三叉神经节的卫星胶质细胞中丝裂原活化蛋白激酶的激活有助于P物质介导的炎症疼痛 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

三叉神经节的卫星胶质细胞中丝裂原活化蛋白激酶的激活有助于P物质介导的炎症疼痛

抽象

其中物质P（SP）起重要作用的炎性口面疼痛与三叉神经节（TG）神经元和卫星神经胶质细胞（SGC）之间的串扰密切相关。SGC激活正在成为通过不同信号机制潜在炎症性疼痛的关键机制，包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP）激活，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导途径的磷酸化和细胞因子上调。然而，在TG中，由SGC产生的SP介导的口面疼痛的机制在很大程度上是未知的。在本研究中，我们通过上调来自SGCs的白细胞介素（IL）-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α来研究SP是否参与炎症性面部疼痛，并且我们探索了MAPK信号通路是否介导疼痛过程。在目前的研究中，将完全弗氏佐剂（CFA）注射到大鼠的晶须垫中以在体内诱导炎症模型。将SP在体外施用于SGC培养物以确认SP的作用。面部表达分析显示预注射L703,606（一种NK-1受体拮抗剂），U0126（一种MAPK抑制剂/细胞外信号调节激酶[ERK]激酶[MEK] 1/2）和SB203580（抑制剂）（P38）进入TG以诱导靶向预防NK-1受体的活化和MAPK的磷酸化显着抑制CFA诱导的炎性异常性疼痛。此外，SP促进SGC活化，其在炎症条件下通过增加的GFAP，p-MAPK，IL-1β和TNF-α在SGC中得到证实。此外，L703,606，U0126和SB203580在体内和体外均抑制IL-1β和TNF-α的增加。

介绍

面部疼痛是指包括三叉神经痛，颞下颌关节紊乱，偏头痛和正畸疼痛在内的一系列疾病，影响了16％的一般人群并导致生活质量的急剧下降。1，2口面炎症可以改变躯体感觉通路的性质，产生疼痛异常，如过敏症，痛觉过敏和异常性疼痛。3作为口面部疼痛外周途径中的关键中继站，三叉神经节（TG）包含感觉TG神经元和周围卫星神经胶质细胞（SGCs）的体细胞。4，5，6目前的证据表明，SGCs在TG的外周致敏中起重要作用。7 TG神经元和的SGC之间的深刻串扰网络是炎性疼痛口面的调节是至关重要的。8，9

几个化学信使参与此过程中，包括P物质（SP），三磷酸腺苷（ATP），降钙素基因相关肽（CGRP），和γ氨基丁酸（GABA）。10，11例如，TG神经元合成和分泌更多SP以下外周炎症，其激活神经激肽（NK）-1上的SGC受体触发本地旁分泌机制。8，12在脊髓的背根神经节（DRG），有证据表明，活化的SGC和随后的细胞因子的产生，如白细胞介素（IL）-1β 13和肿瘤坏死因子（TNF）-α，14，15有助于慢性神经性疼痛的发展和维持。还显示在炎症和神经损伤的条件下，IL-1β在TG中增加。16然而，在TG的的SGC，底层SP介导的过程的机制在很大程度上是不清楚。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的激活，包括细胞外信号调节激酶（ERK），P38和c-Jun N末端激酶（JNK），17在脊髓DRG神经元中通过外周有害刺激导致疼痛过敏。8，17也已报道，ERK在TG中的SGC激活参与舌神经性疼痛。18然而，ERK，P38，JNK和它们的下游调节剂在炎性疼痛口面在调节期间的SGC的作用仍不清楚。

虽然之前关于SP和细胞内信号通路影响的研究主要集中在DRG和TG中的感觉神经元，但在本研究中，我们的目的是研究SP对SGC细胞内MAPK通路和细胞因子产生的影响。外周激活过程中的口面疼痛。我们的结果表明SP通过激活参与这些过程的NK-1受体和MAPK诱导TG SGC中IL-1β和TNF-α的产生。

结果

炎症诱导的异常性疼痛和MAPK信号传导途径的抑制剂减弱异常性疼痛

在该研究中，使用RGS评分评估大鼠的异常性疼痛水平的变化。从录像带中捕获的图像列于补充图1中。根据RGS分数，我们证明了以下发现。CFA组的RGS评分在第1天增加，在第3天达到峰值，在第5天开始减少，但仍然高于媒介物组的评分，并在第7天恢复到基线（图1，n = 5），P <0.05）。在整个观察期间，CFA + DMSO，CFA + SP600125和CFA组之间没有显着差异（图1，n = 5，P > 0.05），表明DMSO是一种没有副作用的安全溶剂，SP600125对大鼠的异常性疼痛没有治疗作用。然而，在CFA + L703,606，CFA + U0126和CFA + SB203580组中，RGS评分在第1天增加，在第3天达到峰值，但仍显着低于CFA组的评分，并在几天内恢复到基线5-7（图1，n = 5，P <0.05），意味着U0126和SB203580可以减弱SP介导的炎性疼痛。

TG中SGC上NK-1受体的表达

为了证实SP通过NK-1受体介导SGCs的活化，在TG和SGC培养物中检测到NK-1受体的表达。在我们的研究中，GS被用作SGC的特异性标记物来分析NK-1受体的位置。如图2a所示，TG神经元被GS-IR细胞包围。SGC和神经元均表达NK-1受体。NK-1受体和GS染色共定位于SGC上（箭头）。体外SGC培养物的IF结果也支持SGC上的NK-1受体表达（图2b）。这些发现表明SP通过激活SGCs上的NK-1受体来调节SGCs的功能，这与先前研究的结果一致。12

SP诱导炎症条件下SGCs中GFAP的上调

GFAP表达与神经胶质细胞的激活有关。19调查是否的SGC由SP炎性条件下活化，GFAP，SGC激活的特殊标记的表达，16，20是由IF染色和WB在体内和体外进行分析。IF分析结果显示在TG切片和SGC培养物中观察到GFAP-IR SGC（图2c，d）。CFA组TG中GFAP-IR SGCs的百分比显着高于体内载体组（图2c，n = 3，P <0.05）。WB结果证实，CFA注射后24小时，与载体组相比，CFA处理组中的GFAP表达显着增加（图2e，n = 6，P <0.05）。然后，我们在体外测量SGC培养物中的GFAP变化以进一步验证SGC的活化（图2d，f，n = 6，P <0.05）。在SP处理的SGC培养物中也观察到类似的模式。因此，在我们的研究中，发现与那些在以往的研究显示，GFAP在上调的SGC炎症条件下，一致的19，21，22 进一步推断SGCs的激活可能在炎性口面疼痛中起重要作用。

SP在炎症条件下上调SGC中的磷酸化MAPK

SGC上NK-1受体的激活可引发各种细胞变化。12为了研究SP对由CFA处理的动物和SGC培养物SP施用的SGC，甘油三酯MAPK信号转导途径的影响，获得检查P-ERK1 / 2，ERK1 / 2，P-P38，P38的表型表达， p-JNK和JNK。如图3a所示，在CFA处理的TG中，在TG神经元（空心箭头）和SGC（实心箭头）中都可以容易地检测到p-ERK染色。与p-ERK的结果相似，p-P38和p-JNK的表达水平在TG神经元和CFA处理的TG中的SGCs中很容易观察到（图3）b，c）。在载体组中几乎没有在SGC上表达p-MAPK，但在CFA组中p-MAPK的表达水平显着增加。在CFA注射的大鼠中，p-ERK，p-P38和p-JNK的免疫反应性也在TG神经元中增加。此外，通过WB分析载体和CFA组中ERK，p-ERK，P38，p-P38，JNK和p-JNK的水平。将p-ERK1 / 2，p-P38和p-JNK的水平相对于它们的总表达水平标准化。根据WB结果，在载体组中观察到低水平的p-ERK，p-P38和p-JNK; 然而，在体内CFA处理后检测到大约2倍的增加（图3d-f，n = 6，P <0.05），表明CFA诱导TG中ERK1 / 2，P38和JNK MAPK信号传导的激活。为了证实上述SGC中MAPK途径的磷酸化是由CFA诱导的炎症模型中TG神经元高度分泌的磷酸化SP诱导的，在体外SGC培养物中检测总MAPK。使用IF染色和WB进行MAPK参与SP相关的SGC活化的初始筛选。IF染色显示p-ERK，p-P38和p-JNK MAPKs在SGC的胞质溶胶和细胞核中表达高表达，与载体SGC相比，SP诱导的炎症反应（图4a-c））。对于WB分析，在SP处理的SGC培养物中观察到类似的结果。结果还表明L703,606（NK-1受体的拮抗剂）抑制p-ERK，p-P38和p-JNK的上调（图4d-f，n = 6，P <0.05）。

SP在炎症条件下上调SGCs中IL-1β和TNF-α的产生

To investigate the effect of SP on the production of IL-1β and TNF-α in SGCs, we designed experiments in vitro and in vivo. In vitro, we incubated the SGCs in vehicle (0.5% DMSO), SP (1 μmol·L–1) and SP (1 μmol·L–1) +L703, 606 (1 μmol·L–1) for 24 h. According to the RT-qPCR results, the IL-1β mRNA was increased approximately 35-fold after SP stimulation compared to after administration of the vehicle. SP-induced upregulation of IL-1β mRNA was blocked by L703, 606 (an NK-1 receptor antagonist) (Fig. 5a, n = 6, P < 0.05). The ELISA results showed similar trends (Fig. 5a, n = 6, P < 0.05). Likewise, TNF-α mRNA was significantly higher after SP stimulation, with an approximately 45-fold increase compared with after administration of the vehicle. L703, 606 reversed the SP-induced increase in TNF-α mRNA (Fig. 5b, n = 6, P < 0.05). Similar results from the ELISA assays showed increased TNF-α expression as mentioned above (Fig. 5b, n = 6, P < 0.05). We further designed experiments in vivo, including with the use of vehicle, CFA, CFA+DMSO and CFA+L703, 606 groups, to further verify that SP is involved in the mediation of IL-1β and TNF-α production in TGs under inflammatory conditions. There were similar findings in vivo according to WB analyses. IL-1β and TNF-α were significantly upregulated under inflammatory conditions in rat TGs, and administration of the vehicle, and L703, 606 inhibited this upregulation (Fig. 5c, P < 0.05, n = 6). These findings indicated that SP mediated the changes in IL-1β and TNF-α in TGs under CFA-induced inflammatory conditions.

MAPK信号通路对SP诱导的SGCs中IL-1β和TNF-α产生的影响

通过在体外和体内测试MAPK抑制剂的作用来评估MAPK在上调来自SGC的IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白质水平中的作用。将SGC单独在SP中孵育或与抑制剂共培养以建立以下组：载体，SP，SP + U0126，SP + SB203580和SP + SP600125。U0126和SB203580对SP诱导的IL-1β增加的抑制是显着的。然而，在我们使用的SP600125剂量下，没有明显的抑制作用（图5a，n = 6，P <0.05）。此外，根据RT-qPCR结果，U0126和SB203580对SP诱导的TNF-α增加的抑制是显着的。然而，SP600125组没有明显的抑制作用（图5b，n = 6，P <0.05）。然而，基于ELISA结果，SB203580的抑制作用不显着。为了证实MAPK途径参与CFA诱导的炎性条件下IL-1β和TNF-α的上调，将MEK，P38和JNK的抑制剂给予TG。WB结果与体外发现相似（图5d，n = 6，P <0.05）。

讨论

口面疼痛与TG的外周致敏高度相关。2最近，已经越来越多地认识到，不仅神经元，而且神经胶质细胞在增强和保持炎性疼痛重要作用。23 TG神经元在炎症后合成和分泌更多的SP，12和SP在促进外周激活中起重要作用。24 MAPKs还参与多种胶质细胞受体的激活以及促炎和促炎性介质的产生，25它介导炎症性疼痛的过程。然而，MAPK是否参与SP介导的SGC激活在很大程度上是未知的。在这项研究中，我们发现大鼠的炎性口面异常性疼痛与SP有关。SP参与SGCs的激活，通过NK-1受体促进SGCs中促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）的产生，并在体内和体外在炎症下上调MAPK信号通路的磷酸化。条件。还发现ERK和P38途径抑制剂的应用减弱了炎症诱导的口面异常性疼痛，并抑制了SP引起的IL-1β和TNF-α的增加。总之，SP导致SGC的激活，其在炎性口面疼痛的调节中起重要作用。

SP具有调节免疫系统的各种生理作用，影响生殖和内分泌系统。26 SP作为一种重要的神经递质参与神经系统疼痛的产生和维持。26无论是在体外和体内研究表明，SP被合成，并从神经元胞体，其分泌一系列分子激活的神经元和的SGC的分泌，和SP激活NK-1受体的SGC炎症条件下，从而刺激生产来自TG的神经胶质细胞中的白细胞介素IL-1β。27 NK-1拮抗剂已显示减少炎性疼痛在几个不同的动物模型中，28包括NK-1敲除小鼠模型。29我们还获得证据表明阻断TG内的NK-1受体可以减弱TG神经元的敏感性。27鉴于发挥神经痛SP的举足轻重的作用，我们的实验旨在调查SP对TG的SGC的影响。我们发现TGs中的神经元和SGCs均在体内和体外表达NK-1受体，这与之前的研究结果相似。12对炎症后的SGC NK-1受体的增加的水平表明，该受体是由SP刺激激活。30例 SP参与了CFA诱导的炎症性口面异常性疼痛的调节，这与之前的研究结果一致。31 还发现通过将L703,606（NK-1受体的拮抗剂）预先注射到TG中来减弱异常性疼痛，表明SP通过激活NK-1受体介导炎性异常性疼痛。

SGC与神经元有很强的结构相互关系，这是胶质细胞和神经元之间相互作用的基础。神经元和SGC在TG内形成功能单元，并通过“听”和“说话”神经元参与调节神经元的兴奋性。28 SGC激活涉及TG神经元兴奋性的调节，并在增强和维持面部疼痛中起重要作用。23，28的证据表明，神经胶质细胞通过离子的改变，翻译后调节，形态变化和增殖激活。3我们专注于TG SGC并发现SP在体内和体外炎症条件下导致SGC的活化，这通过SGC（活化的SGC的特异性标记物）中GFAP表达的增加来证明。32项我们的研究结果与在的SGC检测不同条件下GFAP的更高水平，例如，神经损伤，炎症，关节炎，骨癌和化疗的事实是一致的。3

在应激，损伤或炎症条件下，许多细胞类型（包括星形胶质细胞和小胶质细胞）增加促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）的分泌。33 IL-1β通过经由蛋白激酶C / G蛋白偶联通过调节IL-1RI，信号传导途径抑制TG神经元中的电压-门控钾电流加剧TG神经元的神经元兴奋20，22，28，从而促进形成和维持口腔颌面部痛觉过敏和/或异常性疼痛。先前的研究表明，TNF-α通过调节在TG神经元中表达的TRPV1，TNFR1，TNFR2和Cdk5在口面痛中起作用。34，35鉴于IL-1β和TNF-α的重要作用，在SP诱导的SGC活化的当前研究中已经特别考虑了这些因素。在我们的研究中，观察到TG SGC对SP的明确反应。RT-qPCR，ELISA和WB测量用于检测体内和体外IL-1β和TNF-α的水平。我们发现SP可以在炎症条件下促进SGCs中IL-1β和TNF-α的产生，这与先前在TG中获得的结果部分一致。16的NK-1受体拮抗剂（L703，606）插入TG体内并进入SGC培养物的诱导前阻止IL-1β和TNF-α的上调。总之，这些数据表明SP通过激活NK-1受体引起IL-1β和TNF-α的增加。

越来越多的证据表明DRG和TG神经元36中的p-ERK水平升高，以及SGC，18促进了外周致敏的发展。37，38的MAPK信号转导途径参与细胞功能，如增殖，分化，迁移和凋亡，以及慢性炎症。39特别是，在的SGC和对- JNK对P38和P-ERK的表达40在星形胶质细胞在脊髓导致促炎基因，包括IL-1β，IL-6，前列腺素的诱导（PG E2和TNF-α因此有助于中枢敏化。41考虑到上述MAPK的基本功能，我们提出MAPK可能有助于TG SGC的外周致敏。我们观察到以下发现。SP在体内和体外炎症条件下显着增强大鼠TG SGC中的p-ERK，p-P38和p-JNK。我们的结果与之前发表的一些研究并不完全相同。一些研究报道，在DRG和TG中紫杉醇治疗42后，ERK和P38的活化而非JNK信号传导表达被激活。另一方面，还提出了在炎性条件下涉及机械性异常性疼痛的星形胶质细胞中JNK的活化。43证据还表明，只有p-ERK在神经损伤中上调，而p-P38和p-JNK则没有。3

通过测试MAPK抑制剂对体内大鼠面部表达的影响来评估MAPK对SP诱导的行为疼痛水平变化的贡献。在本研究中，用U0126（MEK1 / 2的抑制剂）和SB203580（P38的抑制剂）预处理到TG中减弱了CFA诱导的炎性异常性疼痛。通过在体内和体外测试MAPK抑制剂的作用来评估MAPK对SP诱导的SGC中IL-1β和TNF-α水平变化的贡献。根据结果，U0126和SB203580在mRNA和蛋白质水平上抑制IL-1β和TNF-α。该结果与前一结论一致，该结论报道MEK1 / 2和P38但不是JNK的抑制剂阻止了紫杉醇增强的超敏反应。42总结上述发现，并非所有拮抗剂都表达抑制作用。这种不一致的原因尚不清楚。以前的报道表明神经胶质细胞可能同时产生炎症信号分子和抗炎和抗伤害感受器介质。3这些介质可能在炎症性疼痛系统中起关键作用，并可能调节下游效应，例如我们的实验结果中显示的那些。此外，三种主要的MAPK途径可能对疼痛机制的调节具有相互影响。神经系统中存在一定程度的自我调节机制。当选择性地抑制其中一个途径时，可以回顾性地增强其他途径，从而影响下游信号的水平。总之，这些发现支持ERK和P38在调节SP对SGC中促炎细胞因子的产生和炎性疼痛的诱导和维持中的作用中的重要作用。

TG是由神经元，SGC，施万细胞，免疫细胞和巨噬细胞组成的复杂调节系统。17，18，44，这些细胞可能已经参与了疼痛口面在体内在该实验的调节。许多化学信使，如SP，CGRP，BDNF和ATP，在TG中释放，可通过MAPK信号通路激活SGCs和神经元，并在炎症条件下促进IL-1β和TNF-α的释放。 CFA。不仅在SGC中而且在感觉神经元中MAPK活化可能有助于体内行为超敏反应。18NK1受体在神经元和SGC中均表达，因此SP也可在体内激活神经元。因此，我们不能排除上述信使和神经元在体内的口面疼痛中的作用。我们使用SP的简单处理设计了体外SGC培养物的研究，主要研究SP对SGC活化的影响。L703,606用于抑制NK-1受体的功能以进一步验证SP的作用。虽然我们根据GS染色确定所用SGC培养物的纯度高于95％，但不能排除巨噬细胞的存在，因为IL-1β，TNF-α和其他化学介质也可以从巨噬细胞和其他免疫中释放出来。细胞在炎症条件下。45由于神经元和SGCs的结构特征，单独的SGCs不能诱发疼痛; 相反，它们可以作为疼痛放大器来增强疼痛。IL-1β和TNF-α通过激活其在TG神经元上表达的特异性受体（IL-1R和TNFR）来增强神经元的兴奋性，从而促进炎性疼痛（图6）。20，22，34，35

总之，通过增加的GFAP表达和在炎性条件下由SP诱导的MAPK表达的磷酸化证明SGC活化参与维持口面部疼痛。神经，SGC，免疫细胞和巨噬细胞中的其他细胞因子，趋化因子和炎症介质也需要考虑参与口腔和颌面部疼痛的产生和维持。这些发现证明了SGC在口腔疼痛中的重要作用，其由SP调节。因此，我们建议ERK1 / 2和P38 MAPK途径以及NK-1受体可能是预防和治疗炎性口面疼痛的潜在治疗靶点。

材料和方法

动物准备

所有动物实验程序均经四川大学华西口腔医院伦理委员会批准（NO：WCCSIRB-D-2015-157）。将Sprague-Dawley（SD）大鼠（150-200g）置于干净的塑料笼中，12小时光照/黑暗循环，不受限制地获得食物和水。为建立体内炎症模型，用水合氯醛（30 mL·kg -1,10％，ip）麻醉动物，并注入完全弗氏佐剂（CFA，0.05 mL，1：1油/盐水悬浮液）至双侧晶须垫，如我们之前的研究中所述。6用伊文思蓝染料（50 mg·mL -1,1 mL·kg -1）验证CFA诱导的炎症，iv）。将生理盐水（0.05mL，0.9％）注入SD大鼠的双侧晶须垫中作为载体。

将药物注入TG

为了检验MAPK途径参与炎症性口面疼痛以及由SP诱导的SGCs产生IL-1β和TNF-α的假设，在CFA之前30分钟将选择性抑制剂以每侧10μL的体积注入TG中。根据先前研究中描述的方法注射。6，18，39，43，46简言之，从头部到颈部进行中线皮肤切口（长度1.5cm），然后在颅骨上钻一个小孔（直径1mm）（λ前面2.6mm，中线外侧3.5mm））在TG上方使用牙钻。通过孔插入引导插管（NeuroStar，德国）以到达TG，并且将插管的尖端定位在颅骨表面下方8.8-9.5mm处。使用以下药物：L703,606（NK-1受体拮抗剂，Sigma，USA），U0126（MAPK / ERK激酶抑制剂[MEK] 1/2，Sigma，USA），SB203580（抑制剂） P38，Sigma，USA）和SP600125（JNK的抑制剂，Sigma，USA）。将这些药物溶于二甲基亚砜（DMSO; 0.5％，Sigma，USA），剂量为1μg·μL -1。我们使用包含0.5％DMSO作为载体的溶液。上述药物的剂量和体积基于先前的研究。39，43

面部表情分析

根据以往的研究，47，48个面部表情分析是常用的不同药物给药后，评价大鼠炎症性异常疼痛。将大鼠（每次两只，每组n = 5）置于具有透明壁且没有地板的盒子（20cm×15cm×10cm）中，并将盒子装在不锈钢架子上以确保空气流通。在盒子的两侧安装了两个数码摄像机（EOS D2000，佳能，日本）。在安静且柔和的环境中连续拍摄大鼠30分钟。该过程在基线时实施，并在治疗后的每个研究时间点（即，1,3,5和7天）重复。然后，软件（RodentFaceFinder®[RFF]）47用于从每个录像会话中捕获10个大鼠面部表情图像以进行评分。选定的图像文件随机复制到Microsoft PowerPoint，每张幻灯片一个图像。Rat Grimace Scale 47（RGS，包括眼眶收紧;鼻子/脸颊扁平;耳朵变化;和晶须变化）评分用于评估大鼠的疼痛水平。眼眶收紧包括减少眼睑区域，紧绷眼睑或挤压眼睛（眼睛周围的皱纹）。鼻凸起是指鼻梁上可见的圆形皮肤延伸部分。脸颊凸起是指从基线位置突出的脸颊肌肉（眼睛和胡须之间）的凸出外观。耳朵位置意味着耳朵被拉开并从其基线位置向后移动，或者由于耳朵的尖端被拉回而形成垂直脊。当胡须从基线位置向后移动，向脸部移动或向前移动时，会发生晶须变化。为每张照片中的每个动作单元分配一个值0（不存在），1（中等）或2（严重）。获得每只观察时间点的每只大鼠的平均RGS评分以反映疼痛水平。动物的行为由对实验条件不知情的研究人员进行分析。

SGC文化和药物管理

为了证明SP对体外SGCs的影响，根据Capuano描述的方法建立SGC培养物。49我们修改从在以前的报告中所描述的SD大鼠（5-7天）TG隔离的协议。50个提取的TG用冰冷的Hanks平衡盐溶液（pH = 7.4; Sigma，USA）洗涤，并在解剖显微镜下在含有胶原酶I的改良α-MEM培养基中切成小块（1 mg·mL -1，Solarbio），中国）和胰蛋白酶（0.125％; Gibco，USA）。在孵育结束时，修饰的含有胎牛血清（FBS，10％; Gibco，澳大利亚，美国）和抗生素（100μg·mL -1青霉素和100μg·mL -1）的α-MEM培养基链霉素; 添加Sigma，USA）以阻止消化。传代后，获得纯化的SGC并在37℃和5％CO 2下在潮湿气氛中温育。进行免疫荧光（IF）染色以证明细胞是SGC。基于使用相差显微镜获得的图像以及用核染料4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI; Abcam，Cambridge，UK）和抗体指导的染色，培养物中超过95％的细胞是SGC。针对谷氨酰胺合成酶（GS），SGC的特异性标志物。为进一步证明SP对SGC活化及体外IL-1β和TNF-α产生的重要影响，我们单独使用SP（Sigma，USA，1μmol·L- 1）并共同应用L703,606 （1μmol·L -1）刺激SGC 24小时以产生以下组：载体，SP和SP + L703,606（每组n = 6）。为了研究MAPK途径在SP诱导的SGC活化过程中的重要作用，选择性抑制剂U0126（5μmol·L -1），SB203580（5μmol·L -1）和SP600125（5μmol·L -1）在SP给药前30分钟将其加入SGC培养物中。将SGC培养24小时以获得以下组：SP + U0126，SP + SB203580和SP + SP600125（每组n = 6）。将含有FBS的培养基中的稀释的DMSO（0.5％）用作载体。上述药物的剂量基于先前的研究。51

免疫荧光染色

对于动物模型和SGC培养物，应用IF染色以检测在SGC上NK-1受体，磷酸化（p）-ERK，p-P38和p-JNK的表达。将解剖的TG在固定剂（含有4％多聚甲醛的0.1mol·L -1磷酸盐缓冲液，4小时）和蔗糖（30％，过夜）中温育。在低温恒温器（Leica，Germany）上切割冷冻切片（10μm厚）的TG并将其安装在盐水涂覆的载玻片上。切片按如下方式处理：用PBS（0.01mol·L - 1,3×，每次5分钟）冲洗，用Triton X-100（0.25％，15 + min）孵育，用山羊血清封闭（10％，1小时），室温），并与一抗孵育（表1过夜，4℃）和二抗（AlexaFluor®594和AlexaFluor®488，山羊抗兔或抗小鼠，1：500,1小时，37℃; Abcam，Cambridge，UK）。然后，用DAPI（2-5分钟）染色细胞核。通过显微镜（Olympus，Japan）获得IF图像。药物施用后，类似的程序也适用于SGC培养物。

表1用于IF和WB的一抗的细节

全尺寸表

蛋白质印迹分析

在匀浆和离心后收集分离的TG，以通过Western印迹（WB）显示胶质原纤维酸性蛋白（GFAP），ERK，p-ERK，P38，p-P38，JNK和p-JNK的水平。用DG-3022A酶标仪测量蛋白质浓度。将样品（40μg）与Laemmli样品缓冲液（Amresco，USA）混合，加热（95℃，10分钟）并通过Bio-Rad半干转移装置转移到PVDF膜（Chemicon，Temecula，CA，USA）上。。将膜浸泡在封闭缓冲液（含有0.05％吐温-20的PBS中的5％脱脂奶粉，1小时）中，并与在封闭缓冲液中稀释的适当的一抗孵育（表1），4°C，过夜）。然后，将膜在TBST中洗涤，并在封闭缓冲液（辣根过氧化物酶[HRP] - 缀合的，1：50000，抗小鼠/大鼠，2小时，室温; Abcam，Cambridge，UK）中稀释的第二抗体中温育。在一系列洗涤后，用Re-blot Plus Strong Solution（Chemicon，Temecula，CA，USA）剥离膜（15分钟，室温）。我们使用β-肌动蛋白作为加载对照来标准化蛋白质加载。用Fujifilm LAS-1000发光图像分析仪（Fujifilm，Stamford，CT，USA）显现膜，并使用BandScan软件定量条带光密度比。SGC培养物也通过上述方案进行WB培养。

定量逆转录聚合酶链反应

定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）用于分析用SP，NK-1受体拮抗剂和MAPK抑制剂处理的SGCs中IL-1β和TNF-α的水平。使用Trizol方法分离来自具有不同处理的SGC培养物的总RNA。在逆转录反应系统中，RNA被逆转录成cDNA。将cDNA稀释10倍，加入实时荧光定量PCR系统（4μLcDNA，0.4μL10μmol·L -1正向引物，0.4μL10μmol·L -1反向引物，10μLSYBR）绿色主混合物，50×ROX参考的0.4μL染料2，及H 4.8μL 2O; 在50℃下进行40个循环2分钟，95℃下10分钟，95℃下30秒和60℃下30秒）以检测mRNA表达。IL-1β，TNF-α和β-肌动蛋白的引物列于表2中。绘制溶出曲线，并用2- ΔΔCt方法分析最终数据。

表2用于RT-qPCR的引物序列的细节

全尺寸表

酶联免疫吸附试验

将SGC培养物接种于6孔板中以研究在以下条件下孵育后IL-1β和TNF-α的表达：载体，SP，SP + L703,606，SP + U0126，SP + SB203580和SP + SP600125（每组n = 6）。收集上清液，离心（3 000 R·分钟-1，10分钟）并使用特定的定量酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（ab100768和ab46070，Abcam公司，英国剑桥，检查范围68.59 PG·ML -1根据制造商的说明，-50 000 pg·mL -1和31.25 pg·mL -1 -1 000 pg·mL -1）和ELISA读数器（HTS700 +，USA）。基础水平（257.23）处于ELISA试剂盒的可检测（线性）范围内。

数据分析

所有数据均以平均值±SD表示，并使用Graph Pad Prism 6和SPSS 20.0进行分析，使用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验和单样本t检验，然后进行Fisher最不显着差异检验。差异被认为是统计学上显着的，P <0.05。