亲爱的编辑，
自从ATP激活形式的甲硫氨酸S-腺苷-1-蛋氨酸（SAM）1的初步发现和表征以来，SAM已经成为ATP之后第二常用的酶辅助因子。多种大分子，包括DNA，RNA，蛋白质，多糖，脂质和一系列小分子，通过作用于特定靶原子的高度特异性SAM依赖性甲基转移酶（MTases）进行甲基化。甲基化目标的实例包括核酸（胞嘧啶-C5，胞嘧啶-N4和腺嘌呤-N6），蛋白质残基（精氨酸-N，赖氨酸-N，谷氨酰胺-N和组氨酸-N）和小分子（儿茶酚-O，组胺） -N，甘氨酸-N和硫嘌呤-S）。
已知SAM依赖性MTase的早期序列比对鉴定了DNA胞嘧啶-C5 MTase，DNA腺嘌呤-N6和胞嘧啶-N4 MTase以及蛋白质或小分子MTase 2中的一组保守序列基序。。实质上，两个最保守的序列基序反映了MTase的共同功能：基序I（FxGxG）用于结合甲基供体SAM和基序IV用于催化。基序IV的残基符合目标原子，例如，PC基序（脯氨酸 - 半胱氨酸）负责胞嘧啶的环碳-C5甲基化，而（D / N）PP（Y / F / W）腺嘌呤和胞嘧啶的环外氨基甲基化基序。然而，表观序列和结构相似性不能肯定地揭示酶是否作用于特定底物（DNA，RNA或蛋白质）。实例包括哺乳动物DNMT2，其与DNA胞嘧啶-C5 MTase 3具有序列和结构相似性，但是是tRNA胞嘧啶-C5 MTase; 4和大肠杆菌（大肠杆菌）化酶HemK，这被认为是DNA的氨基转移酶5，但是蛋白质谷氨酰胺转移酶6，7。酶的序列和结构中的保守仅反映了催化甲基转移到胞嘧啶-C5（DNA和RNA）或氨基（腺嘌呤和谷氨酰胺）上的保守性质。
最近，哺乳动物HemK2（NCBI参考序列NP_037372.4）已被证明是DNA腺嘌呤-N6 MTase 8（更名为N6AMT1）和组蛋白H4赖氨酸-12 MTase 9（更名为KMT9），以及其已知的活性。真核释放因子的谷氨酰胺甲基化ERF1 10。三种潜在底物的共同特征是谷氨酰胺，腺嘌呤和赖氨酸的氨基（NH 2）（图1a）。很少有MTase（或任何酶本身）能够作用于寡核苷酸和蛋白质（以及两种不同的氨基酸）。因为以前的研究8，9没有直接比较三种潜在的底物，这里我们分析了HemK2在三种底物上的体外活性。HemK2形成与Trm112一个异二聚体复合物10（tRNA的甲基化蛋白质命名），而我们在纯化表达的重组人HemK2-Trm112异二聚体大肠杆菌（图1B）。HemK2 8的一种特征性DNA底物（GAGTC）的序列与已知细菌DNA腺嘌呤MTase，Caulobacter crescentus细胞周期调节的MTase 11的识别序列（GA N TC）重叠，因此我们将CcrM作为阳性对照。此外，我们还包括大肠杆菌在GATC上用Dam（DNA腺嘌呤MTase）进行比较12。两种细菌酶都在室内纯化（图1b）。
谷氨酰胺，腺嘌呤和赖氨酸的化学结构。目标氮原子以红色圆圈突出显示。b，c研究中使用的重组蛋白（图b）和寡核苷酸（图c）。d，e HemK2-Trm112对双链DNA（图d）或单链DNA（图e）无活性。f通过指示的酶（底部）和3×稀释的寡聚物＃4通过CcrM（顶部）对3H-DNA 的反应产物进行荧光照相。GHemK2-Trm112在GGQ肽底物上有活性。纵轴表示通过Promega MTase-GloTM测定法测量的反应副产物（SAH）浓度。来自反应的样品的放射自显影胶片显示在下面的面板中。h前（上图）和反应后（下图）的MALDI-TOF的代表性光谱。我 pH对含有谷氨酰胺，并通过在凝胶荧光自所示含赖氨酸的肽的甲基化。j HemK2-Trm112（PDB 6H1E）的表面表示显示底物结合界面富含带负电的电位（红色：阴性;蓝色：阳性，白色：中性）。H4肽以黄色显示，目标赖氨酸插入SAM结合的活性位点
我们设计了5个短DNA双链寡核苷酸（＃1到＃5）：＃1含有无腺嘌呤并用作阴性对照，＃2，＃3和＃4寡核苷酸被认为是HemK2 8的底物，＃图4包含CcrM识别序列GA N TC和＃5包含大肠杆菌 Dam识别序列GATC（图1c-字母T和B分别表示顶部和底部链）。在CcrM和Dam在各自底物上完成反应的条件下（寡聚物＃4上的CcrM和寡聚物＃5上的Dam），我们观察到HemK2-Trm112对所检测的五种寡核苷酸没有活性（双链或单链）（图。1D-F）。然而，我们确实观察到HemK2-Trm112对源自eRF1（残基179-193）的肽的活性，对组蛋白H4（残基1-20）的活性大大降低，并且对组蛋白H3肽（残基1-15）没有活性。 pH8的条件（图1g）。在pH8的相同条件下，肽底物的质谱分析证实含有谷氨酰胺的eRF1肽被完全甲基化，而H4肽具有残留的甲基化物质并且没有H3肽的甲基化（图1h）。
大多数（如果不是全部）SAM依赖性MTase使用经典的S N 2反应机制，其需要目标氮处于去质子化状态。在HemK2-Trm112对含谷氨酰胺肽显示出强活性的条件（pH8.0）下，我们观察到对含赖氨酸的H4肽的微小活性（图1i）。我们推断，较高的pH条件可能会增强赖氨酸底物的甲基化（典型的pKa值为~10），正如其他生物化学表征的蛋白质（组蛋白）赖氨酸MTase在大约pH 10 13时具有最佳体外活性所示。将pH调节至10.5后，HemK2-Trm112的活性在H4肽上显着增加（图1i））。使用肽阵列文库的研究表明，eRF1肽上的HemK2甲基化活性需要在之前立即使用甘氨酸，并且在靶谷氨酰胺14之后需要四个残基的精氨酸。H4 K12满足该要求，甘氨酸（G11）和带正电荷的赖氨酸（K16）代替eRF1的相应精氨酸（参见图1h中所示的序列）。在测定中使用的短H3肽（残基1-15）确实含有一个谷氨酰胺和三个赖氨酸残基，但不是HemK2的甲基化底物。最后，HemK2-Trm112复合结构（PDB 6H1E 9）说明了带负电的衬底界面（图1j）），适用于带正电荷的肽，如eRF1和组蛋白H4，但不适用于带负电荷的DNA底物。我们注意到在高pH下对含谷氨酰胺的eRF1肽的活性显着降低（图1i），表明高pH对于HemK2-Trm112复合物的催化和/或稳定性不是最佳的。然而，对于含赖氨酸的H4肽，优选通过高pH使赖氨酸去质子化以发生甲基化，但与pH8的谷氨酰胺甲基化相比，仅降低至大大降低的水平。
总之，在体外使用两种已建立的MTase测定，在将3 H-SAM中的氚掺入底物或在生物发光测定中形成副产物SAH之后，我们显示人HemK2-Trm112异二聚体仅对蛋白质谷氨酰胺和赖氨酸有活性。 ，但对DNA没有活性。鉴于目前对真核基因组DNA中N6-甲基腺嘌呤的兴趣，我们的研究解决了该领域的一个争议。需要额外的数据来解决HemK2对蛋白质谷氨酰胺和赖氨酸的双重特异性 - 一种在具有不同靶残基的两种不同底物上工作的MTase的独特性质，一种位于细胞质（eRF1，谷氨酰胺）中，另一种位于细胞核中（组蛋白H4，赖氨酸）。
最后，我们想要清楚地突出我们在这里提出的研究与Xiao等人的研究之间的差异。8。（1）我们使用在大肠杆菌中表达的重组HemK2-Trm112复合物，并使用四柱色谱法纯化，而Xiao等人。使用N6AMT1-Flag质粒转染到HEK293T细胞中，并根据试剂盒说明纯化蛋白质，推测是一步亲和纯化。（2）我们使用纯化的HemK2-Trm112复合物（图1b但是，没有提到Xiao等人使用的蛋白质制剂。包含Trm112。在一项单独的研究中，来自过表达HEK293T细胞的部分纯化的Flag-N6AMT1似乎含有~15-kDa蛋白，其可能是共纯化的内源Trm112，并且该蛋白制剂在体外没有甲基化DNA寡核苷酸，如N6mA特异性抗体所示（见图S4 Xie等人的15）。（3）我们对DNA的荧光检测（图1f）进行[E] =2μM，[S] =10μM，[ 3 H-SAM] =10μM，而Xiao等人。使用25μl反应体系[E] =0.8μg（~0.8μM），[S DNA ] = 250 pmol（=10μM），[ 3H-SAM] =55μM（这令人费解，因为它是PerkinElmer NET155V [ 3 H-SAM]原液的浓度）。在类似的缓冲液和盐条件下，两种反应均在25℃下进行过夜。