基因组规模的CRISPR敲除筛选将TIGAR鉴定为PARP抑制剂敏感性的修饰物

用聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂治疗癌症目前仅限于同源重组（HR）途径中缺陷的细胞。鉴定诱导或模拟HR缺陷的遗传靶标将扩展PARP抑制剂的临床应用。在这里，我们使用PARP抑制剂olaparib作为替代物的灵敏度，执行基于CRISPR / Cas9的基因组规模功能丧失筛选。我们识别C12orf5编码TP53诱导糖酵解和凋亡调节因子（TIGAR），作为PARP抑制剂反应的修饰因子。我们显示TIGAR在几种癌症类型中被扩增，并且TIGAR的更高表达与卵巢癌中的总体存活率差相关。TIGAR敲低通过下调BRCA1和Fanconi贫血途径增强对癌细胞中奥拉帕尼的敏感性，并通过影响代谢途径和增加奥拉帕尼的细胞毒性作用来增加这些细胞的衰老。我们的研究结果表明，应该探索TIGAR作为治疗癌症和扩展PARP抑制剂使用的治疗靶点。

最初发现的是聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂导致合成致死性在癌细胞与BRCA1或BRCA2未尽后1，2，一些PARP抑制剂的现已批准由联邦药物管理局（FDA）作为抗-cancer药物用于各种癌症，具有BRCA1和BRCA2中的种系或体细胞突变。与PARP抑制剂的理解更进步，现在广为接受的是PARP抑制剂还与所谓的“BRCAness”表型的癌症活性3，4，这是在与HRD肿瘤中发现导致从除了其他部件的变更BRCA1或BRCA2在HR路径5，6，7，8，9。此外，与同源重组（HR）途径不直接相关的基因改变，如PTEN丢失10和TMPRSS2-ERG 11和EWSR1-FLI1 12中的易位，也导致对PARP抑制剂的敏感性增加，这表明其他分子与HR途径无关的途径也可能有助于PARP抑制剂的敏感性。因此，更好地了解有助于PARP抑制剂敏感性的遗传决定因素将扩展PARP抑制剂的临床应用。

进一步开发PARP抑制剂的挑战之一是充分了解促成PARP抑制剂敏感性的分子机制13。为了应对这一挑战，一些研究报告的候选基因，导致与全基因组RNA干扰分析和功能研究PARP抑制剂合成致死5，14，15。这些研究确定了涉及DNA损伤反应（DDR）和修复途径的基因，如BRCA1，NBN，FANCD，FANCC，RAD51，LIG3，RAD51C，RAD51D，RAD21，ESCO1和SMC3，以及参与复制和细胞的基因。循环进展，如MCM蛋白，TOP3A，POLB和CDK7作为对PARP抑制剂敏感的调节剂5。然而，靶向这些基因以增强对PARP抑制剂的敏感性的临床益处是值得怀疑的，因为这些基因的化学抑制可能使正常细胞以及癌细胞对PARP抑制剂敏感。因此，迫切需要探索PARP抑制剂的其他合成致死靶标。

Ç上光ř egularly 我 nterspaced 小号园艺P alindromic ř epeats（CRISPR）-directed Cas9介导的内切核酸酶活可以破坏基因组中的特定基因序列，并提供以执行失功能遗传筛选的装置16，17，18。当与亚致死剂量的PARP抑制剂组合时，该方法可以鉴定遗传因子，当被破坏时，其有助于PARP抑制剂的敏感性或抗性。与RNAi方法不同，当指导RNA得到适当设计时，CRISPR / Cas9系统可以更彻底地消除靶基因表达，同时减少脱靶效应19，20，21。

因此，我们使用CRISPR / Cas9系统进行基因组规模的功能丧失筛选，以鉴定癌细胞中奥拉帕尼敏感性的修饰物。从这个屏幕，我们确定了C12ofr5，一个编码代谢调节因子TP53的基因诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TIGAR），作为改变癌症细胞中olaparib敏感性的候选物。我们发现TIGAR的下调导致奥拉帕尼的细胞毒性作用增强。我们的结果表明，TIGAR敲低（KD）产生两种互补效应，增强对奥拉帕尼的敏感性。首先，TIGAR KD抑制戊糖磷酸途径（PPP），导致细胞内ROS增加，从而增强olaparib治疗后的DNA损伤。其次，TIGAR KD通过下调BRCA1和Fanconi贫血途径诱导“BRCAness”。最后，与治疗效果相关，TIGAR KD通过诱导细胞衰老来抑制细胞生长。虽然前两个方面提供了TIGAR下调如何使癌细胞对奥拉帕尼敏感的机制，后者揭示了将TIGAR作为预防癌症进展的有希望策略的可能性。最重要的是，来自癌症基因组图谱（TCGA）的数据进一步支持了这些体外研究结果，该数据显示TIGAR在包括卵巢癌在内的不同癌症类型中被扩增，并且TIGAR的高表达与高患者的总体存活率差相关。 - 浆液性浆液性卵巢癌。总之，这些结果表明TIGAR修饰了癌细胞中PARP抑制剂的细胞应答，并为开发癌症疗法提供了新的治疗靶点。这表明TIGAR在包括卵巢癌在内的不同癌症类型中被扩增，并且TIGAR的高表达与高级别浆液性卵巢癌患者的总体存活率差相关。总之，这些结果表明TIGAR修饰了癌细胞中PARP抑制剂的细胞应答，并为开发癌症疗法提供了新的治疗靶点。这表明TIGAR在包括卵巢癌在内的不同癌症类型中被扩增，并且TIGAR的高表达与高级别浆液性卵巢癌患者的总体存活率差相关。总之，这些结果表明TIGAR修饰了癌细胞中PARP抑制剂的细胞应答，并为开发癌症疗法提供了新的治疗靶点。

TIGAR被确定为奥拉帕尼敏感性的修饰物

为了鉴定奥拉帕尼敏感性的修饰物，我们首先通过用Lenti-Cas9病毒颗粒转导A2780细胞，然后选择2周的杀稻瘟素，建立稳定表达Cas9内切核酸酶（A2780-Cas9）的细胞系。通过蛋白质印迹证实Cas9在该稳定细胞系中的表达（图1a）。磺酰罗丹明B（SRB）测定显示，与亲本A2780细胞相比，Cas9表达和杀稻瘟素选择对A2780-Cas9中奥拉帕尼的敏感性影响最小（图1b）。按照图1c所示的时间方案进行筛选。我们用Ge nome-scale C RISPR K nock- O转导表达Cas9的细胞ut（GeCKO）文库B含有5831个指导RNA（gRNA），靶向19,050个人类基因，每个基因含有3个gRNA。在嘌呤霉素选择7天后，将表达gRNA的细胞分成两份并分别用DMSO，5μM或10μM奥拉帕尼处理。DMSO处理的细胞用作对照。DMSO或奥拉帕尼治疗一周后，收集剩余的细胞，gRNAs扩增，并如先前所述制备序列库16，22。扩增子通过Illumina下一代测序测序，并通过DMSO处理和奥拉帕尼治疗组，使用鉴定富集或贫化gRNAs的比较中号为基础的Odel等甲的nalysis 葛诺姆宽Ç RISPR-Cas9Knockout（MAGeCK）工具23。已经鉴定了前10位候选物用于富集（图1d，e）和耗尽（图1f，g）分析。富集分析鉴定了其中断导致olaparib抗性的候选基因，这意味着这些基因是增加对奥拉帕尼敏感性的潜在候选物。鉴定的候选基因之一是PARP1（图1d，e）。所有三种gRNA在奥拉帕尼治疗后显示出一致的，剂量依赖性的丰度增加（补充图1A）。这些结果与先前的报告一致，表明PARP1耗尽导致对PARP抑制剂的抗性24，25。虽然olaparib选择后gRNA的富集表明靶基因有助于olaparib敏感性，但olaparib选择后gRNA的消耗表明靶基因有助于olaparib抗性。我们将 C12orf5（ TIGAR）鉴定为负调节olaparib敏感性的基因之一（图 1f，g），因为在olaparib处理后C12orf5的 gRNA被耗尽，这表明 C12orf5基因的破坏使细胞对奥拉帕尼敏感。我们还将 PI3K3C2G和NME2鉴定为降低对奥拉帕尼敏感性的其他候选基因（图 1f，g））。接下来，我们用合并的siRNA瞬时敲除单个基因以验证潜在的候选物。我们选择那些具有至少两种不同gRNA的候选物，其在olaparib处理后进行进一步验证，一致且剂量依赖性地富集或消耗，包括C12orf5和PARP1（补充图1A - B）。

基因组规模CRISPR敲除筛选和候选鉴定。在A2780细胞中Cas9内切核酸酶的稳定表达。用抗FLAG抗体通过蛋白质印迹检测FLAG标记的Cas9。β-肌动蛋白用作上样对照。b亲本A2780和A2780-Cas9细胞中的Olaparib敏感性。剂量 - 反应曲线由SRB测定产生。IC50在Prism 6软件中计算。c该流程图显示了CRISPR / Cas9敲除屏幕的时间方案。d - g olaparib选择后确定潜在的辍学和富集的候选人。在olaparib选择后最显着富集的前10位候选者通过修改的强大排名聚合（RRA得分）进行排名（d）或p值（e）。在olaparib选择后最显着耗尽的前10名候选者按RRA评分（f）或p值（g）排名。通过比较olaparib处理组和DMSO处理组，用MAGeCK工具23鉴定候选物

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TIGAR KD增强癌细胞中olaparib的敏感性

为了验证所选择的候选物，我们为每个基因汇集了两个siRNA，并在初始筛选中使用的A2780细胞系中敲低它们的表达。在siRNA转染后48小时，我们进行SRB测定和集落形成测定以评估对奥拉帕尼的敏感性（图2a-c）。结果显示，TIGAR的瞬时KD（图2b）导致O2780细胞中奥拉帕尼的IC 50降低约5倍（图2a）。克隆形成存活分析还表明，当与不同浓度的奥拉帕尼组合时，TIGAR KD细胞的集落形成减少（图2c））。在另外两种对奥拉帕尼较不敏感的癌细胞系中用SRB测定获得了类似的结果（图2d，e），表明TIGAR的下调使这些细胞对奥拉帕尼敏感。有趣的是，我们观察到TIGAR KD本身显着（** p  <0.01）减少了集落形成（图2f），并且在另一个癌细胞OVCA420 *（补充图2A - B）中观察到类似的结果，表明TIGAR耗尽减弱癌细胞的生长。这些观察结果与胶质母细胞瘤细胞26的先前报道一致。这些结果表明，TIGAR消耗减弱了癌细胞的生长并增强了对奥拉帕尼的敏感性。

用siRNAs敲低TIGAR使癌细胞对PARP抑制剂奥拉帕尼敏感。一个 TIGAR击倒（KD）导致的降低而PARP1 KD导致A2780细胞的增加的奥拉帕尼IC50。根据剂量 - 反应曲线计算奥拉帕尼的IC50。b实时RT-PCR分析显示TIGAR和PARP1的KD以及相应的合并的siRNA。包括三个重复。c菌落形成实验表明，TIGAR KD降低了奥拉帕尼和PARP1 KD 处理细胞的克隆形成存活率，提高了克隆生存率。殖民地的代表性图像显示在左侧。菌落的定量显示在右侧。d，eTIGAR siRNA KD在OVCA420 *细胞（d）和ES-2细胞（e）中对奥拉帕尼的敏感性增加。数据显示为平均值±SEM。f TIGAR KD导致集落形成减少。包括三个重复。用Student's t检验进行统计学分析，** p  <0.01。G从TCGA数据集中超过11％的卵巢肿瘤样本中扩增了TIGAR。（H）较高的TIGAR表达与高级别浆液性卵巢癌患者的总体存活率较低有关。来自TCGA高级别浆液性卵巢癌数据集的577名患者被纳入分析。通过RNA测序定量mRNA表达。高于平均值（表达式>平均值）的TIGAR表达被认为是过表达的

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我们还能够验证PARP1 KD对奥拉帕尼敏感性的影响。PARP1 KD显示A2780细胞对奥拉帕尼的敏感性降低（图2a-c）。这与以前的报道称PARP1的消耗导致PARP抑制剂耐药一致24，25。然而，我们无法验证其他候选基因对奥拉帕尼敏感性的影响（补充图2C - D）。值得注意的是，我们仅观察到opsarib对siRNA的PARP1瞬时KD的敏感性略有下降，并且这种效应并不像之前的研究那样显着，表明PARP抑制剂对遗传破坏的敏感性降低10倍。 PARP1表达24，25。差异可能是我们研究中siRNAs对PARP1 KD不完整的结果。siRNAs和CRISPR抑制候选基因效率的差异可能是解释我们未能从CRISPR敲除筛选中验证某些候选基因的原因之一。

TIGAR表达与较差的生存结果相关

来自TCGA的数据集的分析表明，TIGAR在包括卵巢癌在内的不同癌症类型中被扩增，其中超过11％的病例扩增TIGAR（图2g）。TIGAR扩增与TIGAR的高表达相关（补充图2E）。我们还分析了来自TCGA的高级别浆液性卵巢癌的RNA测序数据集。我们根据肿瘤中TIGAR表达水平将患者分为两组：TIGAR高于平均值的肿瘤被认为是TIGAR高表达的肿瘤，而TIGAR表达等于或低于平均值的肿瘤被认为是TIGAR低表达的肿瘤。该分析表明肿瘤中具有高TIGAR表达的患者具有显着的（Logrank测试p-值= 0.00359）与肿瘤中TIGAR低表达的患者相比，总体生存结果较差（图2h）。与TIGAR低表达的患者相比，具有高TIGAR表达的患者的中位总生存期低约11个月（p  = 0.00359）。总之，这些结果表明TIGAR在癌症发展和改变对PARP抑制剂的反应中的重要作用。最后，在癌症中靶向TIGAR提出了克服PARP抑制剂抗性和预防肿瘤进展的潜在策略。

TIGAR KD增强olaparib的DNA损伤和细胞毒性

接下来，我们确定了TIGAR下调导致olaparib敏感性的机制。TIGAR显示与果糖-2,6-二磷酸酶27的双磷酸酶结构域的序列相似性，并且已经显示通过降低果糖-2,6-二磷酸（F-2,6-BP）的细胞内水平来负调节糖酵解，从而促进氧化PPP分流。PPP是用于生产NADPH的和核糖-5-磷酸，这是个核苷酸的合成的前体临界27，28。TIGAR表达也通过NADPH免受DNA损伤的活性氧物种（ROS）通过还原型谷胱甘肽的再生细胞和DNA损伤诱导的细胞凋亡提供保护的某些级别27，28，29，30。因此，我们测试了TIGAR KD对有或没有奥拉巴尼治疗的细胞凋亡的影响。使用膜联蛋白V / PI染色，我们观察到在两个不同细胞中合并的siRNA后TIGAR KD后凋亡细胞的显着增加（图 3a，补充图 3A）。当与奥拉帕尼联合使用时，细胞凋亡的增加进一步增强，表明TIGAR KD可通过增加细胞凋亡来增强奥拉帕尼的细胞毒性作用。

TIGAR KD通过增加DNA损伤诱导细胞凋亡并增强奥拉帕尼的细胞毒性。一个膜联蛋白V / PI流式细胞术分布是从用媒介物或奥拉帕尼（OLA）治疗代表性实验控制（SCR）或之后TIGAR siRNA转染。PI，碘化丙锭。b蛋白质印迹显示具有两种不同siRNA和合并的siRNA的TIGAR KD。β-肌动蛋白用作上样对照。c中性彗星试验检测到DNA损伤。每组的代表性图像显示在顶部。量化数据显示在右侧的图表中。每个点代表一颗彗星。数据显示为SD的中位数。使用Prism 6软件中的单向ANOVA分析进行统计学，** p <0.01，**** p  <0.0001。d用奥拉帕尼治疗后24和48小时用抗γH2AX和抗TIGAR抗体进行Western印迹。β-肌动蛋白用作上样对照。e蛋白质印迹显示在TIGAR KD细胞中olaparib处理后用NAC，NADPH或核糖处理后的γH2AX水平。f在X轴上显示的处理后，亲本OVCA420 *细胞中的细胞周期分析。g转染后48小时ES-2细胞中的细胞周期分析，并用olaparib处理另外24小时。数据显示为平均值±SD

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鉴于TIGAR通过增加细胞内的层面上促进PPP，以前的研究显示TIGAR KD结果ROS增强抗氧化NADPH再生27，29。为了在我们的细胞系中证实这些结果，我们在TIGAR KD后通过H 2 DCFDA染料确定细胞ROS水平。在TIGAR的KD与单独的siRNA或汇集的siRNA之后，我们观察到与乱序的siRNA（scr siRNA）转染的细胞相比更高的H 2 DCFDA荧光（图3b），表明TIGAR的下调增加了细胞中的ROS水平。与ROS水平升高一致，中性彗星试验显示TIGAR KD后DNA损伤显着增加（图3c））。此外，TIGAR KD显着（*** p  <0.001，**** p  <0.0001）增强了olaparib治疗引起的DNA损伤。与更高水平的DNA损伤一致，具有TIGAR KD的细胞在olaparib处理后24和48小时显示出比用scr siRNA转染的细胞更高水平的γH2AX（图3d）。Yu等人。已经证明TIGAR KD通过抑制肝细胞癌细胞中的PPP来增加DNA损伤31。为了检查TIGAR KD后是否有类似的机制导致DNA损伤，我们补充了NADPH，核糖或N-乙酰半胱氨酸（NAC）细胞，观察到TIGAR KD后奥拉帕尼降低了γH2AX水平（图3e）），提示TIGAR KD后增强的DNA损伤至少部分是由于来自PPP的底物减少。矛盾的是，我们观察到用NAC或NADPH和奥拉帕尼共同处理的细胞中γH2AX水平的增加。因此，我们在与NAC或NADPH和奥拉帕尼共同处理后对这些细胞进行细胞周期分析。在这些细胞中，我们观察到与DMSO或奥拉帕尼处理的细胞相比，S期细胞的数量增加（图3f））。因此，共处理细胞中γH2AX的增加可能是由于S-相的增加。我们还在具有或不具有TIGAR siRNA KD和olaparib处理的ES-2细胞中进行细胞周期分析。在scr-siRNA转染的ES-2细胞中，奥拉帕尼治疗由于奥拉帕尼引起的G2检查点激活导致G2 / M停滞，这些结果与之前的报道2一致。在TIGAR KD细胞中，奥拉帕尼治疗引起S期细胞积聚的增加（图3g）。在奥拉帕尼治疗后48和72小时观察到类似的结果（补充图3B - C）。用奥拉帕尼治疗的TIGAR KD细胞中的S期延迟而不是G2 / M期阻滞是独特的。这些数据与TIGAR KD后DNA损伤增加需要更多时间来解决TIGAR KD细胞S期DNA损伤的观点一致。此外，TIGAR KD还可能影响与S期进展相关的基因的表达，并且改变的细胞周期相关基因表达也可能导致S期进展的延迟。

TIGAR KD可降低烟酸和特定核碱基

为了评估TIGAR KD对癌细胞代谢的影响，我们对稳定表达针对TIGAR的诱导型shRNA的TIGAR KD细胞进行了靶向代谢组学分析。在两种不同的细胞系OVCA420 *和ES-2中，多西环素处理在72小时有效地下调TIGAR表达（图4a）。靶向代谢组学分析表明TIGAR KD后两种细胞系中的烟酸均持续降低（图4b）。与这些结果一致，NADP + / NADPH测定结果表明 ， 与对照TIGAR-熟练细胞相比，TIGAR KD细胞中NADP + 显着降低（* p <0.05，** p<0.01）并且NADPH持续降低（图4c））。这些结果表明TIGAR KD影响NAD +生物合成途径。TIGAR KD也一致地减少两种细胞系中的腺嘌呤生物合成（图4d）并减少ES-2细胞中的其他核碱基（图4d）。这些结果表明TIGAR KD可能影响这些细胞中的核苷酸生物合成。

TIGAR KD降低NAD +前体烟酸，代谢物NADP和NADPH以及核碱基。OVCA420 *和ES-2 的诱导型TIGAR KD在72小时多西环素处理。b从TIGAR KD后细胞系中的代谢组学分析中获得的烟酸水平。包括五个重复。c NADP + / NADPH测定结果表明，与对照TIGAR-熟练细胞相比，TIGAR KD细胞中NADP显着降低，并且NADPH水平总体降低。包括三个重复。d TIGAR KD还可以持续降低两种细胞系中的腺嘌呤生物合成，并减少ES-2细胞中的其他核碱基。包括五个重复。数据显示为平均值±SEM。用Student's t进行统计-测试和p  ≤0.05被认为是显著。* p ≤0.05，** p  ≤0.01，*** p  ≤0.001，**** p  ≤0.0001

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TIGAR KD影响BRCA1和Fanconi贫血途径

研究表明，TIGAR在用不同的DNA损伤剂31和辐射26处理后调节DDR ，并且TIGAR的下调增强了这些试剂的DNA损伤。加上从我们目前的研究上面给出的数据，在很大程度上，这些影响取决于PPP的TIGAR KD还原反应后，如先前报道27，31。为了研究在TIGAR KD后是否存在涉及PARP抑制剂敏感性的其他潜在机制，我们在用非靶向性对照shRNA（NTC）或TIGAR特异性shRNA转导的OVCA420 *细胞中进行RNA测序分析。三种不同TIGAR shRNA的KD效率是可变的（参见图5d），我们使用shRNA＃3，它提供了最有效的KD。用慢病毒上清液转导54小时后，我们使用Illumina mRNA测序分析了转录组的变化。与NTC转导的细胞相比，在TIGAR-KD细胞中，总共1108个基因在错误发现率（FDR）≤0.001下至少两倍被下调。与NTC转导的细胞相比，TIGAR-KD细胞中总共1382个基因在FDR≤0.001上至少两倍上调（图5a）。使用Hallmark基因组的基因集富集分析（GSEA）表明，E2F和MYC靶基因以及DNA修复基因的表达受到TIGAR KD的负面影响（图5b）。有趣的是，BRCA1是TIGAR KD之后值得注意的下调基因之一。用qRT-PCR和Western印迹验证BRCA1的下调（图5c，d）。BRCA1下调的程度取决于TIGAR敲低的效率，表明剂量依赖性效应（图5d）。具有化学和遗传扰动的策划基因集的GSEA表明受TIGAR KD负面影响的顶级转录网络是BRCA2_PCC网络（图5e））。BRCA2_PCC网络由一组与BRCA2表达正相关的基因定义。这些结果表明与BRCA2表达正相关的基因在TIGAR KD下调，并且TIGAR KD也影响BRCA2途径。我们还使用Metascape生物信息学网络资源32分析了差异表达的基因。对由TIGAR KD下调的基因的注释和富集分析表明该基因集富含Fanconi贫血途径，DNA修复，DNA链延伸和细胞周期进展（补充图4A）。与GSEA和Metascape途径分析一致，我们验证了Fanconi贫血途径中涉及的基因的下调，例如BRCA2和RAD51，TIGAR KD后有两种不同的shRNA。BRIG2和RAD51表达在TIGAR KD细胞中下调（图5f）。在用两种不同shRNA感染的另一细胞系中观察到BRCA1，BRCA2和RAD51的显着下调（图5g））。广泛接受的是，BRCA1和BRCA2的下调导致PARP抑制剂敏感性，并且我们的数据表明TIGAR KD通过表达BRCA1 / 2下调产生的基因表达模式诱导“BRCAness”，从而使癌细胞对奥拉帕尼敏感。通常，当用shRNA更有效地下调TIGAR时，这些基因的下调程度更大。我们还对TIGAR KD细胞中上调的基因进行了分析，结果表明基因本体的富集对细胞死亡的正调控，对药物的反应，PI3K活性的调节以及细胞内信号转导的正调控（补充图4B））。参与细胞死亡阳性调节的上调基因与我们观察到TIGAR KD后细胞凋亡增加一致（图3a和补充图3A）。

TIGAR KD后的RNA测序分析揭示了BRCA1和关键DNA修复途径的下调。一个差异表达的TIGAR KD后基因。1382个基因被上调，1108个基因以≤0.001的错误发现率被至少两倍下调。b GSEA分析显示E2F靶基因组和DNA修复基因组的负浓缩。c，d BRCA1在TIGAR KD OVCA420 *细胞中下调。利用qRT-PCR和Western印迹检测TIGAR KD后shRNA 的BRCA1 mRNA和蛋白水平的表达。对于qRT-PCR，数据显示为平均值±SEM。结果代表一式三份的实验。ËGSEA分析还揭示了用于DNA修复和BRCA1和BRCA2靶标的策划基因组的负浓缩。f，gFanconi贫血途径组分BRCA2和RAD51在TIGAR KD后用shRNAs下调。在转导TIGAR shRNA后72小时，对OVCA420 *和OV90细胞进行qRT-PCR。数据显示为平均值±SEM。结果代表一式三份的实验

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TIGAR KD可减少癌细胞中的DNA合成

基于我们的RNA测序数据分析，表明参与DNA复制和细胞周期的基因组在TIGAR KD细胞中显着下调（补充图4A），我们对与DNA复制和细胞周期进程相关的候选基因进行了qRT-PCR分析。用两种不同的shRNA转导的两种癌细胞系。结果表明细胞周期蛋白E2（CCNE2），BLM，CDC45，MCM10，MKI67和PCNA在TIGAR KD细胞中下调（补充图5A - B））。这些结果表明DNA合成可能在TIGAR KD细胞中受到负面影响。为了证实这种可能性，我们通过siRNA对TIGAR的瞬时KD进行了癌细胞的EdU标记。结果表明，与乱序siRNA转染的细胞相比，TIGAR KD细胞中EdU免疫荧光显着降低，尽管两组中EdU阳性（S期）细胞相似（图6a）。此外，在脉冲追踪的3小时内，TIGAR熟练的，乱序的siRNA转染细胞中的大多数细胞进展为G2 / M期，而大多数TIGAR KD细胞保持在S期（图6b））。最后，在追踪的6小时和9小时，与TIGAR KD细胞相比，显着更高的EdU标记的细胞群重新进入乱序的siRNA转染的细胞中的G1期（图6c和补充图6A），表明存在延迟TIGAR KD细胞的细胞周期进程。除了延迟S期外，TIGAR KD细胞中的G2 / M转换也受到影响，因为与TIGAR-proficient对应物相比，在TIGAR KD细胞中观察到磷酸-H3阳性M期细胞的数量显着减少（图6d）和补充图6B）。最后，为了证明对DNA合成的影响，我们使用IdU和CldU进行DNA纤维测定。定量分析表明正在进行复制的CldU标记的DNA纤维的长度（IdU掺入随后是CldU掺入，图6e）表明TIGAR KD细胞中的DNA合成低于两种不同细胞系中的TIGAR-熟练细胞（图6）。6f）。这些结果与Metascape途径分析一致，其表明与DNA链延伸相关的基因受到TIGAR KD的负面影响（补充图4A）。

TIGAR KD导致DNA复制和细胞周期进展的缺陷。a - c EdU标记显示TIGAR KD后的S期和细胞周期进展延迟。一个 TIGAR KD导致更少的EdU掺入。代表性的图显示在左侧，平均EdU强度显示在右侧。在EdU脉冲标记（0小时）后立即在每个实验中由至少10,000个细胞组成的两个实验得到平均强度。b TIGAR KD导致S期进展延迟。在EdU脉冲标记后0小时和3小时比较显示了代表性的图。CTIGAR KD延迟细胞周期进展。在EdU脉冲标记后0,3,6,9小时显示EdU阳性细胞的代表性结果。7-AAD用于检测DNA含量。d EdU和磷酸组蛋白H3双标记显示TIGAR KD细胞中有丝分裂细胞减少。在EdU脉冲标记后6小时收集样品，固定并染色以检测EdU和磷酸-H3。左边显示了来自scr或TIGAR siRNA处理组的具有EdU和磷酸-H3的细胞的代表性图，右侧显示了定量结果，使用了五个重复。e，f DNA纤维梳理试验表明TIGAR KD的DNA复制减少。Ë用IdU和CldU进行纤维梳理测定的脉冲标记方案和四种主要类型的DNA纤维。来自OVCA420 *细胞的具有NTC（非靶向对照）shRNA或TIGAR shRNA 的DNA纤维的代表性图像显示在右侧。f用来自siRNA转染的ES-2细胞（上图）和具有shRNA转导的OVCA420 *细胞（下图）中正在进行的复制来定量绿色纤维长度。对于ES-2细胞，每组定量约200个纤维，N  = 2.对于OVCA420 *细胞，从一个代表性实验中对每组定量100个纤维。定量在Image J软件（NIH）中完成。使用学生t检验进行统计，p  <= 0.05被认为是显着的

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TIGAR KD诱导衰老并降低克隆形成

Peña-Rico等人的上一份报告。表明TIGAR KD与胶质母细胞瘤细胞中的siRNA诱导衰老26。为了在我们的卵巢癌细胞系中证实这种效应，我们在OVCA420 *细胞中进行了衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）分析，所述细胞用NTC shRNA或靶向TIGAR的三种不同shRNA转导。一致地，我们观察到TIGAR KD细胞中SA-β-gal染色的增加（图7a），并且经历衰老的细胞的程度与TIGAR表达水平反向相关（图7b）。在A2780细胞中观察到类似的结果（补充图7）。这些数据表明更有效的TIGAR KD导致衰老的诱导。

TIGAR KD可增加衰老，降低癌细胞的克隆性，并增强对奥拉帕尼的敏感性。一个 TIGAR KD在OVCA420 *细胞衰老增加。用NTC或TIGAR shRNA转导的OVCA420 *细胞的SA-β-gal染色。显示了来自一个实验的代表性图像。b点图显示了一个具有重复项的代表性实验的结果。从重复的每个孔中的不同区域获取图像，并对阳性染色细胞进行定量。代表性的蛋白质印迹显示具有单个shRNA的TIGAR KD。c蛋白质印迹显示OVCA420 *中shRNA的TIGAR表达的有效KD。NTC，非靶向对照shRNA。β-肌动蛋白用作上样对照。d在OVCA420 *和OV90细胞中TIGAR shRNA KD后的集落形成测定。在shRNA病毒转导后72小时，接种细胞用于克隆形成测定并用载体和递增浓度的奥拉帕尼处理。显示了菌落的代表性图像。e在OVCA420 *细胞中进行集落形成测定，在TIGAR KD后在OVCA420 *细胞中进行TIGAR表达拯救72小时。TIGAR siRNA KD后72小时，使用病毒转导分别在敲低的细胞中表达TIGAR和pLV-mCherry对照。转导48小时后，将细胞接种用于克隆形成测定，并使其生长13天。显示了SRB染色的菌落的代表性图像，并且以点图显示了一式三份的绝对SRB吸光度的定量。F在多西环素（1μg/ mL）诱导后，OVCA420 *中两种不同的shRNA对TIGAR KD进行Western印迹分析。g代表性图像显示在肿瘤球体内用强力霉素诱导红色荧光蛋白（RFP）并用于监测shRNA表达。hTIGAR KD增强对奥拉帕尼的敏感性。用CellTiter-Glo 3D试剂测定球状体的细胞活力。数据用SEM显示为平均值。统计用学生进行牛逼 -测试和p  ≤0.05被认为是显著。* p  ≤0.05，** p  ≤0.01，*** p  ≤0.001，**** p  ≤0.0001

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为了检查衰老的增加是否导致克隆形成减少，我们在两种不同的癌细胞系OVCA420 *和OV90中使用三种不同的shRNA来稳定地表达KD TIGAR。蛋白质印迹分析表明三种不同的shRNA KD TIGAR表达具有不同的效率，并且在OVCA420 *细胞中通常更有效（图7c），这可能是OVCA420 *和OV90细胞之间不同的病毒转导效率的结果。集落形成测定表明在用DMSO处理的OVCA420 *中TIGAR KD后克隆形成显着降低（图7d）。同样，在OV90细胞中观察到与TIGAR KD水平相对应的克隆形成性降低（图7d））。在OV90细胞中通过奥拉帕尼治疗进一步降低克隆生长。这些结果表明，TIGAR本身的有效下调可能会阻止癌细胞的生长，这表明TIGAR可能是一个很好的治疗靶点。

TIGAR KD增强奥拉帕尼的治疗效果

三维（3D）细胞培养模型用作体外二维（2D）单层癌细胞培养和体内肿瘤之间的中间模型33。新出现的证据表明，3D培养系统更准确地表示实际的肿瘤微环境中比2D培养系统34，并且它被认为是更具代表性的模型来测试体外的药物治疗效果33，34，35。我们还验证了KD后TIGAR拯救对克隆生长的影响，并发现与pLV-mcherry空载体拯救相比，KD后TIGAR重新表达的细胞具有增强的存活和生长（图7e））。为了测试奥拉帕尼与TIGAR下调组合的治疗效果，我们决定使用诱导型shRNA来进行3D球状体形成测定。我们首先证实，通过多西环素处理诱导shRNA表达在敲除TIGAR方面是有效的（图7f）。可以使用RFP荧光监测shRNA的诱导（图7g和补充图8A）。与二维培养中克隆形成减少的结果一致，我们观察到显着减少（双尾学生t检验，* p  <0.05，** p  <0.01，*** p  <0.001，**** p 在3D培养中TIGAR KD后球状体生长<0.0001（图7h）。使用针对TIGAR的两种不同的诱导型shRNA，当olaparib处理与TIGAR KD组合时，我们观察到球状体和球状体大小的细胞活力显着降低（图7h和补充图8B）。这些数据表明，TIGAR KD增强了奥拉帕尼的治疗效果，这与我们在RNA测序分析中的结果一致，即BRIG1和Fanconi贫血途径在TIGAR KD后被下调。

几种机制已经提出了PARP抑制剂的抗性，例如直接或间接还原HR功能的改变，包括的回复突变BRCA1 / 2，BRCA1的后生再表达，和53BP1的过表达和部分截短的BRCA1的稳定化36，37，38。其他非HR机制，如丧失PARP1表达，PI3K / AKT途径，和药物转运的增加P-糖蛋白，以促进药物的流出也有助于PARP抑制剂的抗性24，25，39，40，41。然而，我们对PARP抑制剂耐药性的了解不完整，需要开发更有效的联合疗法来克服耐药性。基于RNAi的功能遗传屏幕是有价值的技术，以有效地确定潜在的特定细胞过程的一组基因的42，43，44，45。虽然他们是强大的工具来破坏基因的功能，他们从基因水平和频繁的脱靶效应的低抑制苦，造成假阳性和阴性结果率高46，47，48。CRISPR /基于Cas9系统显示出具有在这些方面的优点，并汇集gRNA屏幕在哺乳动物细胞丧失的功能屏幕以及在体内筛选小鼠中是有效的16，18，49，50。几个已发表的研究报告siRNA或shRNA文库筛选来表征PARP抑制剂应答的调节剂5，14。虽然我们的报告不是第一个执行CRISPR / Cas9筛选来识别PARPi反应的修饰物51，但我们的研究是第一个报告TIGAR作为对olaparib反应的候选修饰物。

TIGAR最初被描述为p53诱导的基因，其调节糖酵解和细胞凋亡27。然而，随后的研究中DNA损伤信号，自噬，自噬和衰老描述它的附加角色27，29，31。在癌细胞中，TIGAR在调节糖酵解流中起重要作用，并通过氧化PPP促进NADPH和抗氧化再生52，和TIGAR KD在NADPH的增加ROS的降低的效果，和DNA损伤的更高基础水平27，31。以前的报告表明，TIGAR KD导致胶质母细胞瘤细胞衰老26。鉴于其在抗氧化剂再生中的关键作用，我们的基因组规模CRISPR / Cas9筛选将C12orf5（TIGAR）鉴定为参与使癌细胞对PARP抑制剂奥拉帕尼敏感的辍学候选基因并不奇怪。

我们的筛选表明，暴露于5和10μM奥拉帕尼后，TIGAR的所有三种特异性gRNA均呈剂量依赖性消耗（补充图1B）。我们的研究表明，TIGAR缺陷细胞对奥拉帕尼更敏感（图2）。RNAi导致的TIGAR KD导致ROS水平升高和DNA损伤的基础水平升高（图3b，c）。与先前的研究2一致，当用奥拉帕尼治疗时，癌细胞在G2 / M期显示出增加的积累。相反，当用奥拉帕尼治疗时，TIGAR缺陷细胞在S期显示出增加的积累（图3f和补充图3B - C））。这些结果与我们观察到的一致，即TIGAR缺陷细胞维持更多DNA损伤，因此需要更长的时间来解决S期DNA损伤。TIGAR KD还通过我们观察到细胞凋亡增加（图3a和补充图3A）和诱导衰老（补充图6）支持生长抑制。这些结果与TIGAR KD后转录组的全局变化分析一致，这表明参与细胞周期进展的基因最显着地受到TIGAR KD的影响（图5））。TIGAR KD细胞中延迟的S期进展和增加的衰老也可能与对核碱基生物合成的影响有关，因为TIGAR KD影响两种细胞系中的腺嘌呤生物合成和ES-2细胞系中其他核碱基的生物合成。

有趣的是，TIGAR KD导致BRCA1的下调（图5b，f）。来自RNA测序的GSEA表明TIGAR KD产生与BRCA1下调的癌细胞类似的基因标记（图5c）。此外，通路分析显示与下调基因相关的重要GO术语之一是Fanconi贫血途径（图5d）。BRCA1是参与几个重要的细胞过程，其中它在人力资源和转录调控作用，在DDR吸引了最多的关注抑癌53，54。BRCA1缺乏导致HR缺陷和癌细胞对PARP抑制剂2的敏感性。Fanconi贫血途径通过HR调节DNA修复，Fanconi贫血途径中的缺陷导致DNA修复缺陷，导致对DNA损伤剂的耐受性低55。因此，TIGAR缺陷细胞中BRCA1和Fanconi贫血途径的下调可提供归因于癌细胞中TIGAR KD后对奥拉帕尼敏感性增加的分子机制。TIGAR KD后增加的DNA损伤和对奥拉帕尼的敏感性也可能影响NAD +生物合成，因为TIGAR KD降低了两种癌细胞系中的NAD +前体烟酸。NAD +是几种途径的重要代谢物，包括用于产生NADP / NADPH氧化还原对的氧化还原途径以及利用聚ADP核糖基化的DNA修复途径。

值得注意的是，由于TIGAR在癌症代谢中的多效作用，预计TIGAR KD会产生多效性，包括DNA损伤的增加，可能是由于ROS减轻和DNA修复缺陷的综合影响，以及衰老，可能是由DNA损伤和随后的检查点激活的联合作用，核碱基库减少和E2F转录因子途径抑制所致。总的来说，多种分子机制可能有助于TIGAR KD细胞的衰老，这些机制应该在未来的研究中进行描述。

靶向TIGAR可以在癌细胞中诱导“BRCA”并且用作克服PARP抑制剂抗性或增强PARP抑制剂治疗效果的组合策略。我们来自球状体形成测定的数据表明，TIGAR的下调增强了奥拉帕尼的治疗效果（图6）。将来，测试TIGAR下调与体内PARP抑制剂联合应用的效果将是有益的。重要的是，TCGA数据分析表明，在许多不同的癌症类型中观察到TIGAR的更高表达，并且具有更高TIGAR表达的患者在高级别浆液性卵巢癌中表现出差的总体存活结果（图7）。）。该数据表明TIGAR在癌症中表达的临床相关性，并且靶向TIGAR可能是改善癌症治疗的有用策略。

除了其对提高对奥拉帕尼敏感性的作用外，OVCA420 *细胞中TIGAR的有效KD还导致DNA链延长减少，DNA合成减少，S期细胞积聚，并进入G2 / M-相。与对DNA合成的影响一起，TIGAR KD还导致细胞衰老增加和克隆形成减少。总的来说，这些结果突出了TIGAR作为癌症的潜在治疗靶点。

与我们目前的研究一起，一些研究表明，靶向TIGAR可能会增强癌症治疗的治疗效果。这些包括用siRNA TIGAR的直接靶向26或miR-144 56与MUC1-C的细胞穿透肽抑制剂和间接下调57，58或c-Met的的TKI 59。因此，在未来，直接针对TIGAR的药理学方法的开发是一个有吸引力的追求方向。TIGAR的特征是F-2,6-BPase，它可能被特定的磷酸酶抑制剂靶向以抑制其活性并抑制PPP以增强癌症治疗的细胞毒性，如我们的数据和来自其他组的报告所示26，58。还可以开发针对特异性靶向TIGAR的基于嵌合体（PROTAC）的降解物的蛋白水解。

在癌症中靶向TIGAR的一个潜在有希望的方面是它调节Warburg效应。称为Warburg效应的代谢开关使癌细胞能够通过将葡萄糖-6-磷酸分流到PPP来利用更高量的葡萄糖，并且该PPP分流部分地由TIGAR介导。这种代谢特征在癌症中几乎是普遍的，因此可能代表癌症进展中的关键步骤。这种代谢特征对癌细胞的有益作用是它为DNA提供关键底物，因此能够复制并为抗氧化剂的再生提供关键底物，从而保护癌细胞免受加速细胞代谢的过度氧化损伤。因此，靶向TIGAR可能不仅耗尽了具有增殖所需的关键底物的癌细胞，但也剥夺了它们再生抗氧化剂所需的底物。TIGAR抑制的综合作用导致ROS增加，DNA损伤，细胞衰老和对PARP抑制剂的敏感性增加。

细胞系和细胞培养

将A2780细胞和ES-2细胞维持在含有5％FBS（Sigma）的MCDB105和M199（1：1）（Sigma，USA）中，将OV90细胞维持在含有15％FBS的MCDB105和M199（1：1）中。OVCA420 *细胞在补充有10％FBS的DMEM（Sigma和Caisson Labs，USA）中培养。所有培养基补充100单位/ MI青霉素和100μg/ mL链霉素。对所有细胞系进行细胞系鉴定。通过用pLenti-cas9慢病毒转导A2780细胞建立A2780-Cas9稳定细胞，然后用400μg/ mL杀稻瘟素选择2周。ES-2，OVCA420 *和OV90细胞是来自Viji Shridhar博士（梅奥诊所）的礼物。A2780细胞来自Andrew Godwin博士（堪萨斯大学医学中心）。所有实验均在传代<20次的细胞上进行。在研究期间进行支原体测试，并且细胞培养物不含支原体。在实验结束时进行细胞系鉴定。OV90显示100％STR谱与ATCC或ExPASy中报道的相应细胞系匹配。ES-2和A2780的STR配置文件于2014年进行，作为我们最近出版物的补充60。OVCA420 *的STR配置文件与ATCC，ExPASy，DSMZ或CLIMA中任何报告的细胞系不匹配，因此我们放置了一个星号，以区别于原始细胞系。

汇集全基因组CRISPR屏幕

从Addgene购买基因组规模的CRISPR敲除（GeCKO）v2.0合并文库（双载体系统）。壁虎文库乙扩增并如先前所述制备的16，22。用lenti-Cas9的慢病毒颗粒以~1.0的感染复数（MOI）感染A2780细胞，然后用杀稻瘟素选择2周以获得表达Cas9的稳定细胞系。然后用扩增的慢病毒文库B以~0.3的MOI感染稳定的细胞。使用三千万个细胞并接种在具有3×10 6的 100mm培养皿中每盘细胞。在慢病毒文库感染后第二次加入嘌呤霉素并保持7天。选择后，将存活的细胞合并在一起并分成三组，重复用DMSO，5或10-μM奥拉帕尼处理1周。对于每次处理，每次重复使用3×10 7个细胞。提取基因组DNA并进行PCR以制备如前所述的测序文库16。使用HiSeq 2500（Illumina）对文库进行测序。数据分析由MAGeCK工具23执行。

慢病毒颗粒的生产

通过使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）将具有psPAX2和pMD2.G（Addgene）的特定质粒（GeCKO文库B，lentiCas9-Blast，单个shRNA表达质粒）瞬时转染到HEK293T细胞中来产生病毒颗粒。转染后48小时收集培养基，并在4℃下以2000rpm离心10分钟以沉淀细胞碎片。将上清液通过0.45μm低蛋白质结合膜（Millipore Steriflip HV / PVDF）过滤。将等分试样储存在-80℃。

抗体和化合物

小鼠单克隆抗FLAG HRP缀合的抗体（A8592）购自Sigma。兔多克隆抗TIGAR抗体（GTX110514）来自GeneTex（Irvine，CA，USA）。兔抗磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）抗体（＃2577）购自Cell Signaling Technologies（Danvers，MA，USA）。兔多克隆抗BRCA1抗体（C-20，sc-642）购自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。小鼠单克隆抗-β-肌动蛋白抗体（A1978）来自Sigma-Aldrich（St Louis，MO，USA）。对于二抗，马抗小鼠IgG-HRP抗体（7076S）购自Cell Signaling Technologies，山羊抗兔IgG-HRP抗体（sc-2030）购自Santa Cruz Biotechnology。Olaparib（AZD2281，Ku-0059436）购自Selleckchem。Olaparib储备溶液用DMSO以50mM制备并储存在-80℃。

免疫印迹

如果适用，在处理结束时用PBS洗涤细胞至少两次，然后用适当体积的1x电泳样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，CA，USA）和5％β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）裂解。然后将细胞裂解物在95℃下煮沸5分钟，然后使用。如前所述60进行免疫印迹程序。加载等量的总蛋白质用于SDS-PAGE并转移到PVDF膜（GE healthcare）上。所有未切割的印迹均可在补充图9中找到。

对于图3e中所示的实验，转染后48小时，细胞分别用10μMNAC，20μMNADPH或10mM核糖预处理2小时，然后用载体或20μM奥拉帕尼处理24小时。

siRNA转染

基因特异性siRNA和乱序阴性对照siRNA由Integrated DNA Technologies（IDT，Coralville，IA，USA）合成。3.5×10 5将细胞/孔接种在6孔板中并在37℃下孵育过夜。第二天，根据制造商的说明，用Oligofectamine Transfection Reagent（12252011，Invitrogen）将20nM的每种siRNA转染到细胞中。转染后6-8小时加入培养基，不洗涤细胞。转染后二十四至四十八分之一时，将转染的细胞用胰蛋白酶消化并接种在96孔板（用于细胞毒性测定）或6孔板（用于集落形成测定）上。播种后约12小时加入药物。对于细胞毒性测定，将细胞与药物一起孵育3天，然后使用SRB测定法测量细胞活力。对于集落形成测定，将细胞暴露于药物3天，然后在没有药物的情况下改变为新鲜培养基直至形成菌落并用SRB染色用于成像。为了检查基因表达的下调，收集转染的细胞以提取用于qRT-PCR或蛋白质的总RNA用于转染后72小时的蛋白质印迹分析。使用的siRNA序列显示在补充表中1。

定量RT-PCR

根据制造商的手册用Trizol试剂（15596-028，Invitrogen）提取总RNA。使用SuperScript II逆转录酶（180604014，Invitrogen）在20μL反应中用1μg总RNA合成cDNA。将得到的cDNA在无核酸酶的水中1:20稀释，每次qPCR反应使用1μL，一式三份。使用Power SYBR Green PCR Master Mix（4367659，Thermo Fisher Scientific）在包含非模板阴性对照的CFX384实时PCR检测系统（Bio-Rad）上进行qPCR。GAPDH或18S rR \ NA的扩增用于标准化mRNA表达水平。分析中使用的引物显示在补充表2中。

shRNA转导

TIGAR的shRNA购自Sigma（SHCLNG-NM_020375）。如上所述产生shRNA的慢病毒颗粒。在48小时收集的病毒上清液用于转导OVCA420 *或OV90细胞。在病毒颗粒转导后2天进行实验。

使用SRB的细胞毒性测定

如先前所述进行SRB测定61，62，用下面所示的修改。将三千个细胞/孔接种在96孔板中，并在接种后至少12小时用药物处理。然后将细胞再培养3天。拟合剂量 - 反应曲线，并使用GraphPad Prism 6四个参数测定每种药物的IC 50。所有曲线都在顶部约束100％。

菌落形成测定

将总共500-1000个细胞接种在6孔板中，并在接种后至少12小时用药物处理，并进一步培养另外3天，然后转换为新鲜培养基。每2-3天更换培养基以形成菌落。在实验结束时，进行SRB测定以染色用Molecular Imager Gel Doc XR System（Bio-Rad）成像的菌落。将菌落进一步溶解并用酶标仪测量。在GraphPad Prism 6中进行菌落分析。为了进行拯救实验，用对照pLV-mCherry病毒颗粒或含有TIGAR开放阅读框和mCherry-IRES2-嘌呤霉素的pReceiver-Lv216（Genecopoeia）病毒颗粒转导细胞。 。七十二小时后，

膜联蛋白V / PI染色细胞凋亡分析

用乱序siRNA或TIGAR siRNA转染细胞，并在转染后约24小时重新接种到6孔板中，然后用载体，10μM或20μM奥拉帕尼再处理48小时。然后按照制造商的说明（＃640906，Biolegend）对细胞进行膜联蛋白V / PI染色。简而言之，用PBS洗涤细胞两次，并在室温下在黑暗中用膜联蛋白V和碘化丙啶溶液染色15分钟，然后通过流式细胞术分析。

测量细胞内ROS

通过使用氧化剂敏感性荧光探针5-（和-6） - 氯甲基-2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸乙酯（CM-H2DCFDA，Molecular Probes）测量细胞内ROS。用scramble siRNA或C12orf5 siRNA 转染后48小时，用胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗涤两次，并在流式细胞术分析之前用PBS中的5μM或CM-H2DCFDA在37℃温育30分钟。在流动分析之前10分钟添加碘化丙啶以从ROS分析中排除死细胞。

中性彗星试验

根据Tregvigen彗星试验说明进行中性彗星试验，并进行修改。简言之，在siRNA转染后48小时，用载体，5μM或20μM奥拉帕尼处理细胞24小时。PBS中的细胞悬浮液，1×10 5将细胞/ mL与熔融的LMA琼脂糖（Trevigen）以1:10的比例混合并转移到Comet Slide（Trevigen）上。将载玻片在4℃冷却10分钟后，将载玻片在4℃下浸入裂解溶液（Trevigen，4250-050-01）中1小时，并浸入50mL 1×中性电泳缓冲液（0.5mM Tris碱和1.5mM醋酸钠）在4℃下保持30分钟。使用Wide Mini-Sub Cell GT水平电泳系统（Bio-Rad）在4℃下进行1小时电泳，并施加17伏电压。然后将载玻片在室温下浸入DNA沉淀溶液（1M NH 4 Ac和82.27％乙醇）中30分钟，然后在70％乙醇中孵育30分钟。然后让载玻片在37℃下干燥10-15分钟并用SYBR Green I染色并使用蔡司荧光显微镜（10×）观察载玻片和成像的彗星。使用来自Casp Lab的免费彗星测定软件（1.2.3beta2版）分析彗星。Olive Tail Moment =（Tail.mean - Head.mean）×Tail％DNA / 100。

细胞周期分析

用scr siRNA或TIGAR siRNA转染细胞，并在转染后约24小时重新接种到6孔板中，然后用不同浓度的奥拉帕尼再处理24,48或72小时。处理后，用1×PBS洗涤细胞两次并用胰蛋白酶消化，然后在15mL锥形管中以4℃以1000rpm离心10分钟。然后在洗涤后重悬于300μL冰冷的PBS中，并通过逐滴加入300μL冰冷的95％乙醇固定细胞，并在4℃保持黑暗以固定过夜。第二天将细胞再水合，用冰冷的PBS洗涤两次，并在RNase A溶液（1mg / mL）中于37℃温育15分钟。然后在室温下将细胞用50μg/ mL碘化丙啶溶液在室温下染色15分钟，然后进行流式细胞术分析。

用EdU标记进行DNA复制分析

对于EdU标记测定，siRNA转染后48小时，将细胞接种到6孔板中，并用10μMEdU脉冲标记1小时，然后在不同时间点收集样品，ea。洗掉EdU后0,3,6,9小时。用具有Alexa Fluor 488吡啶基叠氮化物（ThermoFisher Scientific，C10425）或Pacific Blue picolyl叠氮化物（ThermoFisher Scientific，C10636）的Click-iT EdU Flow Cytometty Assay试剂盒检测EdU。简而言之，将细胞在1％BSA / PBS中洗涤并用Click-iT固定剂固定15分钟，然后用基于皂苷的透化和洗涤缓冲液透化15分钟，然后进行Click-iT反应以检测EdU，然后将细胞重新悬浮于透化中。在BD LSRFortessa上进行流式细胞术分析之前5-10分钟加入缓冲液和0.25μg/ mL的7-AAD（Invitrogen，目录号00-6993）。

DNA纤维实验

如先前所述63进行纤维梳理测定。简言之，在复制标记前一天，siRNA转染或shRNA转导后48-72小时接种细胞，然后用100μMIdU（Sigma-Aldrich，17125）脉冲标记细胞20分钟，用PBS洗涤，接着20分钟。 100μMCldU（Sigma-Aldrich，C6891）脉冲。将细胞用胰蛋白酶消化，沉淀并重悬于低温熔化琼脂糖中以形成栓塞。用FiberPrep DNA Extraction Kit（GenomicVision，EXTR-001）制备DNA，然后按照制造商的说明，使用Genomic Vision梳理机在硅烷化盖玻片（GenomicVision，COV-002）上梳理DNA纤维。DNA纤维的染色如下进行：将盖玻片在60℃的烘箱中脱水2小时，然后在70％，90％和100％乙醇中连续脱水，并在0.5M NaOH / 1M NaCl溶液中变性。用PBS洗涤三次后，将盖玻片在37℃下用含5％BSA的PBS孵育30分钟，用一抗孵育1.5小时：小鼠抗BrdU（1：25，BD Biosciences，347580）; 大鼠抗BrdU（1：100，Abcam，ab6326），和第二抗体1小时：绵羊抗小鼠IgG Cy3（1：500，Sigma-Aldrich，C2181）; 山羊抗大鼠IgG Alexa 488（1：400，ThermoFisher Scientific，A-11006）。将染色的DNA纤维固定在Vectashield（Invitrogen）中，并使用具有带有×40油浸物镜的Airyscan显微镜的Zeiss AxioObserver LSM 800获得图像。IdU设置为红色，CldU设置为绿色。在Image J软件（NIH）中测量纤维长度。补充图 大鼠抗BrdU（1：100，Abcam，ab6326），和第二抗体1小时：绵羊抗小鼠IgG Cy3（1：500，Sigma-Aldrich，C2181）; 山羊抗大鼠IgG Alexa 488（1：400，ThermoFisher Scientific，A-11006）。将染色的DNA纤维固定在Vectashield（Invitrogen）中，并使用具有带有×40油浸物镜的Airyscan显微镜的Zeiss AxioObserver LSM 800获得图像。IdU设置为红色，CldU设置为绿色。在Image J软件（NIH）中测量纤维长度。补充图 大鼠抗BrdU（1：100，Abcam，ab6326），和第二抗体1小时：绵羊抗小鼠IgG Cy3（1：500，Sigma-Aldrich，C2181）; 山羊抗大鼠IgG Alexa 488（1：400，ThermoFisher Scientific，A-11006）。将染色的DNA纤维固定在Vectashield（Invitrogen）中，并使用具有带有×40油浸物镜的Airyscan显微镜的Zeiss AxioObserver LSM 800获得图像。IdU设置为红色，CldU设置为绿色。在Image J软件（NIH）中测量纤维长度。补充图 使用具有带有×40油浸物镜的Airyscan显微镜的Zeiss AxioObserver LSM 800获得图像。IdU设置为红色，CldU设置为绿色。在Image J软件（NIH）中测量纤维长度。补充图 使用具有带有×40油浸物镜的Airyscan显微镜的Zeiss AxioObserver LSM 800获得图像。IdU设置为红色，CldU设置为绿色。在Image J软件（NIH）中测量纤维长度。补充图10包含其他图像。

衰老相关的β-半乳糖苷酶测定（SA-β-Gal）

在用单独的TIGAR shRNA转导后两天，将细胞用胰蛋白酶消化并在6孔板中以每孔1×10 5个细胞的接种密度重新接种，并在37℃温育24小时。如前所述对贴壁培养细胞进行SA-β-Gal染色（Itahana，Campisi等人，2007）。简而言之，用1×PBS洗涤细胞两次，在室温下用新鲜制备的3.7％甲醛的PBS溶液固定5分钟，并用PBS洗涤两次。将细胞在2mL X-gal染色溶液中孵育[1mg / mL的X-gal，40mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液（pH6.0），5mM铁氰化钾（Sigma，St.Louis，MO），5 mM亚铁氰化钾（Sigma），150mM NaCl和2mM MgCl 2]在37℃下保持16小时，然后在Leica DMI3000 B倒置相位对比显微镜下拍摄10倍物镜。在Image J软件（NIH）中定量SA-β-Gal染色阳性细胞。

球形成测定

通过在病毒转导后用嘌呤霉素选择建立稳定表达诱导型TIGAR shRNA的OVCA420 *细胞（TRIPZ诱导型慢病毒shRNA购自Dharmacon，US）。用1μg/ mL多西环素处理稳定的细胞72小时以诱导shRNA的表达。然后将3000个细胞/孔接种到96孔板中（平板用100μL1.5％（wt / vol）琼脂糖预涂覆）并用载体或不同浓度的奥拉帕尼处理10天。在实验结束时，在显微镜下拍摄球状体的照片，并用CellTiter-Glo 3D试剂（Promega Corporation）测量细胞活力。

有针对性的代谢组学分析和分析

通过气相色谱 - 飞行时间质谱（GC-TOF MS）分析初级代谢物。分别提交了来自ES-2 TIGAR shRNA（-Dox），ES-2 TIGAR shRNA（+ Dox），OVCA420 * TIGAR shRNA（-Dox）和OVCA420 * shRNA（+ Dox）的5个生物复制品（每个样品1000万个细胞） 。样品使用GenoGrinder2010（SPEXSamplePrep，的Metuchen，NJ，USA）以1500rpm均质化30秒，并在14,000×离心  克持续2分钟在均质化步骤之前不洗涤细胞以避免在洗涤步骤期间的代谢扰动。用1mL -20℃冷，脱气的乙腈：异丙醇：水（3：3：2，v / v / v）提取细胞。使用CentriVap（Labconco，Kansas，MO，USA）将上清液（500μL）蒸发至干。代谢物分两步衍生：首先，羰基被甲氧基化保护; 第二，酸性质子与三甲基甲硅烷基交换以增加挥发性。使用Restek Rtx-5Sil MS柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）和10 m保护柱，在Agilent 6890 GC（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）上以25 s不分流时间注射0.5μL样品（10 m×0.25 mm×0.25μm）和1 mL / min的氦气流量。将烘箱温度保持在50℃1分钟，然后以20℃/分钟升温至330℃并保持5分钟。在-70eV电子电离下以17光谱/秒从85至500Da获得数据。 Leco Pegasus IV飞行时间质谱仪（Leco Corporation，St.Joseph，MI，USA）上的1850V检测器电压。传输线温度保持在280℃，离子源温度设定在250℃。在运行开始时注射标准代谢物混合物和空白样品，并在整个运行过程中每10个样品进行质量控制。原始数据由ChromaTOF版本4.50预处理，用于基线减法，反卷积和峰值检测。具体来说，3 s峰宽，基线减法刚好高于噪声水平，自动质谱反褶积，以及信号/噪声水平为5的峰值检测：使用整个色谱图中的1。Binbase版本5.0.3用于代谢物注释和报告。Binbase算法使用以下设置（rt×5）：色谱图107计数/秒的有效性，无偏保留指数标记检测，MS相似性> 800，通过5阶多项式回归计算保留指数，保留索引窗口2000单位，以及验证独特的离子和顶点质量。可以在以下位置找到原始代谢组学分析数据 和独特离子和顶点质量的验证。可以在以下位置找到原始代谢组学分析数据 和独特离子和顶点质量的验证。可以在以下位置找到原始代谢组学分析数据https://osf.io/d7pmc/，在Metabolights中为https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS1113。

分析和计算：使用MetaboAnalyst 4.0比较不同代谢物的归一化平均峰值强度值，并使用具有不等方差的双尾学生t检验计算p值。差异表达的代谢物使用Graphpad Prism版本8结果表示为平均值±平均值（SEM）和有和没有两种细胞系之间的差异的标准误差进一步分析多西环素介导的TIGAR KD通过双尾Student的分析吨 -测试。p  <0.05被认为具有统计学意义。* p  <0.05，** p  <0.01，*** p  <0.001，**** p  <0.0001。

NADP / NADPH定量测定

在实验前用三个生物重复和三个技术重复处理细胞和不用多西环素处理细胞72小时。1×10 6从每个样品中收获细胞，并按照制造商的NADP / NADPH定量试剂盒（MAK038，Sigma-Aldrich）的说明书，使用NADP / NADPH提取缓冲液提取细胞。通过10kDa截止旋转过滤器（Amicon®Ultra10K装置）过滤使细胞裂解物脱蛋白。根据制造商方案独立地定量NADP和NADPH，并且在450nm的吸光度下以比色法获得读数。根据制造商的说明书（MAK038，Sigma-Aldrich）进行原始值的计算和标准化。然后在GraphPad棱镜版本8中分析归一化浓度值，并将NADP和NADPH的差异水平表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。使用双尾学生计算统计学显着性t -test。p  <0.05被认为具有统计学意义。* p  <0.05，** p  <0.01，*** p  <0.001，**** p  <0.0001。

RNA测序分析

在用TIGAR shRNA病毒上清液转导细胞后54小时提取总RNA。使用1微克总RNA合成cDNA，并使用Illumina TruSeq RNA样品制备试剂盒v2按照制造商的说明制备测序文库。用非靶向shRNA转导的细胞用作对照。从对照组和实验组的三次重复产生RNA-seq文库。用俄克拉荷马医学研究基金会（OMRF）临床基因组学中心（OK，USA）的NextSeq 500进行新一代测序。使用CLC Genomics Workbench（v.10.0.1）将FASTQ序列定位至人参考基因组（hg19）。通过CLC Genomics Workbench使用RNA-seq工具箱的差异表达确定TIGAR KD细胞中差异表达的基因。此工具箱使用广义线性模型，读取计数适合负二项分布。用Metascape进一步分析差异表达的基因，以鉴定由差异表达的基因鉴定的生物途径32。此外，logranked TIGAR KD和非靶向shRNA的转导细胞之间的基因表达使用基因集富集分析，以确定使用H富集的途径和基因组进行了分析：印记基因组和基因C2.CGP套从MSigDB集合 64，65。

统计和再现性

除非另有说明，否则所有实验分别在三个技术重复和三个生物重复中进行。除非另有说明，否则使用GraphPad Prism（版本6）分析所有数据。三个生物学重复的结果表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）或平均值的标准偏差（SD）。通过单向ANOVA或双尾学生t检验分析治疗方案之间的差异。p  <0.05被认为具有统计学意义。* p  <0.05，** p  <0.01，*** p  <0.001，**** p  <0.0001。

报告摘要

有关研究设计的更多信息，请参阅与本文相关的自然研究报告摘要。

支持本研究结果的数据可在以下站点获得。可以通过以下链接通过EBI Array Express访问原始fastq文件。https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-7284/?query=chien可以通过OSF.io https：// osf访问路径分析数据和用于生成图形的任何其他数据。 io / d7pmc / files / Raw代谢组学分析数据可以在https://osf.io/d7pmc/和Metabolights的https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS1113找到。