的晶体结构。虚线所示的Y772和K702之间的距离为20.3埃，b分子动力学模拟后的EphA2构象显示Y772和K702之间的最小距离为3.4埃，c野生型和突变体A859D和T647M中Y772和K702之间距离的分布，d在EphA2中显示三磷酸腺苷结合位点的表面，和e体积的分布3)的三磷酸腺苷结合位点和根据分子动力学模拟的快照计算的两个突变体
在这项研究中，我们使用了多种生物学、生物化学和计算工具，揭示了以下肿瘤的致癌性和肿瘤抑制性特征EPHA2和MPM的突变。除了识别新的突变之外EPHA2基因在这两种疾病中被扩增或者蛋白质被过度表达。众所周知，在癌细胞中，由于LMW-PTP磷酸酶在这些细胞中的过度表达，EPHA2蛋白通常不被磷酸化。18因此，p-EPHA2水平的降低和总EPHA2水平的提高似乎是蛋白质稳定性增强的结果。19尽管如此，EPHA2的磷酸化状态导致信号通路的不同激活，从而导致癌症进展的不同结果。EPHA2的致瘤特征由配体无关的高水平S897磷酸化和配体和激酶相关的低水平Y772磷酸化来定义。因此，在本研究中鉴定的几个新突变中，特别是酪氨酸激酶结构域中的突变被分析。突变A859D和T647M显示出对比表型。A859D，Y772死亡突变体，与T647M突变体和对照细胞相比，显示MPM细胞的细胞增殖和迁移增加。此外，我们还观察到低剂量顺铂和SU11274治疗对生长的刺激(图6b，c)。另外，EPHA2突变A859D，赋予靶向治疗和顺铂化疗耐药性。A859D突变体的Y772磷酸化比T647M突变体低得多。为了了解这两种突变体表型的差异，我们进行了计算分子动力学模拟研究，以模拟激酶结构域的动力学，并探索导致Y772磷酸化的分子内相互作用。我们对分子动力学模拟轨迹的分析表明，A859D突变体通过降低含有Y772的环的灵活性而削弱磷酸化，因此更接近三磷酸腺苷用于直接磷酰基转移。此外，与野生型EPHA2相比，EPHA2 A859D突变体显示出增加的三磷酸腺苷结合位点体积，这导致更快的三磷酸腺苷脱率和降低三磷酸腺苷对该突变体的亲和力。这两个因素共同提供了对突变A859D中Y772磷酸化损伤的原子级见解。这解释了为什么我们看到A859D细胞Y772磷酸化减少。A859D突变体缺乏抑制磷酸化，导致细胞增殖和迁移增加，对化疗或小分子药物治疗的敏感性降低9。
该模型描述了与T647M突变体相比，A859D突变体中Y772磷酸化的缺失如何导致肿瘤发生的增强
我们还发现CBL在2373年受到下调EPHA2等基因细胞(低EPHA2表达)并在用多沙唑嗪处理后上调。CBL是E3泛素连接酶和衔接分子，在非小细胞肺癌中起重要作用。20人们经常观察到CBL在癌细胞中表达低，尤其是在非小细胞肺癌中。有趣的是，我们的研究表明，CBL的低表达导致MET过度表达，细胞增殖和迁移增加，这表明CBL表达或突变低的患者可能受益于MET抑制剂，如SU11274，因为MET的表达增加。21最后，鉴于多沙唑嗪治疗导致CBL上调的事实，多沙唑嗪和其他EPHA2抑制剂的组合可能是MPM和非小细胞肺癌患者的新治疗策略EPHA2或者CBL变更。
本文对人类受试者的研究利用了细胞或组织学上有记载的鳞状细胞癌和MPM病患者的组织样本。使用的样本是芝加哥大学人力组织资源中心、临床研究中心和病理学部门已经储存的档案样本。这些组织是在受试者同意的情况下获得的(根据IRB协议#9571和#13473 A)，或根据已死亡或身份不明患者的同意豁免协议获得的。对于所有样本，临床信息(诊断日期、存活、石棉暴露等)。)是从芝加哥大学的患者病历和/或胸部肿瘤学研究项目(TORP)数据库中获得的，该数据库由索尔吉亚实验室开发，可在iBridge网络网站(http://www . ibridge network . org/uctech/salgia-胸部肿瘤学-access-template)。22,23
评估EPHA2在肿瘤组织中的表达，所述肿瘤组织来自具有不同组织学的SCC和MPM患者。我们利用肿瘤组织微阵列(TMAs)并使用抗EPHA2和磷-EPHA2的抗体以及EPHA2配体ephrin A1、EPHA3和EPHA3配体ephrin A5进行免疫组织化学(IHC)。EPHA3及其配体被用作潜在的Eph受体替代物。SSC和MPM肿瘤标志物是从2003年或以后诊断的未治疗患者和30名正常对照获得的存档肿瘤组织构建的。对每个患者/对照，评估两个复制的组织样本。病理学家利用明视野显微镜对免疫染色的TMa进行盲目评分。通过考虑染色强度的强度结合染色区域的范围来计算IHC分数，以确定最终分数(0，负；1 +，弱；2 +，中等；和3 +，强表达)。如前所述，通过免疫印迹分析MPM细胞系:H28、H513、H2052、H2373、H2461和H2596的蛋白质表达。16以正常间皮细胞系Met-5A作为对照。
使用从SCC和MPM患者肿瘤中获得的DNA样品进行定量实时聚合酶链反应，以确定基因扩增。所用的聚合酶链反应引物列于补充表中2。采用第一步实时聚合酶链反应系统和动力SYBR绿色聚合酶链反应主混合物(应用生物系统)进行实验。相对基因拷贝数由实时聚合酶链反应效率和测试样品中靶基因和参考基因与对照的交叉点偏差计算得出，其中实时聚合酶链反应效率是为每次单独运行确定的。长散置元件-1 (LINE-1)用作参考基因，这是一种重复元件，其每二倍体基因组的拷贝数在健康或恶性人类细胞中相似。24反应在标准热循环条件下进行三次(一次95℃循环10分钟，随后40次95℃循环30秒，58℃循环1分钟)，并使用平均阈值循环数。
外显子1-17EPHA2通过聚合酶链反应分别扩增基因。引物列于补充表中3。聚合酶链反应条件如下:95℃循环1次，5分钟；35个循环，94℃持续30秒，58℃持续30秒，72℃持续2分钟；和72℃循环10分钟。聚合酶链反应产物用ExoSAP-IT(美国俄亥俄州克利夫兰市的通用串行总线公司)处理，并用大染料终止子化学(美国加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司)测序。对正向编码链进行测序，确认EPHA2通过对反向链测序进行的改变。使用突变检测器2.61软件(宾夕法尼亚州州立学院软件遗传学)分析色谱图中的突变。
野生型EPHA2建筑(PCmv6-AC-GFP-Eph a2)购自OriGene(马里兰州洛克维尔)。使用这种亲本质粒，TKB结构域突变T647M和A859D分别使用下列引物产生:(正向)5’-GTGGCCATCAAAGATCGATTAGAAAGGACCG-3’/(反向)5’-GCCGGCTTTCAGCATCTGTGATCCCAC-3’和(正向)5’-CAGGGAGGCGGTGACCCCCC-3’/(反向)5’-GGGGGGGGGGGCGGGTGACCCTG-3’，以及它们的互补引物使用快速改变位点定向诱变XL试剂盒(Stratagene，La两条链的标准脱氧核糖核酸测序证实了点突变。
根据制造商的说明，使用富根HD(罗氏、纳特利、新泽西州)试剂转染表达低EPHA2的HEK293和MPM细胞系。我们利用HEK293细胞作为高通量模型来确定质粒的效力和转染效率。八微克质粒脱氧核糖核酸，不含插入物(空载体)，野生型EPHA2，A859DEPHA2，或T647MEPHA2用于在六孔培养板中转染。转染24 h后，在显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，检测转染效率。
EPHA2敲除通过用下列物质转染细胞来进行EPHA2根据制造商的说明，shRNA(俄勒冈州，马里兰州洛克维尔)。简而言之，1 × 105将高EPHA2表达的H513或MPM细胞系的细胞/孔接种在六孔板中，第二天用EPHA2shRNA结构。产生稳定EPHA2敲除细胞系，用1 μg/ml嘌呤霉素选择细胞1-2周。通过使用抗EPHA2抗体的免疫印迹测定全细胞裂解物中EPHA2的表达水平(圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州圣克鲁斯)。
EPHA2用下列物质转染等基因细胞EPHA2WT和突变体(Mts)如上所述。转染后48小时，收获细胞并以5 × 10重新接种424孔培养板中的细胞/孔。在24、48和72小时监测细胞活力，并用钙黄绿素-调幅排除法测定。接种细胞24小时后，用顺铂、紫杉醇、雷帕霉素、SU11274或多沙唑嗪处理细胞，监测24、48和72小时，并使用钙黄绿素-调幅排阻法测定。
EPHA2用下列物质转染等基因细胞EPHA2WT和Mts如上所述。将细胞接种在六孔板中，培养48小时，直至100%汇合。将细胞静置12小时后，用1毫升移液管吸头在细胞层上划一条直线。然后用1X PBS轻轻洗涤细胞以除去细胞碎片，并更换培养基。伤口部位的照片是在0、2和5小时后拍摄的。这些图像是使用TScratch软件(瑞士苏黎世联邦理工学院计算科学与工程实验室)分析的。
转染后48小时收集细胞，在1X PBS中洗涤两次，然后用冰冷的裂解缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 7.4，1.5 M氯化钠，2.5%脱氧胆酸，10 mM乙二胺四乙酸，10% NP-40，0.5 mM DTT，1 mM苯基甲基磺酰氟，5 g/mL亮蛋白胨，和10 g/mL抑肽酶)裂解5分钟。裂解物在4℃下以13，000转/分钟离心20分钟，并测量上清液中的蛋白质含量。通过SDS-PAGE电泳分离全部细胞裂解物(50g/孔)，并将凝胶转移到硝酸纤维素膜上(新泽西州皮斯卡塔韦的Whatman)。膜在室温下用5%脱脂奶粉(1X PBS，0.1%吐温-20)封闭1小时，并在4℃下与合适的一级抗体孵育过夜。然后用PBST洗涤膜三次，并在室温下用合适的辣根过氧化物酶偶联的二级抗体探测1小时。膜在PBST再次洗涤三次，并使用化学印迹化学发光试剂(比拉德，巴伦西亚，加利福尼亚州)在化学凝胶文献系统(比拉德)上显现条带。使用了对EPHA2、磷酸(p)-EPHA2 (S897)、p-EGFR (Y1125)、p-EPHA4、p-EPHA7 (Y60)和p-STAT1 (Y701)特异的下列抗体。
H2373的激酶活性EPHA2使用PamChip酪氨酸激酶阵列监测含有和不含多沙唑嗪的等基因细胞。简言之，用多沙唑嗪处理细胞，收获细胞，并在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(HALT，Pierce)的哺乳动物提取缓冲液(M-PER，Pierce)中溶解。裂解后，将5 μl裂解溶液移至由1X ABL缓冲液(新英格兰生物蛋白)、0.1%牛血清白蛋白、100微米三磷酸腺苷、总体积为40 μl的20 μg/ml磷酸酪氨酸抗体组成的反应混合物中。在装载样品之前，用0.2%牛血清白蛋白封闭聚丙烯酰胺凝胶阵列。将反应混合物加载到PamChip阵列后，通过在五个循环的每一个循环后测量结合的抗磷酸酪氨酸抗体的荧光，获得激酶活性的实时数据。图像量化和数据处理通过专用的PamGene软件进化和生物导航器(PamGene)进行。使用独创性IPA(加利福尼亚州雷德伍德市)分析了显著差异影响肽和信号通路的肽。
EPHA2激酶结构域两种不同构象的三维结构取自蛋白质数据库(PDB)(http://www.rcsb.org)。这两种结构的PDB码是:1MQB和5EK7。25这两种结构都代表激酶结构域的“非活性”构象。“非活性”构象使残基Y772(磷酸化残基)远离三磷酸腺苷结合位点。这使得激酶失活。选择这两种晶体结构是因为这两种结构一起补偿了彼此缺失的激活环结构。EPHA2激酶结构域的野生型序列从UniProt数据库中获得，缺失的残基编号为586–605、634–638和887–893，使用所列的两种结构作为模板，用MODELLER进行建模。总共产生了50个缺失环的同源性模型，并通过DOP评分和沿着添加的C末端的残基与蛋白质主体之间形成的有利接触数量来评估这些模型。然后使用薛定谔生成突变结构艺术大师薛定谔公司的程序来创建每一个单核苷酸多态性。26突变残基的侧链构象和5ω范围内的相邻氨基酸用最好的模块(也来自薛定谔公司)。27然后侧链优化模型的能量最小化。
多维模拟使用GROOMACS 5 . 0 . 5版运行。选择了GROMOS96 53a6力场，并给出了足够的Cl-加入离子中和每个系统。28,29,30,31,32每个模型在十二面体中用SPC/E水分子溶剂化，分子边界为10°。然后，每个系统通过最速合适算法最大限度地减少500步，直到最大力低于1000千焦/摩尔/纳米。对每个最小化的结构进行500皮秒到310千秒的NVT平衡33然后使用帕林内洛-拉赫曼气压调节器在1个大气压下平衡系统，进行500皮秒的不扩散条约平衡。34一次复制使用平衡过程中产生的初始速度，另外两次复制使用随机速度启动。三次重复运行总计350纳秒，总模拟时间为1.05μs。
轨迹是用VMD连接处理的。35K702的新西兰原子和Y772的羟基原子之间的距离以ω为单位计算。使用PyMOL可视化EPHA2的个体表达。36催化位点的体积通过每200皮秒选择一帧POVME 2.0来计算。37,38该脚本被修改以计算A644、Q656、D659、A699和G776的钙原子质心处的体积。使用Matplotlib创建距离和体积的图形，使用PyMOL生成结构表示，使用VMD生成绑定体积表示。
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