脂质运载蛋白2在雷公藤红素介导的食物摄入和体重下降中不起作用

雷公藤红素是一种瘦素敏化剂，对饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠具有深远的抗肥胖作用。然而，介导雷公藤红素诱导的瘦素致敏的基因和途径尚未完全了解。通过比较雷公藤红素和载体处理的DIO小鼠的下丘脑转录组，我们鉴定了脂质运载蛋白-2(Lcn2)作为雷公藤红素最强上调的基因。LCN2以前被认为是一种厌食和减肥药物。雷公藤红素增加下丘脑、肝脏、脂肪、肌肉和骨髓以及血浆中的LCN2蛋白水平。然而，LCN2的遗传缺陷既没有改变饮食诱导肥胖的发展，也没有改变雷公藤红素促进体重减轻和改善肥胖相关的体内平衡失调的能力。我们得出结论，LCN2对于高脂饮食诱导的肥胖和雷公藤红素的治疗减少都是不可或缺的。

普遍肥胖对全球人类健康构成挑战。2015年，估计有1.077亿儿童肥胖，占全球儿童总数的5%1。到2025年，预计39%的成年人(18%的男性和21%的女性)肥胖，包括15% (6%的男性和9%的女性)体重超过40公斤/米2体重指数2,3。令人担忧的是，仅在2017年，高体重指数就导致了全球400万人死亡1。尽管有这些事实，但对肥胖的有效非手术治疗尚未在人类身上实现。

瘦素，一种脂肪细胞衍生的激素，在瘦素缺乏时抑制食欲并减轻体重，最初为肥胖症的有效治疗带来了希望4,5,6,7,8,9,10。瘦素最初被发现后不久，人们意识到大多数肥胖人群循环瘦素浓度高，并且在减少食物摄入和体重方面对外源性瘦素给药无反应，这导致瘦素抵抗的概念11,12。瘦素抵抗以及细胞因子抵抗的发展13,14在2000年，肥胖症为肥胖症的发展提供了新的见解，也是一条潜在的治疗途径.

我们以前鉴定了雷公藤红素，一种从雷神藤根提取物中分离的五环三萜(雷公藤)，作为强瘦素敏化剂和抗肥胖剂15。最近的出版物也证实了这些观察结果16。口服雷公藤红素可将饮食诱导肥胖(DIO)小鼠的体重降低45%以上，这是迄今为止报道的最强的抗肥胖作用，并进一步改善DIO小鼠的胰岛素抵抗/2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎、高胆固醇血症和肝损伤15。雷公藤红素对瘦素受体突变小鼠没有减肥作用(db/db)，并且对瘦素缺乏(向船外/向船外)肥胖模型15,16。因此，雷公藤红素是瘦素敏化剂，其功能依赖于完整的瘦素信号。

我们以前记录了雷公藤红素降低内质网应激15，它在瘦素抵抗的发展中起着核心作用17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。然而，雷公藤红素降低雌激素受体应激和增加瘦素敏感性的主要靶点或途径仍然未知。了解雷公藤红素的作用机制不仅可以深入了解瘦素信号传导和抵抗的潜在生物学，还可以为肥胖症的有效治疗开辟新的途径。

雷公藤红素增加LCN2水平

为了研究雷公藤红素抗肥胖和瘦素增敏作用的机制，我们探讨了雷公藤红素如何影响下丘脑基因表达。饮食诱导肥胖(DIO)小鼠用赋形剂或雷公藤红素治疗四天(100微克/千克，静脉注射，每天一次)；如前所述，提取下丘脑并将该基因用于微阵列杂交20。为了通过雷公藤红素鉴定最高调节基因，我们要求同时满足两个阈值标准:首先，雷公藤红素处理的小鼠与载体处理的小鼠中每个基因的上调或下调倍数(倍数变化，FC)大于2 (|log)2(本币)| % 3E 1)；其次，相关联的P值小于0.001 (-log10（P)%3E 3)(“火山”图1a)。该分析表明雷公藤红素处理强烈上调40个基因，下调6个基因。脂质运载蛋白-2(Lcn2)被鉴定为雷公藤红素治疗的DIO小鼠下丘脑中最上调的基因(图。1b，c)。

Lcn2是雷公藤红素治疗的DIO小鼠下丘脑中上调最多的基因。（a)火山图描绘了雷公藤红素对DIO小鼠下丘脑基因的调节。（b)顶生雷公藤红素调节基因的折叠变化(FC)，其具有FC %3E 2和相关的P%3C 0.001由双尾确定t测试。（c)热图，代表用载体或雷公藤红素(每天100克/千克，静脉注射)处理4天的DIO小鼠下丘脑中雷公藤红素调节基因(40个上调基因和6个下调基因)的相对折叠变化。每列代表一个单独的鼠标，n=每组4只小鼠。Lcn2用红色表示。（d–g)用赋形剂(Veh)或雷公藤红素(Cel)治疗DIO小鼠6小时(250微克/千克，静脉注射)，或1天、4天或3周(100微克/千克，每天一次)和下丘脑Lcn2比较基因水平。下丘脑的Lcn2后mRNA水平(b)6小时(Vehn= 18，Celn= 18)，(c1天(Vehn= 15，Celn= 16)，(d)4天(Vehn= 19，Celn= 20)或(e)3周(Vehn= 11，Celn= 9)。数值表示平均s.e.m .P值由双尾学生决定t测试。*P%3C 0.05，**P% 3C 0.01 * * *P%3C 0.001。

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以前有人认为LCN2通过对黑皮质素4受体(MC4R)信号的作用来降低食欲和体重27。因此，我们研究了LCN2是否在雷公藤红素介导的食物摄入和体重下降中起作用。我们首先检查了下丘脑的调节Lcn2用定量聚合酶链反应(qPCR)在用赋形剂或雷公藤红素处理6小时(250微克/千克，静脉注射)或1天、4天或3周(100微克/千克，静脉注射，每天一次)的DIO小鼠中的基因表达。下丘脑的Lcn2雷公藤红素在所有测试时间点的表达都显著增加(图1d–g)。

因为从骨髓到血浆的LCN2分泌以前被认为是调节食物消耗和体重的中枢作用27，我们检查了雷公藤红素治疗是否提高了循环LCN2水平。用雷公藤红素治疗DIO小鼠6小时(250微克/千克)或1天、4天和3周(100微克/千克，静脉注射，每天一次)，然后测量血浆LCN2。雷公藤红素处理后6小时循环LCN2显著增加(P%3C 0.05，车辆对车辆)(图2a)，并且在雷公藤红素处理的DIO小鼠与赋形剂处理的小鼠中保持在显著更高的水平(P%3C 0.01，经过1天或4天的治疗P%3C 0.001，治疗3周后，车辆对车辆(图2b–d)。

雷公藤红素治疗可全面增加LCN2的表达。（a–d)给DIO小鼠施用赋形剂(Veh)或雷公藤红素(Cel)6小时(250微克/千克，静脉注射)，1天，4天和3周(每天100微克/千克，静脉注射)，并分析血浆LCN2水平。用醋酸乙烯酯或醋酸乙烯酯处理的DIO小鼠血浆半数致死浓度(纳克/毫升)为(a)6小时(Veh，n= 18和Cel，n= 18)，(b1天(Veh，n= 8和Celn= 8)，(c)4天(Veh，n= 28和Celn= 28)或(d)3周(Veh，n= 19和Cel，n= 19)。（e–j)在(e)骨髓f)下丘脑(g)肝脏(h)腹股沟白色脂肪组织(i)棕色脂肪组织和(j)用Veh或Cel (100微克/千克，每日有效剂量)处理DIO小鼠肌肉5天。mRNA结果是下丘脑(Veh，n= 12和Cel，n= 11)，肝脏(Veh，n= 13和Cel，n= 13)和两组骨髓(Veh，n= 11和Cel，n= 10)，WAT (Veh，n= 8和Cel，n= 8)，最佳可得技术(Veh，n= 8和Cel，n= 6)和肌肉(Veh，n= 7和Cel，n= 7)。免疫印迹的定量结果是骨髓的两个不同队列的组合(Veh，n= 6和Cel，n= 5)，下丘脑(Veh，n= 5和Cel，n= 5)，肝脏(Veh，n= 5和Cel，n= 5)，WAT (Veh，n= 5和Cel，n= 4)，最佳可得技术(Veh，n= 5和Cel，n= 5)和肌肉(Veh，n= 5和Cel，n= 5)。数值表示平均s.e.m .P值由双尾学生决定t测试。*P%3C 0.05，**P% 3C 0.01 * * *P%3C 0.001。

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接下来我们确定骨髓中的LCN2是否受到雷公藤红素的影响。用赋形剂或雷公藤红素(100微克/千克，静脉注射，一天一次)治疗DIO小鼠五天Lcn2分析骨髓中的基因表达和蛋白质水平。雷公藤红素的给药导致了Lcn2基因表达，以及骨髓中LCN2蛋白水平(P%3C 0.001，车辆对车辆)(图2e)。此外，下丘脑基因表达和LCN2蛋白水平的分析(图2f)，肝脏(图2g)，白色脂肪组织(图2h)，棕色脂肪组织(图2i)和肌肉(图2j)揭示了雷公藤红素诱导的这些组织中LCN2水平的增加，表明雷公藤红素对LCN2的整体上调。

LCN2缺乏不会加速饮食诱导的肥胖

以上结果，以及莫斯科的上一份报告以及其他人。27，导致我们假设雷公藤红素诱导下丘脑或循环中LCN2的上调可能介导或至少促成雷公藤红素的厌食和抗肥胖作用。因此，我们获得了脂质运载蛋白-2敲除小鼠(Lcn2/)28来检验这个假设。基因组聚合酶链反应和组织LCN2蛋白的评估用于验证Lcn2/老鼠和野生型同窝动物(Lcn2+/+)(图3a，b)。Lcn2/小鼠在不同组织和血浆中都没有检测到LCN2的表达(图3c)。当喂食HFD 20周以诱导肥胖时，Lcn2+/+和Lcn2/小鼠体重增加相当(图3d)。HFD喂养过程中24 h食物摄入量分析(图3e)，在12小时的亮或暗循环中(图3f)，或者在禁食16小时后的再喂养期间(图3g)显示两者之间没有显著差异Lcn2+/+和Lcn2/老鼠。根据这些观察结果，我们没有检测到两者之间循环瘦素水平的显著差异Lcn2+/+和Lcn2/老鼠(图3h)。

LCN2缺乏不会加速饮食诱导的肥胖。Lcn2击倒(Lcn2/)老鼠和它们的野生型(Lcn2+/+)同窝仔喂HFD大约20周，以诱导肥胖。测量体重和食物摄入量。（a)显示以下基因的聚合酶链反应基因分型的代表性图像Lcn2/和Lcn2+/+老鼠。（b)下丘脑和肝脏中LCN2和微管蛋白的代表性免疫印迹Lcn2+/+和Lcn2/雷公藤红素治疗(100微克/千克，静脉注射，每天一次)3周后的小鼠。（c)中的血浆LCN2水平Lcn2+/+和Lcn2/HFD喂养16周后的小鼠。（d)的体重变化Lcn2+/+和Lcn2/HFD喂食期间的老鼠(Lcn2+/+，n= 13和Lcn2/，n= 23)。（e)每只老鼠24小时的平均食物摄入量。d组和e组的实验在两组中重复进行(总共n= 25英寸Lcn2+/+群组和n= 30英寸Lcn2/群组)。（f)光明和黑暗循环的食物摄入Lcn2+/+和Lcn2/HFD喂养10-14周的老鼠。（g)的累积食物摄入量Lcn2+/+和Lcn2/禁食15小时后，小鼠在1、2、4、6和8小时内再次进食。（h)血浆瘦素水平Lcn2+/+和Lcn2/HFD喂养不同周的老鼠。n=每组5个。（I–k)DEXALcn2+/+和Lcn2/喂食HFD 20周后的小鼠(Lcn2+/+，n= 13和Lcn2/，n= 23):(i)精益质量，(j)脂肪量和(k)HFD喂养20周后体脂质量百分比。数值表示平均s.e.m .P数值通过双向方差分析和Bonferroni的多重比较测试来确定t测试(c和e–k)。***P%3C 0.001。

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接下来，我们使用双能x光吸收仪(DEXA)扫描来确定Lcn2+/+对抗Lcn2/老鼠。与体重的趋势一致，在身体组成上没有发现差异，包括瘦体重(图3i)，脂肪量(图3j)和体脂质量百分比(图3k)介于Lcn2+/+和Lcn2/HFD喂养20周后的老鼠。总之，这些结果表明，在高脂肪饮食喂养期间，LCN2缺乏不会增加食物消耗量或肥胖程度。

LCN2缺乏不会改变DIO小鼠受损的葡萄糖稳态或肝功能

为了评估LCN2缺乏对葡萄糖稳态的影响，我们进行了葡萄糖耐量(GTT)和胰岛素耐受性(ITT)试验。GTT期间葡萄糖从循环中的清除与DIO相似Lcn2+/+和Lcn2/老鼠(图4a，b)，ITT认为两组之间胰岛素敏感性没有差异(图4c，d)。对进食和禁食状态下血糖水平的分析表明，对照组和禁食状态下的血糖水平没有差异Lcn2/整个研究期间的小鼠(图4e，f，g)。在为期20周的HFD喂养研究中，血浆胰岛素水平也没有显著差异(图4h)。DIO血浆天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平相似Lcn2+/+和Lcn2/小鼠，表明LCN2缺乏对肝功能也没有影响(图4i，j)。

LCN2缺乏不会改变DIO小鼠受损的葡萄糖稳态或肝功能。Lcn2击倒(Lcn2/)老鼠和它们的野生型(Lcn2+/+)为了诱导肥胖，窝产仔喂了HFD大约20周。（a)HFD喂养14周后的葡萄糖耐量试验(GTT)，以及(b)GTT图的曲线下面积(AUC)分析。（c)HFD喂养16周后的胰岛素耐受性试验(ITT)，以及(d)ITT曲线的曲线下面积分析(Lcn2+/+,n= 13和Lcn2/,n= 23)。（例如)喂食，在HFD喂食期间指定时间点的6小时禁食和15小时禁食血糖水平。（h)血浆胰岛素浓度Lcn2+/+和Lcn2/老鼠在整个HFD指定的时间点进食。（i)血浆天冬氨酸转氨酶和(j)HFD喂养16周后丙氨酸转氨酶水平，n= 12Lcn2+/+和n= 7代表Lcn2/；ALT，n= 5代表Lcn2+/+和n= 3Lcn2/)。数值表示平均s.e.m .P数值通过双向方差分析和Bonferroni多重比较试验确定(a和c)或双尾学生的t测试(b和d–j)。

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LCN2在雷公藤红素的抗肥胖作用中不起作用

上述分析Lcn2+/+和Lcn2/小鼠在HFD诱发的体重增加或相关代谢失调中没有发现差异。然而，LCN2与降低食欲和体重有关27,29，我们的数据记录了雷公藤红素增加循环中以及不同组织中的LCN2水平。因此，我们推断LCN2可能在调节雷公藤红素的厌食和抗肥胖作用中起作用，因此LCN2缺乏将降低雷公藤红素的厌食作用，并削弱雷公藤红素在DIO小鼠中减轻体重的能力。为了验证这一假设，我们在1980年诱导了肥胖Lcn2+/+和Lcn2/小鼠通过HFD喂养20周，然后用赋形剂或雷公藤红素(100微克/千克，静脉注射，每天一次)治疗每组3周。不出所料，雷公藤红素治疗显著减轻了Lcn2+/+小鼠，相对于车辆注射Lcn2+/+老鼠(P%3C 0.001，车辆对车辆)(图5a，b)。然而，在两个不同的队列中，治疗Lcn2/与雷公藤红素处理的小鼠相似，雷公藤红素处理的小鼠体重减轻Lcn2+/+老鼠(P%3C 0.001，车辆对车辆)(图5a，b和补充图1a，b)。年食物摄入量减少Lcn2+/+和Lcn2/雷公藤红素处理后的小鼠也没有显著差异(图5c和补充图1c)。此外，对总瘦质量、脂肪质量和体脂质量百分比的分析表明，在雷公藤红素处理的情况下，瘦质量没有改变，体脂质量百分比也降低到相同的程度Lcn2+/+和Lcn2/老鼠(图5d-f和补充图1d-f) (P%3C 0.001，车辆对车辆)。同时，两组瘦素水平通过雷公藤红素治疗同等降低(图5g和补充图第一代)。

LCN2不介导雷公藤红素的抗肥胖作用。Lcn2+/+和Lcn2/给DIO小鼠服用赋形剂(Veh)或雷公藤红素(Cel，100微克/千克，静脉注射，每天一次)，持续3周。（a)体重和(b)体重变化百分比Lcn2+/+和Lcn2/雷公藤红素治疗期间的小鼠(n= 6，适用于车辆和n= 7，用于青瓷Lcn2+/+老鼠；n= 11，适用于车辆和n= 12英寸，用于celastrol inLcn2/老鼠)。（c)平均24小时食物摄入量Lcn2+/+和Lcn2/雷公藤红素治疗第一周的小鼠。（d–f)DEXA在接受雷公藤红素治疗3周后: (d)精益质量，(e)脂肪量和(f)身体脂肪质量百分比。（g)血浆瘦素水平(纳克/毫升)Lcn2+/+和Lcn2/雷公藤红素治疗1周后的小鼠。实验在两个独立的队列中重复进行(总共n= 6，适用于车辆和n= 18英寸，用于青瓷Lcn2+/+团体；n= 11，适用于车辆和n= 19，用于青瓷Lcn2/群组)。数值表示平均s.e.m .P数值通过双向方差分析和Bonferroni多重比较试验确定。*P%3C 0.05，**P% 3C 0.01 * * *P%3C 0.001，不显著(P%3E 0.05)。

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LCN2缺乏不影响雷公藤红素对葡萄糖稳态的改善

雷公藤红素治疗改善DIO小鼠葡萄糖稳态15,16。因此，我们进行了GTT和ITT的研究，以探讨雷公藤红素治疗对葡萄糖稳态的改善是否受到LCN2缺乏的影响。GTT在第二周的治疗中显示雷公藤红素在2006年也同样提高了葡萄糖耐量Lcn2+/+和Lcn2/老鼠(图6a，b，补充图2a，b)。ITT还记录了雷公藤红素治疗后胰岛素敏感性的增加在Lcn2+/+和Lcn2/小鼠，组间无显著差异(图6c，d，补充图2c，d)。随着糖耐量和胰岛素敏感性的提高，两者的血糖水平都显著降低Lcn2+/+和Lcn2/雷公藤红素处理的小鼠，相对于其载体处理的对照组(图6e补充图e-g)。在治疗结束时，我们发现雷公藤红素治疗组与对照组之间的血浆胰岛素水平没有显著差异Lcn2+/+和Lcn2/老鼠(图6f，补充图2h)。谷丙转氨酶和谷草转氨酶的分析表明雷公藤红素能改善两者的肝功能Lcn2+/+和Lcn2/老鼠(图6g，h补充图2i，o)。最后，肝组织的组织学分析显示雷公藤红素降低了两者的肝脂肪变性Lcn2+/+和Lcn2/老鼠(图6i)。

LCN2缺乏不影响雷公藤红素对葡萄糖稳态的改善。Lcn2+/+和Lcn2/给DIO小鼠服用赋形剂(Veh)或雷公藤红素(Cel，100微克/千克，静脉注射，每天一次)，持续3周。（a)GTT和(b)雷公藤红素治疗1周后GTT的AUC分析。（c)ITT和(d)雷公藤红素治疗2周后ITT的AUC分析。（e)雷公藤红素治疗1周后的6小时空腹血糖。（f)雷公藤红素治疗3周后血浆胰岛素水平。等离子体(g)AST和(h)雷公藤红素治疗3周后的ALT水平。（i)肝脏切片的苏木精和伊红染色Lcn2+/+和Lcn2/雷公藤红素治疗3周后的小鼠。数值表明平均信噪比。a-h实验在两个独立的队列中重复进行(总计n= 6，适用于车辆和n= 18英寸，用于青瓷Lcn2+/+团体；n= 11，适用于车辆和n= 19，用于青瓷Lcn2/群组)。P数值通过双向方差分析和Bonferroni多重比较试验确定。*P%3C 0.05，**P% 3C 0.01 * * *P%3C 0.001，不显著(P%3E 0.05)。

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雷公藤红素可增加瘦肉和db/db老鼠。瘦还是db/db用赋形剂(Veh)或雷公藤红素(Cel，100 μg/kg，i.p .，每天一次)治疗小鼠3天。每天测量体重和食物摄入量。每组小鼠随后在禁食6小时前的第四天早晨接受单一剂量的赋形剂或雷公藤红素(200微克/千克，国际标准品)。（a)体重和(b)瘦鼠每只小鼠平均24小时食物摄入量。（c)雷公藤红素治疗4天后瘦鼠血浆LCN2水平。n= 9代表Veh和nCel为10。（d)体重和(e)24小时内每只老鼠的平均食物摄入量db/db老鼠。（f)血浆LCN2水平db/db雷公藤红素治疗4天后的小鼠。n=两组均为8。数值表示平均s.e.m .P数值由双向方差分析确定，采用Bonferroni多重比较测验(a，d)和双尾学生测验t测试(b、c、e、f)。***P%3C 0.001，不显著(P%3E 0.05)。

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雷公藤红素增加雷公藤红素不敏感的瘦肉中的LCN2水平db/db老鼠

雷公藤红素对瘦小鼠或瘦素受体缺乏的小鼠没有厌食作用或促进体重减轻db/db老鼠15。为了研究LCN2水平与雷公藤红素反应性之间的关系，我们采用了精益或db/db用雷公藤红素(100 g/kg，i.p，每天一次)给小鼠注射4天，并测量血浆中的LCN2水平。雷公藤红素治疗不会导致明显的体重减轻(图7a)或食物摄入量减少(图7b)在瘦老鼠身上。然而，与DIO模型相似，雷公藤红素治疗显著增加了瘦小鼠血浆中的LCN2水平(P%3C 0.001，车辆对车辆)(图7c)。雷公藤红素治疗也显著提高了血浆LCN2水平db/db老鼠(P%3C 0.001，车辆对塞尔)，其中雷公藤红素治疗既不减少体重也不减少食物摄入(图7d-f)。连同正常的反应Lcn2/小鼠到HFD喂养和雷公藤红素(上)，这些结果说明LCN2在饮食诱导肥胖的发展中不发挥作用，或者在雷公藤红素对其治疗的减少中不发挥作用。

试剂

丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)颜色终点检测试剂盒购自德克萨斯州奥斯汀的生物科学公司。BM化学发光印迹底物(POD)和10X封闭试剂来自罗氏诊断公司(印第安纳波利斯，印第安纳州)。塞拉斯托尔是从中国银行科学(雪莉，纽约)购买的。iScript基因合成试剂盒和SYBR绿色超级混合物购自Bio-Rad(加利福尼亚州大力士)。辣根过氧化物酶结合的抗山羊抗体是从圣克鲁斯生物技术公司(加利福尼亚州圣克鲁斯)获得的。GAPDH特异性抗体(#2118)和辣根过氧化物酶结合的抗兔抗体购自细胞信号技术公司(马萨诸塞州贝弗利)。脂质运载蛋白-2/NGAL抗体(AF1857)、其相应的酶联免疫试剂盒(MLCN20)和重组小鼠瘦素蛋白从R&D系统(明尼苏达州明尼阿波利斯市)获得。小鼠瘦素和超敏感小鼠胰岛素酶联免疫试剂盒购自晶体化学公司(伊利诺伊州唐纳斯格罗夫)。三唑试剂从Invitrogen(加利福尼亚州卡尔斯巴德)获得。RNeasy MinElute清理工具包购自Qiagen (#74101，加利福尼亚州巴伦西亚)。

动物和治疗

波士顿儿童医院的动物护理和使用委员会批准了本研究中进行的所有动物实验(方案编号:16-05-3168 R)。所有的动物实验都是根据国际动物保护和使用委员会的标准操作程序进行的。

野生型C57BL6/J小鼠(库存编号000664)，db/db小鼠(库存编号000697)，以及Lcn2纯合敲除小鼠(库存编号024630)购自杰克逊实验室。小鼠杂合子Lcn2突变(Lcn2+/-)由雄性杂交产生Lcn2纯合敲除(Lcn2/)带有野生型雌性小鼠的小鼠。野生型(Lcn2+/+)和纯合的同窝配偶Lcn2/突变是交叉产生的Lcn2+/-老鼠。

获得饮食诱导肥胖(DIO)小鼠、野生型C57BL6/J小鼠和Lcn2/或者Lcn2+/+雄性小鼠被置于高脂肪饮食中(HFD，45 kcal%来自脂肪；猫。D12451，新泽西州新不伦瑞克的研究饮食)，四周大时，保持相同的饮食16-20周。八周大db/db瘦老鼠被置于正常饮食中(NCD，13.5%的热量来自脂肪；猫。0006973，密苏里州圣路易斯实验室饮食)。小鼠被置于12小时暗/亮循环中，暗循环持续从晚上7点到早上7点。所有老鼠都有随意获得食物和水，除非另有说明。除非另有说明，将雷公藤红素溶解在无菌二甲基亚砜(25升)中，并在黑暗周期前60-90分钟腹腔内给药。给相应的载体组注射总体积为25 l的无菌二甲基亚砜。

采血

用肝素化毛细管从尾静脉收集血液，然后转移到冰冷的eppendorf管中，在4℃下以3000转/分钟离心30分钟。血浆部分转移到新的小瓶中，并在80℃下储存

骨髓隔离

为了检测雷公藤红素对骨髓表达水平的影响，用赋形剂或雷公藤红素(每天100微克/千克，静脉注射)治疗DIO小鼠4天；在第五天光周期开始后60分钟，给小鼠施用赋形剂或雷公藤红素(200微克/千克，静脉注射)，然后禁食6小时。使用25号针头和5 cc注射器将骨髓从股骨髓腔冲洗到15毫升带有冰冷PBS的试管中。然后将细胞在4℃下以1000转/分钟离心10分钟。弃去所得上清液。骨髓立即在液氮中冷冻，并在80℃下保存，直至分析。

骨髓是从三个独立群组的小鼠中收集的。在第一个队列中，骨髓被冲洗到15毫升试管中，并在离心前在冰上放置2小时。这使得我们能够完成队列中额外的组织收集，但是骨髓的质量受到了影响。因此，我们从这个队列中排除了骨髓分析的结果。在第二组和第三组中，为了确保样品的质量，我们将骨髓冲洗到15毫升试管中，立即离心，并在上清去除后立即用液氮冷冻样品。

身体成分测量

我们使用双能x光吸收法评估了总瘦体重、脂肪质量和体脂百分比(lean美国威斯康星州麦迪逊通用月球公司月球像素2)。

葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐受性试验(ITT)

对于GTT，小鼠禁食15小时(下午5点到上午8点)，并给予葡萄糖(1 g/kg)。在给予葡萄糖之前和之后15、30、60、90和120分钟，从尾部测量血糖水平。

对于ITT，小鼠禁食6小时(从上午8点到下午2点)。施用重组人胰岛素(1 IU/kg)。在施用胰岛素前和施用胰岛素后15、30、60、90和120分钟从尾部测量血糖水平。

总蛋白提取和蛋白质印迹

下丘脑、褐色脂肪组织、腹股沟脂肪组织、肝脏、脂肪、肌肉和骨髓用台式组织裂解器ⅱ在冰冷组织裂解缓冲液(25 mM Tris-HCl，pH7.4；100毫米NaF50毫米Na4P2O7；10毫米Na3VO4；10毫米EGTA；10毫米EDTA1% NP-40；补充磷酸酶和蛋白酶抑制剂)，然后在4℃下以13，400克离心30分钟。使用蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad)定量蛋白质浓度。将蛋白质样品与5倍Laemmli缓冲液混合，并在95℃下煮沸5分钟，然后装载到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上。电泳后，我们在4℃，100伏下将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上2小时，并用10%封闭剂将膜封闭在TBS-0.1%吐温-20 (TBST)中。我们在TBST用含有10%封闭剂的初级抗体孵育了一夜。初次孵育后，我们用TBST洗涤膜三次，每次20分钟，然后在TBST用10%封闭剂在室温下孵育膜和二次抗体1小时。在TBST清洗膜三次后，我们使用化学发光分析系统开发了膜，并使用图像分析仪定量分析了带强度。

总核糖核酸提取和微阵列分析

DIO小鼠连续四天习惯于用载体注射胰岛素。经过这一适应期后，我们用赋形剂治疗四只DIO小鼠，用雷公藤红素(100克/千克)治疗四天60-90分钟，然后进行静脉注射进行黑暗循环。15小时后，给小鼠额外注射赋形剂或雷公藤红素(200克/千克)。六小时后，我们提取下丘脑，并将其冷冻在液氮中。下丘脑储存在80℃直到提取核糖核酸。为了提取总核糖核酸，我们将下丘脑从80℃移开，并在每个样品中加入500升三唑。用台式组织裂解仪(Qiagen，Valencia，CA)对组织进行匀浆，根据制造商的三唑裂解试剂说明提取下丘脑核糖核酸。对于微阵列分析，提取的总核糖核酸用RNeasy Min clean Kit(74104，QIAGEN)清洗，1 g总核糖核酸用于微阵列。

cDNA合成及定量实时聚合酶链反应

DIO小鼠用二甲基亚砜适应7天，并在需要的时间注射二甲基亚砜或雷公藤红素。在最后注射和禁食后6小时，移除组织，包括下丘脑、褐色脂肪组织、腹股沟脂肪组织、肝脏、肌肉和骨髓。按照制造商的方案，用三唑裂解试剂从组织中提取总核糖核酸。互补脱氧核糖核酸(cDNA)是根据制造商的协议，使用基因合成试剂盒(Bio-Rad)用1微克总核糖核酸合成的。定量聚合酶链反应由赛伯·格林在QuantSTudio 6灵活实时聚合酶链反应系统(生命技术)上进行。通过比较Ct方法计算感兴趣基因的相对表达RN18S被用作内源性对照。用于检测基因的引物如下:

Lcn2:前进:5′-tggccctgagtgTCATGTG-3 '

反向:5′-CTCTGTAGCTATAGATAGGGTGC-3′

RN18S:前进:5′-AGTCCCtgCCCTTTGTCACA-3′

反向:5′-CGATCCGAGGCCTCACTA-3′

小鼠血浆中激素和代谢物的测定

血浆LCN2、瘦素、胰岛素、谷丙转氨酶和谷草转氨酶根据制造商的说明使用相应的酶联免疫吸附试验或检测试剂盒进行测量。用LCN2酶联免疫吸附法将DIO小鼠血浆稀释100倍，用瘦素酶联免疫吸附法稀释5-10倍。我们用5 L血浆进行胰岛素酶联免疫吸附试验和谷草转氨酶试验，用10 L血浆进行谷丙转氨酶试验。

苏木精伊红染色

用赋形剂或雷公藤红素(100微克/千克)治疗DIO小鼠三周后，解剖它们的肝脏并将其保存在10%缓冲的福尔马林磷酸盐中。石蜡包埋肝切片进行氢氧染色。

统计分析

所有数据均显示为平均标准差。统计显著性使用学生t检验(双尾)或双向方差分析Bonferroni多重比较检验进行测量，如图图例所示。P低于0.05的值被认为是显著的。队列数量和n每个实验的数值在图例中显示。实验结束前死亡或患病的小鼠或统计异常值(由格拉布异常值测试判断)被排除在最终分析之外。没有使用盲法或随机化。没有使用统计方法来预先确定样本量，样本量是根据以前的实验和文献确定的。在被比较的组中，差异是相似的。

雷公藤红素是迄今报道的最有效的减肥药物15，减少雌激素受体应激，雌激素受体应激是瘦素抵抗发展和过量卡路里摄入期间进食和体重调节的中心机制17,25,26。因此，了解雷公藤红素的抗肥胖作用所涉及的网络可以揭示肥胖症治疗的主要目标，并为肥胖症治疗的发展开辟新的途径。排除celastrol行为的某些潜在介质对这一实验目标也至关重要。

LCN2是一种有效的抑菌剂，在免疫系统的铁消耗策略中发挥作用，通过结合含铁铁载体来控制病原体30,31。在中枢神经系统中，关于LCN2的过程知之甚少，包括由哪些细胞产生/分泌lcn 2，其对细胞增殖和死亡的潜在影响，或对神经元可塑性和行为的影响32。

关于LCN2敲除小鼠模型在肥胖和代谢稳态方面的表型，文献中有相互矛盾的结果。包括血浆和脂肪组织在内的外周LCN2表达水平据报道与肥胖呈正相关33,34。燕等人。艾尔。还报道了LCN2促进分离的脂肪细胞和肝细胞的胰岛素抵抗34。与这些结果相一致的是，LCN2缺乏被认为可以预防HFD诱导的肥胖和胰岛素抵抗35。然而，莫瓦卢以及其他人。报告了全球删除Lcn2在饮食喂养下增加食物摄入量和体重27，和郭等人。艾尔。建议DIOLcn2/小鼠容易发展成肥胖和葡萄糖耐受不良29。我们没有发现体重有什么不同Lcn2+/+和Lcn2/老鼠。我们也没有发现两者之间葡萄糖稳态参数有任何差异Lcn2+/+和Lcn2/老鼠。从相似的小鼠模型或不同动物设施中的相同小鼠模型中看到不同的表型并不少见，即使是在相同动物设施中维护的相同小鼠模型也会随着时间的推移而产生不同的表型36。无论如何，我们注意到遗传的系统性LCN2缺乏可能会促进我们和其他人研究过的小鼠的代谢适应。因此，组织和/或时间特异性缺失Lcn2可能是在未来研究中整合关于LCN2功能的不同发现的有用辅助手段。

骨髓中富含LCN2的表达，并且从骨髓向血浆分泌LCN2已被建议增加大脑中的MC4受体活性并减少食物摄入和体重27。考虑到我们自己关于雷公藤红素增加骨髓和血浆LCN2的结果，我们假设LCN2可能介导雷公藤红素的抗肥胖作用。Lcn2+/+和Lcn2/尽管基因敲除小鼠没有任何可检测到的LCN2，但在雷公藤红素治疗前，DIO小鼠在HFD饮食中达到了相同程度的肥胖。我们预计，如果LCN2是一个重要的厌食因子，雷公藤红素治疗过程中的LCN2缺乏至少会在一定程度上减弱雷公藤红素的食欲抑制和抗肥胖作用。然而，Lcn2/DIO小鼠对雷公藤红素反应完全正常。此外，我们发现雷公藤红素显著增加了雷公藤红素无反应时的LCN2血浆水平db/db小鼠，其中MC4R信号保持完整。预计LCN2(一种假定的MC4R激动剂)循环水平的增加会抑制糖尿病患者的食物摄入db/db老鼠在某种程度上。然而，db/db用雷公藤红素处理的小鼠与载体处理的对照组没有区别。因此，我们得出结论，LCN2不太可能对厌食症和抗肥胖信号产生重大影响，并且在雷公藤红素介导的食物摄入和体重减轻中不发挥任何作用，尽管雷公藤红素治疗后其在骨髓和血浆中的水平增加。

小鼠下丘脑微阵列的原始数据可获得，登记号为GSE8415620。支持本研究结果的所有其他数据可根据要求从相应作者处获得。