中国人群chst9基因的移码变异与精神分裂症的关系

最近的研究表明，罕见的变异导致精神分裂症的风险，然而，导致这种情况的确切变异或基因在很大程度上是未知的。本研究对20个中国家系进行了全基因组测序(WGS)。每个家庭至少有两个被诊断为精神分裂症的兄弟姐妹和至少一个未受影响的兄弟姐妹。我们检查了在受影响的兄弟姐妹中发现的功能变异，但没有在家庭中未受影响的兄弟姐妹中发现。与此相符合的是，第18：24722722染色体上的一个移码杂合子缺失CA(-/CA)，也称为rs752084147，位于糖硫转移酶9(CHST 9)基因，在两个家系中检测到。基于PCR的Sanger测序证实了这一缺失。以0.00076例汉族人群为观察对象，进行病例对照和家庭分析，评价其与精神分裂症的关系。在病例对照分析中，卡方检验。P-价值为6.80e-12，P-经过100万次模拟后，价值为0.0008。在基于家庭的种族隔离分析中，种族隔离P-数值为7.72e-7，并进行了模拟。P-数值为5.70e-6。在病例对照和基于家庭的分析中，CA缺失与中国人群中的精神分裂症显著相关。进一步研究这一基因在精神分裂症的发展中是必要的，通过使用更大的和更多的种族多样性的样本。

摘要精神分裂症是一种遗传力高、遗传结构复杂的复杂精神疾病。1..为了阐明这一疾病的病因，人们把重点放在通过全基因组关联研究(GWASs)来检测常见的危险变异。到目前为止，已有超过100个位点被发现与精神分裂症显著相关。2..然而，诸如单核苷酸多态性(SNPs)等常见变异并不能解释所有的遗传力。事实上，GWASs所确定的变异只提供了大约7%的遗传力。3，表明仍有很大的缺失遗传力有待发现。此外，这些普通SNPs中的大多数个体基因并不会直接传播这种疾病的风险。另一方面，有证据表明，罕见的变异，如较小的等位基因频率(Maf)小于0.01和拷贝数变异(Cvs)，对精神分裂症的影响要大得多。1..人们认为，来自这些罕见变异体的基因往往会给疾病带来明显的风险，这可能会导致识别新的治疗目标。随着基因组技术的进步，全基因组测序(WGS)已成为识别精神分裂症等复杂疾病中罕见的SNP和CNV的最宝贵的工具。这种方法尤其能在基于家庭的研究中发现罕见的变异体，病例聚在不相关的病例对照研究之上，在这些研究中，引起疾病的罕见变异可能在成千上万的受试者中只出现一次或两次。4虽然这样的家庭样本可能很难收集。

在这项家庭设计的研究中，我们将WGS应用于20个中国家庭，每个家庭包括至少两个受影响的兄弟姐妹、一个未受影响的兄弟姐妹和一个父母。在最初的分析中，我们只对功能变异感兴趣，比如移码突变，这是在受影响的兄弟姐妹中发现的，而不是在家庭中未受影响的兄弟姐妹中发现的。符合这一标准的变体随后在各个家庭之间进行匹配。

7个移码突变符合规定的标准。其中，一个变体在CHST 9第一次被选中进行进一步的调查，因为此前有报道称它与精神分裂症有关。5..我们在这里报道了一个新的移码缺失(-/CA，杂合子)。CHST 9基于GNOMAD数据库，在18号：24722722染色体上检测到基因。http://gnomade.broadinstitute.org)(dbSNP ID：rs752084147，c.50_51delTG，p.Val17AlafsTer19)。我们在来自两个独立家庭的三名精神分裂症儿童中观察到了这种缺失，未受影响的儿童没有发现这种缺失。这两个家庭中的一位父母没有被诊断为精神分裂症，而是患有另一种精神疾病，也有这种缺失。4例受试者的Sanger序列分析均证实了缺失的存在。从病例对照和家庭分析两方面进行的统计分析表明，CHST 9在中国人群中，基因与精神分裂症有显著的相关性。

全基因组测序总结

WGS的统计摘要列于表中。1..测序深度中位数为35.34x，覆盖率中位数为99.69%，达到目标测序深度30倍，平均每个受试者有>6.8亿个阅读量，310万个SNPs，43万个indels，57.9万个结构变异(SVS)。

家族亲缘关系分析与非整倍体分析

中心IBS方法6在本研究中，我们使用101个受试者之间共有的250，000个变异体来验证家族关系。还利用BCFTools软件包进行了非整倍体分析，以确定每个个体的性别。7..在家庭亲属关系分析中，两名受试者(02C11277和01C05768)被排除在进一步检查之外，因为他们被发现与本研究的其他99名受试者无关(见补充表)。沙一)。一个受影响的对象(01C07598)最初被分配给35-02497家庭，但实际上属于35-39622家庭，剩下的家庭35-02497只有一个受影响的对象和一个未受影响的主体。研究对象01C08839被列为35-4560岁家庭的母亲，但亲属关系分析表明，她更有可能是这个家庭的女儿。回到最初的家庭数据，事实上，这个家庭有一个47岁的女儿，她从未被诊断出患有精神病。因此，01C08839被指定为这个家庭中未受影响的女儿。对于所有其他受试者，家庭关系通过亲属关系分析得到证实。BCFTools软件包的预测也证实了所有受试者的性别。亲属关系矩阵列在补充表中。沙一，样本描述和性别预测结果列于补充表S2.

移码突变CHST 9删除

使用在“材料和方法”下选择潜在风险变量时所描述的策略，我们生成了一个变体列表，其中包括仅存在于受影响的兄弟姐妹中的变量，而不包含在未受影响的兄弟姐妹中存在的变量。父母被排除在初步分析之外。补充表S3显示过滤前后的函数注释数量。筛选后只剩下27.37%的变异体和19.66%的外显子变异。移码插入和缺失(Indels)是编码变异，导致从变异位点向后的氨基酸变化。这种类型的变异是本研究的主要目标，因为它们的编码蛋白可能会发生功能改变。总共，在两个或两个以上的家庭中发现了七个移码带(表)。2)。在这些变体中，在chr 18：24722722处删除了CHST 9基因是特别令人感兴趣的，因为在先前的一项研究中，它是唯一与精神分裂症有关的基因。5..在那份报告中，CHST 9被发现与精神分裂症有关。从基因剂量的角度来看，由移码缺失引起的功能丧失(Lof)可能与由于拷贝数丢失而产生的影响相似。为了进一步评估这种突变是否是新的，使用IGV软件对二进制序列比对图(BAM)文件进行了可视化检查(http：/Software.Broadstitute.org/Software/IGV/)8,9..所有99名受试者都在这个地点接受了检查，其中包括父母。通过IGV分析，35-13523家庭的父亲也发现了同样的缺失(图1)，他有一个患有这种缺失的受影响的儿子。2)。虽然这位父亲没有被诊断为精神分裂症，但他被诊断患有一种非特定的精神疾病(表)。S2)。这位从未被诊断患有任何精神疾病的母亲在这一位点没有缺失。由于这一缺失是在35-13523家庭的父亲中发现的，因此该变异被排除为一个新的突变。在35-02478家庭，两个受影响的孩子，一个儿子和一个女儿，有缺失，而从未被诊断出任何精神疾病的父亲没有这种缺失。这个家庭的母亲没有临床资料或DNA。由于同一世代在两个独立家系中发生两次完全相同的新突变的可能性极低，因此可以得出结论，该突变很可能是从母亲遗传来的。总括而言，我们的WGS分析发现四名受试者的基因存在杂合子移码缺失(-/ca)。CHST 9基因。在这四人中，三人来自两个独立家庭，三人患有精神分裂症，另一人被诊断患有精神分裂症以外的精神疾病。我们的结果表明，并非来自这两个家庭的所有受影响儿童都有这种突变，这意味着其他遗传或环境因素也可能在这一疾病的发展中发挥重要作用。应该指出，CHST 15基因也被认为是一个潜在的目标，因为它属于与CHST 9基因。变式CHST 15含有13个或更多的均聚物G区，这使得Sanger测序很难找到确切的变异体。需要更多的时间来跟进这个基因。表中列出的其他基因2，它们的功能很大程度上是未知的，只是SHCBP1L(SHC结合和纺锤体相关的1类)，是一种在哺乳动物精子发生中起重要作用的基因。10.

WGS分析研究流程图。

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家谱35-02478，家庭35-13523。圆圈和方格分别表示女性和男性。黑匣子表示受影响的对象。形状内的十字表示个人不是被诊断为精神分裂症，而是患有另一种精神疾病。箭头表示家庭的先证者。问号代表个人的DNA不可用。形状外的红色圆圈意味着该个体在CHST 9基因。

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如补充表所示S4和S5，其他变体，如停止损失和停止增益，也被总结，因为它们也可能戏剧性地改变蛋白质的功能。在这些变体中，据报道有15个基因与精神分裂症有关。这些变体是今后调查的潜在目标。

Sanger序列验证CHST 9删除

以PCR为基础的Sanger测序证实了CHST 9材料和方法中描述的突变。来自35-13523家庭和35-02478家庭的所有成员都接受了核查。从WGS分析中发现4例CA缺失者均经Sanger测序证实。Sanger测序结果与WGS的结果符合100%。图形3A对正常序列和杂合子CA缺失序列进行了典型的Sanger序列分析。

正常人和受影响个体的Sanger测序和人类结构CHST 9基因和编码蛋白。(A)正常人和受影响个体的Sanger测序。通过Sanger测序验证了所鉴定的-/CA变异体。来自未感染儿童的序列是干净的，并与人类基因组浏览器GRCH 37/hg 19中的序列相匹配。在CA缺失后，一个受感染儿童的杂合子缺失序列立即出现双峰。红色箭头表示缺失位点。(B)人类的结构CHST 9基因和编码蛋白。上面的面板显示了从5‘到3’方向转录成编码序列(黑匣子)的五个外显子。外显子从1(E1)到5(E5)。底部面板显示翻译后的CHST 9蛋白。TM表示跨膜结构域。3‘-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸盐(PAPS)的5‘-磷酸磺酸基(5’-PSB)和3‘-磷酸基(3’-PB)的结合位点明显。本研究中由缺失引起的截短蛋白以红色表示。

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年CA缺失的关联分析CHST 9中国人群中的精神分裂症

在本研究中，我们对20个中国家庭进行了家庭设计的WGS研究。对于关联分析，本研究采用了两种不同的方法。一种方法是基于病例对照假设，将受影响的个体或风险等位基因携带者视为病例，并与一般汉族人群进行比较。在这里，我们用Yates的修正进行了卡方检验，比较了潜在风险变体的频率与来自大型外显子数据库和基因组序列数据库的MAF的频率，例如基因组聚合数据库([GnorAd])，http://gnomad.broadinstitute.org/)11、Exome聚合联盟([ExAC]、http://exac.broadinstitute.org/)11，以及中国基因突变数据库[CNGMD v.5.0](http://cngmd.virgilbio.com/)。由于不同的数据库对这一缺失有不同的MAF，我们认为CNGMD v.5.0数据库中的一般汉族人群是我们汉族家庭的最佳参考。我们认为，我们的WGS研究对象要么是高危携带者(父母)，要么是病例(患有精神分裂症的儿童)，而这些数据库中的受试者是一般的人群对照。在此假设下，我们用Yates的修正进行了卡方检验。根据CNGMDv.5.0数据库中汉族普通人群中0.00076的频率，结果表明，在中国人群中，这一缺失与精神分裂症有着显著的相关性。P=2.15e-6为载波组，和P=6.80e-12(病例组)。由于CA缺失是一种罕见的变异，我们进一步进行了模拟，以评估其与精神分裂症的关系。我们使用MonteCarlo R软件包中实现的模拟函数，分别对高危携带者和病例组进行了100万次卡方检验。结果仍然显著(P-携带者和病例组的数值分别为0.0032和0.0008。此外，我们还使用来自较大数据库(GNOAD和ExAC)的MAF信息作为参考进行关联测试。协会P-承运人和病例组的数值从0.0046到1.90e-75不等。更多有关结果的详情载於表。3.

另一种方法是基于家庭的关联分析。在这些分析中，我们使用了基于基因的分离方法(Gese)。12这假设门德尔种族隔离和100%的外显率。在中国汉族人群中观察到的频率为0.00076，我们首先估算了这两个家族(35-13523家族)的分离概率。P-价值=0.0012，家庭35-02478，P-值分别=0.0006)，得到了两个家系的联合分离概率(P-数值=7.72e-7)。经过10，000，000次模拟，其联合偏析概率为5.70e-6.

从家系设计的20个家系的卡方和家系分离试验来看，中国人群中移码CA缺失与精神分裂症有显著的相关性。

在这项研究中，我们试图用一种基于家庭的WGS方法来识别中国人群中与精神分裂症相关的罕见变异/基因。中发现一个双碱基对CA缺失。CHST 9三个独立家庭精神分裂症患者的基因。一位没有被诊断出患有精神分裂症但患有另一种精神疾病的父母也被发现有这种缺失。用两种不同的方法来评估这种缺失与精神分裂症的关系。在病例对照方法中，加用Yates校正和排列的卡方检验显示CA缺失与精神分裂症有显著的相关性。在将精神分裂症患者与参照人群进行比较的情况下，P-卡方试验和排列试验的值分别为6.80e-12和0.0008。我们认为这种情况更合适，因为我们直接将精神分裂症病例与健康人群进行比较。即使在我们将父母视为高危携带者的情况下，我们也发现CA缺失与精神分裂症(P-卡方试验和排列试验的值分别为2.15e-6和0.0032)。根据基于家庭的种族隔离分析(Gese)，联合种族隔离。P-这两个家庭的价值为7.72e-7。模拟P-分离值为5.70e-6。在孟德尔分离和100%外显率的假设下，Gese12,13考虑到在普通人群中观察到的频率，可以用于联合评估单个基因的多个突变，从而与感兴趣的疾病相关联。虽然精神分裂症是一种复杂的、不完全外显的疾病，但分离分析仍然是恰当的。总之，无论是病例控制分析还是隔离分析，我们都发现CHST 9我们家族研究的基因与中国人群中的精神分裂症有关。但是，本研究确实存在一定的局限性：(1)本研究的样本量相对较小。尽管我们已经观察到了这种关联，但还需要对较大样本的进一步研究来验证我们的结果。(2)我们的研究只包括来自中国人口的研究。融合不同的种族群体可能会为其与疾病的关联提供更多的见解。

碳水化合物硫转移酶9(CHST 9)基因(HgnCID：19898；Entrez基因：83539；Ensembl：ENSG 00000154080；OMIM：610191)，位于人类chr18q11.22(基因组定位：chr 18：24495595-24765302，参考基因组GRCH 37/hg 19)上，包含5个外显子，总基因长度约为270 kb。该cDNA编码一个Ⅱ型膜蛋白，含443个氨基酸，属于硫转移酶2家族。该蛋白定位于高尔基膜，并被认为催化硫酸盐转移至N-糖聚糖和O-糖聚糖中的4个非还原N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基。14,15..因此，它也被称为GALNAC4ST-2或GalNAC-4-ST2。在人类中，它在气管中高表达，但在大脑中也有表达，特别是在海马和下丘脑。16..碳水化合物上的硫酸基赋予糖蛋白、糖脂和蛋白多糖高度特异性的功能。17它们对细胞间的相互作用、信号转导和胚胎发育至关重要。18.

如图所示。3B，CHST 9蛋白含有12-aa胞质结构域、21-aa跨膜结构域(TM)和410-aa腔结构域。19..有证据表明，该蛋白的内腔结构域包含4个潜在的N-连接糖基化位点和2个基序：3‘-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸盐(PAPS)的5‘-磷酸硫酸盐结合位点(5’-PSB)和3‘-磷酸结合位点(3’-pb)。19..前两个结构域在底物识别中起着重要作用，而最后一个结构域主要催化上述硫酸盐的转移。TM结构域在将蛋白质锚定在膜上并使其稳定在膜上起着至关重要的作用。

ca在chr 18：24722722处的双碱基对移码缺失位于cr 18：24722722的第一个外显子中。CHST 9基因。该变异体是一个基于NM_031422.5的c.50_51 delTG，它将导致一个由34个氨基酸组成的截短蛋白(P.Val17AlafsTer19)。更重要的是，突变开始于17THAA在TM结构域中，Valine(Val)被丙氨酸(Ala)取代，随后又有17个新的残基。CA缺失引起的蛋白质序列变化表明，截短的蛋白质极有可能丧失蛋白质的主要功能，包括识别底物，将蛋白质锚定在膜上，以及将硫酸盐基团转移到其他蛋白质上。因此，这种变异应该被归类为LoF突变，包括无意义、移码、剪接受体和剪接供体变异。CHST 9蛋白功能丧失可能影响正常脑发育，从而促进精神分裂症的发展。更具体地说，软骨素4-硫转移酶活性的丧失可能是疾病发展过程中的关键。事实上，研究表明，组织良好的突触前聚集体(称为神经周网(Pnns)是由细胞外基质(Ecm)形成的，其中硫酸软骨素蛋白多糖(Cspgs)是主要成分。20,21,22,23,24..研究还表明，PNNS在生后发育和成年期的神经模式形成、突触信号传递、可塑性和神经保护等方面起着重要作用。因此，LoF突变CHST 9可能改变CSPGS或PNNS的正常结构和功能。因此，它可能会干扰大脑发育，导致神经功能障碍和疾病，如精神分裂症和其他精神疾病。25,26,27,28,29..此外，有证据还显示，这些专门的ECM聚集体的形成与GABA能中间神经元的不同群体有关，并且在精神分裂症患者的几个脑区发现了cspg异常。29..有趣的是，我们在rs 200905582(chr 10：125780762)CHST 15基因(表)2)，它也属于一个编码膜结合硫转移酶的基因家族，如CHST 9基因30..提示含硫转移酶的蛋白可能在精神分裂症中起重要作用。对这些蛋白质、基因集或通路分析的进一步研究可能会为理解人类疾病的病理生理作用提供更多的见解。

的功能影响的直接证据CHST 9到目前为止还没有报告。在文献中，有一篇报道说精神分裂症与CNV有关。CHST 931，患者的基因组剂量略有增加。CHST 9..一个类似的结果也被报道为孤独症。32..在本研究中，CHST 9基因与精神分裂症的诊断密切相关。生物信息学分析进一步表明，该基因的CA缺失所引起的截短蛋白将失去其作为硫酸盐转移酶的主要功能。目前还不清楚这种基因是如何导致精神分裂症的。

除了精神疾病，CHST 9CNVS也被发现与急性髓细胞白血病(AML)有关。33，以及其他类型的恶性血液病34，暗示CHST 9可能在恶性血液病的发生发展中起一定作用。CHST 9也与乳腺癌的发展有关35,36和胃癌37..为了更好地了解该基因的功能，以及精神分裂症等疾病的遗传基础和分子病机，有必要对该基因进行进一步的研究。对这一基因进行更深入的功能研究可能会为这些疾病，特别是中国精神分裂症的治疗开辟一个新的靶点。

学科

1998~2002年，在台湾精神分裂症关联研究(TSLS)中招募了一个民族(台湾汉族)的受试者。详细的信息已经描述过了。38,39..简单地说，至少有三个兄弟姐妹的家庭(其中两个被诊断为精神分裂症)被招募进来。所有被招募的受试者都接受了基因研究诊断访谈(Digs)的采访。40，并附有基因研究的家庭诊断访问(图)(https://www.nimhgenetics.org/interviews/figs/)。最后的诊断评估是基于诊断和统计手册(DSM-IV)第四版的标准，与挖掘记录、无花果、面试官笔记和医院分析相结合。采集全血标本，送往国家心理健康研究所(NIMH)保存和基因组资源(RGR)，转化成淋巴母细胞株并保存。从细胞株中提取DNA样品进行WGS。从TSLS中选取了20个中国家庭(共101人)。选择标准是每个家庭至少有两个受影响的兄弟姐妹，(2)在32岁或以上至少有一个未受影响的兄弟姐妹，(3)至少有一个父母。在这20个家庭中，8个家庭有双亲，其余12个家庭只有一个父母。两名受试者在亲属关系分析后被排除在外。6，因为他们不属于20个家庭中的任何一个，最终导致99名受试者进行分析。对最初的研究获得了所有参与者和/或其法定监护人的知情同意，本报告所报告的研究得到弗吉尼亚联邦大学机构审查委员会的批准，因为最初是在那里开始的，然后转到拉斯维加斯的内华达大学。所有方法均按照有关准则和条例进行。

WGS、变量调用和注释

WGS是在Illumina HiSeq号上进行的。2000平台采用配对化学和75个碱基对阅读长度通过Novogene(北京，中国)。Novogene进行了第一轮的质量控制，删除了适配器序列，并修剪了低质量的读取.一旦从Novogene收到FASTQ文件，基因组分析工具包(GATK，版本3.7)最佳实践管道41,42,43以处理序列读取(参见图1)。1和补充说明S6)。简单地说，任何剩余的Illumina适配器序列都是通过Picard删除的，并使用Burrows-Wheeler对齐器对齐读取。GATK单型呼叫函数调用单个样本变体，然后利用GATK的GenotypeGVCFs进行联合基因分型，生成多样本变异调用格式(VCF)文件。GRCH 37/hg 19作为人类参考基因组。第二轮质量过滤，如删除残留的低质量读取，基本质量分数重新校准，和不同质量分数重新校准，在GATK的最佳实践管道的各种预处理工具。所有VCF文件都使用ANNOVAR进行注释。44提取功能注释，GATK变体注释提取变体注释。交互式基因组查看器(IGV)(http：/Software.Broadstitute.org/Software/IGV/)8,9用于直观地检查被调用的变体。在目前的研究中以FASTQ文件格式产生的整个基因组测序项目PRJNA 551447已存放在国家生物技术信息中心(NCBI)储存库。

基于聚合酶链反应(PCR)的Sanger测序验证

对于发现候选变异体的家系，根据标准分子生物学方法(ABI 3130基因分析仪，热Fisher科学)，对所有家族成员的DNA进行PCR-毛细管电泳Sanger测序。Primer3Plus45,46PCR引物的设计。CHST 9缺失的前引物序列为5‘-AAAAAAGCATGTTTA-3’，反向引物序列为5‘-CAGATGCTTCTCTCCT-3’。在Eppendorf MasterCycler(Eppendorf North America，New York，USA)上，在以下循环条件下进行了反应：95°C变性2 min，95°C变性15 s，55°C变性30 s，72°C反应30秒，72°C变性5 min。然后用Chromas软件对Sanger测序数据进行分析。47(https：/seqcore.brcf.med.umich.edu/site/default/files/html/解释性.).

潜在风险变量的选择

潜在风险变异发现是使用以下程序进行的。首先，所有被发现仅发生在受影响的兄弟姐妹中的变异，而不是在单个家族中未受影响的兄弟姐妹中出现的变体，都被保留下来，而所有其他的变体都被删除。保留的变异体被认为有可能与家族内的疾病相关。其次，这些变异体随后在不同的家庭中匹配。在两个或两个以上家系中发现的变异体被选为进一步分析的候选。第三，根据外显子、内含子等基因组功能对变异体进行分类。在此分析中，导致氨基酸变化的编码变异(即非同义SNP)和移码插入和缺失(Indels)是研究的主要焦点。第四，用Sanger测序验证移码突变。第五，结合Yates修正和蒙特卡罗模拟检验，采用卡方检验进行关联分析。已证实的潜在风险变异体与大型外显子和基因组序列数据库中的MAF进行了比较(详见“卫星分析”一节)。我们提出，我们的WGS研究对象要么是高危携带者(父母)，要么是病例(患有精神分裂症的儿童)，而这些数据库中的受试者是一般的人群对照。

统计分析

本研究采用了两种方法。第一种是采用卡方检验的病例对照方法.采用R函数chisq.test进行皮尔逊卡方检验，并进行了Yates修正和蒙特卡罗模拟检验。48..本试验计算了精神分裂症患者(精神分裂症患者)、携带者(病例父母)和对照组(如上文提到的GNOMAAD、ExAC和CNGMD v.5.0等数据库中的一般人群)等位基因频率的差异。rs752084147的变异频率在不同人群的不同数据库中存在差异。根据初步研究，这20个台湾家庭都是汉族人。38,39因此，CNGMD v.5.0数据库中的一般汉文作为对照，被认为是最好的参考。在CNGMDv.5.0数据库中，汉族人群rs752084147的缺失频率为0.00076(5254个等位基因中的4个等位基因)。在后一次卡方检验中，我们将此频率作为对照参考.在这里，虽然每个家庭有两个或更多受影响的人，但我们在每个家庭中只算一例。这是因为这些兄弟姐妹是有亲属关系的；受影响的兄弟姐妹之间共享的变异很可能是从同一个父母那里传播的。根据我们的研究设计，我们考虑了两个方案来评估这20个家系中CA缺失的频率。假设1：考虑这20个家庭的父母是高危人群(携带者)，我们将他们的等位基因数与一般汉族人群进行了比较。在此条件下，40个潜在携带者(20个家系，各贡献4个等位基因)共有80个有效等位基因。因此，在总共80个等位基因中，载体组的等位基因数为2个CA缺失等位基因。情景2：以20个家系的受影响对象为例，将其等位基因数与汉族人群进行比较。在方案2中，我们可以在20例病例中共计算出40个有效等位基因(20个家系，每个家系贡献2个等位基因)。同样，由于上述原因，我们在每个家庭中只计算了一个案例。因此，病例组的等位基因数为2个等位基因，在总共40个等位基因中存在CA缺失。假设2是病例与控制的直接比较，因此，我们认为它更合适。

第二种方法是基于家庭的种族隔离分析。在这里，我们使用了乔教授报道的基于基因的分离试验(Gese)的R包法。等人.12,13在孟德尔分离和100%外显率的假设下。在这种方法中，一个单一基因的多个突变可以联合评估与感兴趣的疾病的关联，考虑到在一般人群中观察到的频率。即使精神分裂症是一种复杂的、不完全外显的疾病，隔离分析也是适当的。因此，我们用它来估计在汉族人群中观察到的CA缺失频率的家系的分离概率，并采用模拟方法来评估与精神分裂症的关联。