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设计的三重抑制性受体抗性通过CD56改善抗肿瘤CAR-T细胞性能

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发表时间:2019-09-12 11:51作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

设计的三重抑制性受体抗性通过CD56改善抗肿瘤CAR-T细胞性能


摘要

抑制性受体PD-1,Tim-3和Lag-3在肿瘤浸润淋巴细胞上高度表达并损害其抗肿瘤活性。对于有效的癌症免疫疗法,重要的是防止嵌合抗原受体T(CAR-T) - 细胞耗尽。在这里,我们同时在CAR-T细胞上下调这三种检查点受体,并显示所得的PTL-CAR-T细胞经历表观遗传修饰并更好地控制肿瘤生长。此外,我们意外地发现PTL-CAR-T细胞的肿瘤浸润增加以及它们在活的和坏死的肿瘤组织之间的聚集。从机制上讲,PTL-CAR-T细胞上调CD56(NCAM),这对其效应功能至关重要。细胞间CD56分子之间的同源相互作用与CAR-T细胞的增强浸润相关,干扰素-γ分泌增加,CAR-T细胞存活延长。异位表达的CD56促进CAR-T细胞存活和抗肿瘤反应。我们的研究结果表明,三种检查点抑制受体的遗传阻断和由此导致的CAR-T细胞上CD56的高表达增强了对肿瘤生长的抑制。

介绍

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)最终进入疲惫状态并丧失其抗肿瘤功能。这种现象主要是由于在其表面上接收负信号的各种抑制性受体12许多抑制性共受体,包括CTLA-4,PD-1,添-3,LAG-3,TIGIT,CD160,Vista和2B4已经确定345678910,该其表达在不同的肿瘤微环境中被上调11PD-1和相应的配体PD-L1的相互作用导致含有Src-同源结构域的磷酸酶1(SHP1)和SHP2的募集,其促进CD28的细胞质结构域的去磷酸化并最终通过信号级联上调BATF表达1213处于疲惫状态的T淋巴细胞不能杀死靶细胞并且缺乏各种细胞因子的分泌,包括干扰素-γ(IFN-γ),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-2(IL-2),等他们有表观遗传学特异性和染色质结构变化1415共抑制受体和相应配体的阻断显着增强了TIL的抗肿瘤活性。抗体疗法靶向共抑制分子诸如PD-1或CTLA-4的最近的临床成功下划线抵消免疫抑制的治疗潜力1617

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)发挥了有效的抗肿瘤活性。虽然它们有效地根除了白血病/淋巴瘤细胞并取得了令人印象深刻的临床成功,但它们对实体瘤的抑制作用却受到影响18CAR-T细胞与抗体靶向共抑制分子,或敲低表达或PD-1上的CAR-T细胞的其它固有封锁所述的组合,都产生增强的抗肿瘤活性19202122最近,已经进行了改善的抗实体肿瘤活性更努力,包括IL-7的共表达和CCL19,肝素酶,IL-12,或CCR2B在CAR-T细胞2324252627然而,它们对患者抗肿瘤活性的增强仍有待确定。迫切需要更多改善CAR-T细胞的抗实体瘤效应的策略。

它已经显示,PD-1,添-3和LAG-3是高度在各种固体肿瘤类型中表达上的TIL 428293031,以及对CD8 + T细胞中慢性病毒感染3233在这项研究中,我们通过短发夹RNA(shRNA)簇同时降低CAR-T细胞(PTL-Her2-CAR-T细胞)中PD-1,Tim-3和Lag-3的表达,并发现这种处理显着增强抗Her2 +-Her2特异性CAR-T细胞的固体肿瘤作用。我们发现PTL-Her2-CAR-T细胞向异种移植肿瘤组织的浸润显着增加。进一步的研究表明,CD56分子在这些PTL-Her2-CAR-T细胞上被上调,并且细胞间CD56分子之间的同嗜性相互作用有效地增强了抗实体肿瘤活性和延长的存活。

结果

PTL-Her2-CAR-T细胞发挥有效的抗肿瘤活性

首先,我们在慢病毒载体中构建了Her2特异性CAR,对Her2 +人卵巢癌SKOV3细胞具有特异性细胞毒性(补充图1),并与sh-PD-1,sh-Tim-3,sh组合-Lag-3或scramble shRNA(补充图2a)。shRNA的而不是因组引导CRISPR-CAS9在我们的研究中所使用的,作为降低的表达,而不是这些基因的完全失活可能因为他们的其他必要的功能是在肿瘤微环境对T细胞的存活更好343536PD-1,Tim-3和Lag-3的特异性shRNA簇导致其靶基因mRNA的显着抑制(补充图2b))。在确认具有每种抑制性受体下调的Her2特异性CAR-T细胞发挥较高的Her2特异性细胞毒性后(补充图2c,d),我们产生携带shRNA簇的Her2特异性CAR-T细胞用于三种抑制分子,此后命名为PTL-Her2-CAR-T细胞。当与对照Her2-CAR-T细胞相比时,在PTL-Her2-CAR-T细胞中发现所有三种受体的超过80%的敲低效率(补充图3a)。基于CAR-T细胞的特异性细胞毒性和IFN-γ分泌,三种抑制性受体的组合下调同时发挥比单一或双重抑制性受体下调更多的协同效应(补充图3b,c))。此外,PTL-HER2-CAR-T细胞和控制CAR-T细胞分开施用到SKOV3-轴承NOD-PRKDC SCID的II2rg 经由单次静脉内(iv)注射(图(NSG)小鼠1A)。观察到PTL-Her2-CAR-T细胞的更强的抗肿瘤活性(图1b)。重要的是,用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的小鼠的存活率显着提高(图1c),并且在这些小鼠的正常组织中发现非特异性浸润(补充图4)。当CD19时观察到类似的结果 +向携带Raji的NSG小鼠注射携带shRNA簇的CD19特异性CAR-T细胞,用于三种共抑制分子(PTL-CD19-CAR-T细胞)(补充图5)。尽管在不同时间点体内PTL-CAR-T细胞上的抑制性受体持续下调(补充图6),但异种移植瘤中PTL-Her2-CAR-T细胞的浸润和IFN-γ分泌显着升高。组织(图1d,e)。此外,为了测试持续长期PTL-CAR-T细胞的体内功能,我们在第28天进行了肿瘤再激发实验,之后递送了双剂量CAR-T细胞以确保肿瘤可以在常规Her2-CAR-T细胞治疗组中有效抑制。我们发现在PTL-CAR-T细胞处理组中发生了肿瘤再激发的有效控制,而在Her2-CAR-T细胞处理组中仅发生了微弱的肿瘤对照(图1f)。

图。1
图1

PTL-Her2-CAR T细胞在肿瘤组织中发挥有效的抗肿瘤活性和浸润。bc的完整动物实验示意图将SKOV3 / luc细胞皮下接种到NSG小鼠中。七天后,通过尾部注射输注各种CAR-T细胞,并将GP120-CAR-T细胞用作模拟CAR-T细胞。每周一次在IVIS上分析所有小鼠(n  = 3,GP120-CAR-T组; n  = 8,其他组)。b随时间的肿瘤负荷显示每只小鼠定量的生物发光信号。黑十字意味着衰弱或杀死衰弱的老鼠。c小鼠的Kaplan-Meier生存分析。d e将SKOV3细胞皮下接种到NSG小鼠中。七天后,各种CAR-T细胞通过尾注射输注(Ñ  = 3 GP120-CAR-T基团和Ñ =  5为其他组)。在CAR-T细胞输注后第28天,从小鼠切除肿瘤组织,然后进行消化和FACS分析。d肿瘤中浸润CAR-T细胞的百分比。e左图显示了IFN-γ阳性细胞的代表性流式细胞术分析; 右图显示了不同组中肿瘤浸润的CAR-T细胞中IFN-γ阳性细胞的百分比。F上图显示了SKOV3 / luc肿瘤再攻击测定的示意图。将SKOV3 / luc细胞皮下接种到NSG小鼠的相对半球中。7天后,每只小鼠使用2×10 6个 Her2-CAR-T细胞或PTL-Her2-CAR-T细胞,其剂量是上述常规CAR-T处理的双倍剂量,通过尾部注射输注(n  = 4)为每个小组)。在CAR-T细胞输注后第28天,用第二次接种SKOV3 / luc细胞再次攻击长期存活的小鼠。接种另外三只NSG小鼠并用作阳性对照。黑十字意味着死亡或杀死衰弱的老鼠。* P <  0.05,** P <  0.01,**** P. < 0.0001。ns,没有显着差异(单向ANOVA与Tukey的事后检验(de);对数秩Mantel-Cox检验(c))。所有数据均为均值±SEM。所示数据代表两个独立实验。源数据底层B-˚F被提供作为一个源数据文件

据报道,用CD62L和CD127的高表达中枢记忆表型的有效诱导是用于肿瘤的免疫疗法的持续控制至关重要3738然后,我们检查了携带异种移植物的小鼠中CAR-T细胞的可能记忆表型,其在过继转移后存活60天。在我们的实验中还引入了Her2-CAR-T细胞和对照GP120-CAR-T细胞。与对照CAR-T细胞中的那些相比,用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的小鼠的脾脏中高度积累人CD8 +T细胞(补充图7a)。我们进一步确定了CD62L + CD127 +用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的小鼠的脾中CAR-T细胞显着高于用常规CAR-T细胞处理的小鼠(补充图7b)。

来自用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的小鼠的异种移植肿瘤组织的组织切片也显示出在该边缘区域中增强的CAR-T细胞浸润和广泛的IFN-γ释放(图2a,b)。所有移植的肿瘤组织切片中的免疫荧光染色进一步证实,与其他CAR-T细胞治疗组相比,PTL-Her2-CAR-T细胞显着增加了浸润。在这些CAR-T细胞周围和内部,还观察到广泛的IFN-γ释放(图2c,d和补充图8)。鉴于肿瘤细胞的凋亡诱导INF-γ的重要作用,3940可以合理地假设附近的细胞凋亡 - 可能是CAR-T细胞在活肿瘤组织内聚集的受害者。

图2
figure2

PTL-Her2-CAR T细胞在肿瘤组织中发挥增强的浸润。用各种CAR-T细胞处理携带SKOV3的小鼠细胞。在CAR-T细胞输注后第28天,杀死小鼠并从小鼠切除肿瘤组织并用苏木精和曙红(H&E),免疫组织化学(IHC)或免疫荧光染色染色。a肿瘤组织切片的H&E染色。右图分别显示左侧框中的更高放大率(左侧,比例尺200μm;右侧,比例尺50μm)。b抗人CD3抗体和抗人IFN-γ抗体用于IHC分析中的初级染色(比例尺,200μm)。C肿瘤冷冻组织切片的免疫荧光染色。CAR-T细胞用抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor 488)染色,IFN-γ用抗人IFN-γ染色(Alexa Fluor 647)。通过TUNEL测定(Roche TMR-RED)染色细胞凋亡细胞,并用DAPI(蓝色)染色细胞核。比例尺,20μm。所示图片代表两个独立实验。d左图,不同CAR-T治疗组中每mm 2的CAR + T细胞百分比; 右图,在不同组中发现的每mm 2的IFN-γ +斑点的百分比计算来自每只小鼠的至少三个单独的区域和来自每组的三只小鼠。**** P. < 0.0001。ns,没有显着差异(单向ANOVA与Tukey的事后检验(d))。所有数据均为均值±SEM。所示数据代表两个独立实验。源数据底层B-˚F被提供作为一个源数据文件

CD56介导CAR-T细胞的嗜同性相互作用

基于上面观察到的结果,我们假设PTL-Her2-CAR-T细胞彼此的细胞间粘附或趋化性可能是增加浸润的关键因素。为此,我们分别比较了分别从肿瘤组织分离的PTL-Her2-CAR-T细胞和Her2-CAR-T细胞之间的基因表达谱。基因本体论(GO)富集分析显示,一些趋化因子家族成员如cxcl9cxcl10cxcl12显着增加,特别是PTL-Her2-CAR-T中的细胞粘附因子CD56NCAM神经细胞粘附分子)从肿瘤组织中分离出的细胞(图 3a),通过定量实时PCR(qRT-PCR)分析验证(图3b)。此外,PTL-Her2-CAR-T细胞还显示出编码效应分子的多个基因的表达增加,例如IFN-γ,TNF-α和Bcl-2(图3c)。通过ATAC-seq技术,我们发现来自异种移植物衍生肿瘤的PTL-CAR-T细胞中上调基因表达的一些基因位点,包括ifng(Chr12:68,154,768-68,159,747),tnfa(Chr6:31,575,567-31,578,336)和cxcl12(Chr10:44,370,165-44,386,493),bcl2(Chr18:63,123,346-63,320,128)和CD56(Chr11:112,961,247-113,278,436),表现出更高的峰,表明许多功能基因的染色质可及性发生了显着变化(图3d)。

图3
figure3

增加的CD56是收集PTL-Her2-CAR-T细胞的关键因素。a - dfg携带SKOV3的NSG小鼠通过尾部注射各种CAR-T细胞。在CAR-T细胞输注后28天,切除肿瘤组织。将每个组织分成两部分。将一部分消化并分离肿瘤浸润的CAR-T细胞用于RNA-seq(a),qRT-PCR(bc),ATAC-seq(d),另一部分用于免疫荧光染色(f)。一张显示z的热图- 参与细胞粘附和趋化性的差异表达基因的标准化表达,其显着富集基因本体论(GO)生物学过程术语,P值<0.001。RNA表达水平分别用红色/绿色标度表示高和低表达水平。bc通过qRT-PCR验证基因的相对mRNA水平。d标准化ATAC-seq数据的基因组比对轨迹,显示各种CAR-T细胞中基因ifngtnfacxcl12bcl2CD56的开放染色质ËPTL-Her2-CAR-T的细胞毒活性(n  = 3,3个健康供体)细胞,其中CD56敲低SKOV3细胞和MDA-MB-231(阴性对照)。f肿瘤冷冻组织切片的免疫荧光染色。用抗小鼠IgG H&L(绿色)染色CAR-T细胞。CD56用抗人CD56(白色)染色,IFN-γ用抗人IFN-γ(红色)染色。细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺,20μm。g左图,不同CAR-T治疗组中每mm 2的CAR + T细胞百分比; 中图,不同组中每mm 2 CD56 +细胞的百分比; 右图,IFN-γ + 2的百分比每毫米斑点在不同的群体中。计算每只小鼠的至少三个单独的区域和每组的三只小鼠。* P <  0.05,** P <  0.01,*** P <  0.001,**** P <  0.0001。ns,没有显着差异(单向ANOVA与Tukey的事后检验(eg);双尾学生t检验(b,c))。所有数据均为均值±SEM。bce显示的数据是来自三个独立实验的代表性数据和(ad f)来自两个独立的实验。源数据底层bÇÈ被提供作为一个源数据文件

为了确定有助于提高PTL-Her2-CAR-T细胞抗肿瘤活性的关键因素,我们进一步分别敲除了与细胞间粘附或趋化性相关的上调因子。只有具有CD56下调的PTL-Her2-CAR-T细胞在体外显示出显着降低的细胞毒性活性(图3e和补充图9),表明增加的CD56在增强抗肿瘤活性中起关键作用。此外,我们通过在异种移植物衍生的组织切片中染色人CD56,CD3和IFN-γ进行免疫荧光,发现CD56 +细胞与浸润的CD3 + -PTL-Her2-CAR-T细胞和IFN-γ分泌强烈共定位。(图 3f,g和补充图。10)。在PTL-CD19-CAR-T细胞中也观察到CD56的类似上调,其渗入CD19 + Raji肿瘤组织(补充图11)。尽管如此,尽管用Her2-CAR-T细胞加抗PD-1阻断抗体的治疗也发挥增强的抗肿瘤作用,但是在Her2-CAR-T细胞上CD56分子的表达没有显着改变(补充图12)。总之,这些结果表明PD-1,Tim-3和Lag-3的三重下调导致CD56的上调,并且肿瘤组织中PTL-Her2-CAR-T细胞的增强的浸润可以由CD56介导。CD56的同源相互作用已在神经系统中得到很好的研究 41中42CD56的Ig1和Ig2模块介导位于相同细胞表面的CD56分子的二聚化(顺式相互作用),而Ig3模块介导通过同时结合到相对细胞表面上表达的CD56分子之间的相互作用(反式相互作用)。 IG1和Ig2的模块4243我们假设CD56的细胞间同嗜性相互作用可能有助于PTL-Her2-CAR-T细胞的相互作用。如Lys303和Phe305从CD56的IG3域介导的反式相对细胞表面上CD56的相互作用4142,我们插入的基因CD56或者具有突变K303A和F305A的CD56,其后称为CD56mut,进入表达Her2-CAR的载体。Her2-CAR-T细胞中的CD56过表达在体外显示出增加的抗肿瘤活性,而CD56mut则没有(图4a)。此外,在过继转移至携带SKOV3的NSG小鼠实验中,过表达CD56的Her2-CAR-T细胞显示出显着增强的抗肿瘤能力,而CD56mut的过表达则没有(图4b)。此外,与表达CD56mut的CAR-T细胞相比,肿瘤组织中表达CD56的CAR-T细胞的浸润和IFN-γ分泌显着增加(图4c)),这表明CD56的嗜同性相互作用对于Her2-CAR-T细胞的浸润,存活和抗肿瘤活性是重要的。

图4
figure4

CD56的嗜同性相互作用介导CAR-T细胞的相互作用。a通过LDH释放试验检测CD56对Her2-CAR-T细胞靶向的SKOV3细胞的细胞毒活性的影响,并将MDA-MB-231细胞用作阴性对照(n = 3,3个健康供体)。bc携带SKOV3的NSG小鼠分别通过尾巴注入CD56-Her2-CAR-T细胞或CD56mut-Her2-CAR-T细胞。监测肿瘤,6天后切除肿瘤组织并消化用于FACS。b体积小鼠(n  = 6,CD56mut-Her2-CAR-T组; n =  4,CD56-Her2-CAR-T组)。C左图,通过用抗Fab抗体检测CAR部分的scFv片段,对肿瘤浸润的CAR-T细胞进行代表性的流式细胞术分析。右图,不同组的肿瘤浸润CAR-T细胞中IFN-γ阳性细胞的百分比。d左图,细胞间CD56之间FRET测定的示意图。右图,表达CFP(青色荧光蛋白)-CD56的CD8 + T细胞和表达YFP(黄色荧光蛋白)-CD56的CD8 + T细胞(n  = 3,3个健康供体)之间的FRET增加CFP-CD56表达CD8 + T细胞与YFP-PD-1表达CD8混合+ T细胞测定为阴性对照。Ë构建携带Her2-CAR-T部分和SrtA-CD56,G5-CD56或G5-CD56mut的慢病毒载体。f直方图显示体外G5-CD56-Her2-CAR T细胞或G5-CD56mut-Her2-CAR T细胞中的缀合的AlexaFluor488(表明细胞间转移)。将具有G5-PD-L1细胞的SrtA-PD-1细胞用作阳性对照,并将具有G5-CD56-Her2-CAR T细胞的SrtA-PD-1细胞用作阴性对照。数据代表三次独立的实验。g体内LIPSTIC测定的程序。h左图显示通过流式细胞术分析在肿瘤中生物素标记G5-CD56-Her2-CAR T细胞或G5-CD56mut-Her2-CAR T细胞(CFSE标记的)。右图显示了生物素+的百分比G5-Her2-CAR T细胞如左图所示门控( 每组n = 3)。* P <  0.05,** P <  0.01(使用Tukey事后检验的单向ANOVA(ad);双尾学生t检验(bh))。所有数据均为均值±SEM。adf)显示的数据是来自三个独立实验的代表性数据和来自两个独立实验的bch)。源自abd的源数据h作为源数据文件提供

为了搜索CD56 + CAR-T细胞之间CD56同源相互作用的更多证据,我们产生了表达CFP-CD56和YFP-CD56的载体并分别将它们转导到CD8 + T细胞中。我们发现CFP-CD56和YFP-CD56之间的荧光共振能量转移(FRET)的发射比率显着增加,表明CD56的嗜同性相互作用发生在细胞间(图4d)。此外,我们引入了“通过SorTagging细胞间接触标记免疫伙伴关系”(LIPSTIC)系统来测量CD56-CD56同源性相互作用44将Her2-CAR与G5-CD56或SrtA-CD56共表达的双顺反子载体转导入CD8 +通过细胞培养物中的LIPSTIC标记证实T细胞和CD56-CD56相互作用(图4e,f)。然后我们过继共转移携带G5-CD56或SrtA-CD56的Her2-CAR-T细胞到含SKOV3的NSG小鼠中,72小时后进行LIPSTIC标记(图4g),发现LIPSTIC标记在肿瘤上- 渗透的G5-CD56-I-CAR T细胞,而不是G5-CD56mut-I-CAR T细胞,其直接证实体内CAR-T细胞之间的CD56-CD56分子间相互作用(图4h)。

CD56的同源相互作用增强了抗肿瘤活性

据报道,CD56的同源相互作用可被神经细胞中的P3DE或P3G肽有效阻断42因此,我们检查了这些合成的肽对内源性CD56的嗜同性相互作用以及随后PTL-Her2-CAR-T细胞的活性的影响。FRET测定表明,组合的P3DE和P3G处理以剂量依赖性方式抑制CD8 + T细胞中的CD56-CD56相互作用(图5a)。用这些肽而不是对照P3B肽处理后,PTL-Her2-CAR-T细胞的特异性细胞毒性从46.18%降低至6.19%(图5b)。因此,IFN-γ分泌水平也显着受损(图5c)。此外,将PTL-Her2-CAR-T细胞输注到通过单次静脉内注射用封闭肽(P3DE + P3G)或对照肽处理的携带SKOV3的NSG小鼠中。我们发现阻断肽显着损害PTL-Her2-CAR-T细胞的抗肿瘤浸润以及IFN-γ分泌效力(图5d-h和补充图13)。

图5
figure5

CD56的同源相互作用增强了CAR-T细胞的抗肿瘤活性。一个图表显示FRET的CFP-CD56和YFP-CD56之间的发射率。将数据绘制为500~550nm / 495~505nm比率,相对于P3DE + P3G肽的浓度。bc P3DE + P3G对靶向SKOV3细胞的PTL-Her2-CAR-T细胞功能的影响通过细胞毒活性检测(n  = 4,4个健康供体)(b)和IFN-γELISpot检测(n)  = 2,2名健康捐赠者)(c)。所有肽都是在200微克毫升的浓度使用-1d - h携带SKOV3的NSG小鼠通过尾部注入各种CAR-T细胞。将接受PTL-Her2-CAR-T细胞输注的小鼠分成两组,分别用P3DE + P3G或PNC肽。13天后,杀死小鼠并消化肿瘤组织用于FACS。d小鼠体积( 每组n = 4-5只小鼠)。e通过用抗Fab抗体检测CAR部分的scFv片段,对CAR-T细胞进行代表性的流式细胞术分析。f代表性流式细胞术分析不同组肿瘤浸润的CAR-T细胞中的IFN-γ阳性细胞。G在P3DE + P3G肽或PNC存在下,用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的异种移植肿瘤的冷冻组织切片的免疫荧光染色。用抗小鼠IgG H&L(绿色)染色CAR-T细胞。CD56用抗人CD56(白色)染色,IFN-γ用抗人IFN-γ(红色)染色,细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺,20μm。h左图,不同CAR-T治疗组中每mm 2的CAR + T细胞百分比; 中图,不同组中每mm 2 CD56 +细胞的百分比; 右图,每mm 2的IFN-γ +斑点的百分比在不同的群体中。计算来自每只小鼠的至少三个单独的区域和来自每组的三只小鼠。** P <  0.01,*** P  <0.001,**** P  <0.0001。ns,没有显着差异(单向ANOVA与Tukey的事后检验(bd);双尾学生t检验(ch))。所有数据均为均值±SEM。基础a-dh的源数据作为源数据文件提供

CD56增强PTL-Her2-CAR-T细胞的抗凋亡能力

由于PTL-Her2-CAR-T细胞中Bcl-2表达较高,我们测量了携带外源性CD56的PTL-Her2-CAR-T或Her2-CAR-T细胞的抗凋亡能力,并发现凋亡细胞的百分比在剥夺任何额外细胞因子后培养6天后,携带外源性CD56的PTL-Her2-CAR-T细胞和Her2-CAR-T细胞的数量远低于常规Her2-CAR-T细胞(图6a)。TNF-α和FasL(10 ng ml -1诱导的PTL-Her2-CAR-T细胞和携带外源性CD56的Her2-CAR-T细胞凋亡率也明显低于Her2-CAR-T细胞。 (图6b)。这些数据表明CD56表达增强了CAR-T细胞的抗凋亡能力。

图6
figure6

CD56增强CAR-T细胞的抗凋亡能力。一个左面板,培养6天与细胞因子剥夺后的Her2-CAR-T,PTL-HER2-CAR-T,和CD56-HER2-CAR-T细胞的凋亡细胞比例的代表流动图。右图,膜联蛋白V的百分比-和PI -细胞门控如左图所示。b左图,各种CAR-T细胞中由TNF-α和FasL(10ng ml -1诱导的凋亡细胞比例的代表性流程图右图,膜联蛋白V的百分比-和PI -细胞门控,如左图所示。** P  <0.01,**** P  <0.0001(双尾学生t-测试)。所有呈现的数据总结了平均值±SEM。所示数据是来自三个独立实验的代表性数据。基础ab的源数据作为源数据文件提供

讨论

CD56,也被称为NCAM(NCAM1,NCAM-140),在神经元的生长,发育,再生,突触形成和维护方面发挥关键作用414243此外,CD56是自然杀伤(NK)细胞的典型细胞表面标志物。多的研究表明,CD56也于其它淋巴样细胞,包括γδT细胞和活化的CD8检测+ T细胞,以及树突状细胞454647CD56通常与激活或细胞毒性的免疫细胞相关联48495051据报道,人CD56阳性细胞毒性淋巴细胞被更多激活并发挥更有效的抗肿瘤作用52人类CD56 NK细胞能够产生更多的细胞因子如IFN-γ,TNF-α等53不幸的是,由于小鼠NK细胞中的CD56表达非常低,因此仍然不清楚为什么CD56的高表达与更多的活化和IFN-γ和TNF-α的高分泌相关。虽然体外研究表明CD56 +NK细胞和CD56 +基质细胞之间的相互作用可能有助于NK细胞的运动,但分子机制仍有待鉴定54

通过研究CAR-T细胞在肿瘤组织中增加的浸润和抗肿瘤活性的潜在机制,我们证明了在同时PD-1,Tim-3和/或Tim-3的表达下降后,CAR-T细胞上出现了大量的CD56。 LAG-3。这种三重下调,而不是PD-1的单一表达下调,导致CAR-T细胞中的表观遗传修饰,并增加CD56的染色质可及性。基因,以及一些重要基因,包括IFN-γ,TNF-α和Bcl-2,并随后增强其转录表达。此外,包括CXCL9,CXCL10和CXCL12在内的几种趋化因子被肿瘤浸润的PTL-CAR-T细胞的全基因组转录分析上调。然而,在初步体外试验中,我们未发现PTL-CAR-T细胞的任何增强迁移(数据未显示)。然而,这些趋化因子仍然可能在肿瘤组织内的PTL-CAR-T细胞相互吸引中起作用,并有助于PTL-CAR-T细胞的活性。

CAR-T细胞中CD56的过表达也发挥了有效的抗肿瘤作用。此外,通过阻断界面上的肽或CD56突变以阻断嗜同性相互作用,阻断细胞间CD56嗜同性相互作用,显着降低了抗肿瘤效果。因此,通过比较有或没有CD56表达的抗肿瘤作用,以及肿瘤组织中的额外抗肿瘤作用,IFN-γ分泌,细胞凋亡抗性以及CAR-T细胞的浸润或存活,我们发现了CD56的同源相互作用的重要性。 。此嗜同性相互作用可能受益由肿瘤杀伤作用(1),导致高得多的局部浓度的IFN-γ,这损害局部血管生成,并因此诱导肿瘤细胞死亡3940; (2)将生存信号通过CD56分子相互传递,这可能导致CAR-T或其他CD56 +免疫细胞对局部恶劣环境更具抵抗力; (3)通过可能的信号通路同步CD56 +免疫细胞的其他未知功能,如Fyn /粘着斑激酶/ ERK2,Ras-丝裂原活化蛋白激酶,磷脂酶Cγ,血影蛋白/ CaMKII,血影蛋白/PKCβ,PAK1,RPTPa,或TrkB的,作为NCAM(CD56)的功能神经组织的嗜同性相互作用435556

通过一种不寻常的方法,我们意外地确定了CD56在免疫细胞中高表达的作用。需要更多的研究来进一步揭示同时敲低PD-1,Tim-3和Lag-3如何导致CD56基因活化的机制,以及细胞间CD56分子的嗜同性相互作用如何能够直接增强IFN的分泌。 -γ和对细胞凋亡的抵抗力。此外,正如我们在本研究中所描述的,CD56表达的操作可能是用于根除各种实体瘤和控制许多其他疾病的特别合适的治疗策略。

方法

细胞系

从ATCC获得HEK293T,SKOV3和MDA-MB-231细胞系,并在补充有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA) )。通过用携带荧光素酶-IRES-RFP部分的重组逆转录病毒感染SKOV3建立SKOV3 / luc / RFP细胞,然后分选RFP 细胞。还从ATCC获得Raji细胞,并在补充有10%FBS(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA)的RPMI 1640(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养。所有细胞培养基均含有100U ml -1青霉素和100μgml -1链霉素。将细胞维持在含有5%CO 2的潮湿气氛中在37°C。由于常规细胞系分别高度表达Her2或CD19,SKOV3和Raji细胞系用于卵巢癌或淋巴瘤的肿瘤模型。确认细胞系的靶抗原的表面表达,并且常规测试排除支原体污染。

原代人T淋巴细胞的分离和培养

外周血单核细胞(PBMC)来自通过Ficoll-Hypaque梯度分离从健康供体(广州血液中心,广州)的匿名血沉棕黄层获得的健康志愿者的样品。用磁珠将原代人CD8 + T细胞负纯化至具有富集组DM(BD-IMag TM)的PBMC的纯度> 98%T淋巴细胞被抗CD3(R&D Systems)激活,抗CD28激活(R&D Systems)抗体(Abs)1μgml -1并且在retronectin包被的板(Takara Bio,Inc.,Shiga,Japan)中感染。转导的T细胞在含有90%RPMI 1640(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA)的条件培养基中扩增,所述培养基补充有10%FBS(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA),0.1mM非必需氨基酸(Gibco,Invitrogen)。 ,Carlsbad,CA),2mM GlutaMAX(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA)和0.05mM 2-巯基乙醇,初始浓度为1×10 6个细胞/ ml。每周两次用重组IL-2(10ng ml -1)(R&D Systems)喂养细胞

CAR编码慢病毒载体的构建

抗Her2 scFv衍生自mAb FRP5 57,抗CD19 scFv衍生自mAb FMC63 58如补充图1a所示,scFv区域与CD28的内部域(核苷酸460-660; GenBank登录号NM_006139.3),CD137(核苷酸640-765; NM_001561.5)和CD3ζ(核苷酸160-)融合。 492; NM_198053.2)通过重叠PCR。将GP120-CAR(HIV-1 59的特异性靶向gp120抗原)用作模拟CAR-T细胞。携带Her2特异性CAR部分的慢病毒载体和衍生自miR-106b簇的shRNA显示在补充图2a中siRNA的序列列于补充表1中

重组慢病毒颗粒的转导

为了产生假型化的慢病毒上清液,在转导前一天,将HEK293T细胞以每100mm培养皿8×10 6个细胞接种二十四小时后,通过用编码各种CAR部分(13.5μg)的质粒,编码VSV-G包膜的pMD.2 G(7.5μg)和包装载体psPAX2(16.5μg)共转染HEK293T细胞产生假病毒。按照制造商的说明使用磷酸盐转染系统。48小时后收集上清液,并通过0.45μm膜过滤以除去细胞碎片。通过超速离心(Optima XE-100,Beckmann)以827,000× g在4℃下浓缩假病毒  2小时。然后激活CD8 +T淋巴细胞用Retronectin进行包被的板用慢病毒转导的上清液,用聚凝胺(TR-1003-G,Sigma)中以8μg毫升-1,然后离心以350×90分钟  ,然后在37℃温育。12小时后,除去重组病毒,如上所述将T细胞在条件培养基中扩增。在IL-2存在下(每周喂食两次,10ng ml -1将遗传修饰的T细胞维持在完全T细胞培养基中,并在转导后14天用于功能测定。

RNA分离和qRT-PCR

用TRIZOL试剂(Life Technologies)分离总RNA,并根据制造商的说明书使用PrimeScript逆转录试剂盒(TaKaRa)作为制备cDNA的模板。用于实时qRT-PCR的引物列于补充表2中在CFX96实时系统(Bio-Rad)上用SYBR Premix ExTaq试剂盒(TaKaRa)进行定量PCR。测量人甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内源对照。

流式细胞术

用驴抗小鼠Fab(Abcam,150109)标记CAR部分。对于T细胞表型分析,使用以下抗体:来自eBiosciences的小鼠抗人PE-CD8(克隆HIT8a,12-0089-42),APC-CD56(克隆TULY56,17-0566-42); 小鼠抗人APC-CD279(克隆EH12.2H7,329908),FITC-CD223(克隆11C3C65,369308),亮紫421-CD127(克隆A019D5,351310),PE / cy7-CD62L(克隆DREG-56,304822)来自Biolegend的PE-生物素(克隆1D4-C5,409003); 来自BD Horizon的小鼠抗人Brilliant Violet 421-Tim-3(克隆7D3(RUO),565562)。对于细胞内染色,使用BD Cytofix / Cytoperm试剂盒固定并透化T细胞,作为制造商的推荐。抗人CD8-PE(克隆HIT8a,eBiosciences,12-0089-42)和驴抗小鼠Fab(Polyclonal,Abcam,ab150109)用于细胞外染色,抗人IFN-γ-eFluor 450(Clone 4 S.B3,85-48-7319-42,eBiosciences)用于细胞内染色。在BD FACSAria上获得染色样品,并用FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR)分析。

酶联免疫吸附测定

将各种CAR-T细胞与靶细胞以5:1(E:T比)在96孔板(V底)中共培养。16小时后收集上清液,并根据制造商的说明书使用TNF-α-(Neobioscience)和IL-2-(MultiSciences)特异性酶联免疫吸附测定试剂盒分析细胞因子释放。

酶联免疫吸附斑

对于酶联免疫吸附斑点(ELISpot)测定,将CAR-T细胞与靶细胞(10 4个细胞)以效应物 - 靶标比例(E:T = 5:1)混合,然后加入到抗γ干扰素中。来自人IFN-γELISpot测定试剂盒(DKW22-1000-096s; Dakewei)的-γ抗体预涂板,以及阴性对照(单独的效应CD8 + T细胞)或阳性对照(植物血凝素刺激)。将平板在含有5%CO 2的潮湿气氛中温育16-20小时在37°C。然后根据制造商的说明书进行ELISpot测定。用S6超免疫扫描仪(Cellular Technology Ltd)扫描平板,通过ImmunoSpot软件(版本5.1.34)(Cellular Technology Ltd)计算IFN-γ阳性T细胞的数量。

细胞毒性测定

通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法测量T细胞杀死肿瘤靶细胞的能力。简而言之,将CAR-T细胞与靶细胞以不同比例(从5:1至0.15:1)在96孔板(V底)中共培养24小时。然后根据制造商的说明,通过CytoTox96非放射性细胞毒性测定法(Promega,G1781)测量LDH释放。检测仅含有效应细胞和单独靶细胞的孔的吸光度值,并从共培养物的值中减去背景。将含有靶细胞的孔与裂解试剂在37℃下混合30分钟,得到的发光设定为100%裂解。通过使用以下公式计算细胞毒性:

异种小鼠模型

我们用NSG(NOD-PRKDC SCID IL2RG TM1 / Bcgen,北京Biocytogen有限公司)小鼠模型来评估转导的CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果。所有小鼠实验均严格遵循道德规范,并经中山大学机构动物护理和使用委员会批准。为了观察体内CAR-T细胞的抗肿瘤活性,将6-8周龄雌性NSG小鼠皮下(sc)接种到100xL 50:50 Matrigel(Corning)中的5×10 6个 SKOV3 / luc细胞的右侧腹部。和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在第7天,给小鼠腹膜内(ip)输注VivoGlo Luciferin(Promega,150 mg kg -1)体重),用异氟烷麻醉,并用Living Image软件(PerkinElmer)在体内成像系统(IVIS)上成像。然后通过尾静脉将1×10 6个转导的CAR-T细胞(在200μlPBS中)过继转移到携带肿瘤的小鼠中,并且每3天腹膜内注射IL-2,每只小鼠1μg。对于再激发实验,过量转移2×10 6个转导的CAR-T细胞(在200μlPBS中),其剂量是上述实验的两倍,以确保在常规Her2-CAR-中可以根除肿瘤。 T细胞治疗组。每周一次在IVIS上重新分析小鼠。没有使用随机化。

对于其他动物实验,将悬浮在0.1ml PBS中的5×10 6个 SKOV3细胞或2×10 6个Raji细胞皮下注射到6-8周龄雌性小鼠的右胁腹中。CAR-T细胞通过尾静脉在7天后注入,并通过二维测量(毫米)测量肿瘤体积:肿瘤体积=长度×宽度2/2。每3天腹膜内注射IL-2,每只小鼠1μg。当对照小鼠中的平均肿瘤负荷达到1500-2000mm 3时,小鼠被杀死一些组织用IV型胶原酶消化(2mg ml -1(Sigma)在37℃下保持30分钟,通过在不连续的Percoll梯度(Haoyang,China)上离心分离肿瘤浸润的T细胞。其他用于免疫组织化学(IHC)和免疫荧光测定。对于涉及动物实验的检查点阻断,每3天以每只小鼠200μg腹膜内注射抗PD-1阻断抗体(克隆EH12.2H7,329946,Biolegend)。

全基因组转录分析

对于微阵列分析,来自Trizol中肿瘤浸润性T细胞的纯化RNA在干冰上运输至Aksomics(中国上海),以通过Agilent Whole Human基因组Oligo微阵列平台进行分析。根据制造商的说明书进行RNA制备和微阵列杂交。简而言之,使用制造商的说明书扩增来自每个样品的总RNA并转录成荧光cRNA。将标记的cRNA杂交到全人基因组寡核苷酸微阵列(4×44K,Agilent Technologies)上。洗涤载玻片后,用Agilent Scanner G2505C扫描阵列。安捷伦特征提取软件(版本11.0.1.1)用于分析采集的阵列图像。使用GeneSpring GX v12进行分位数归一化和随后的数据处理。1个软件包(Agilent Technologies)。在原始数据的分位数归一化之后,通过倍数变化过滤鉴定差异表达的基因。通过z-标准化,差异表达基因的转录谱数据用于利用MEV软件(http://www.tm4.org/)的热图进行可视化应用GO富集分析来确定富含特定GO生物过程术语的这些差异表达基因的作用。

ATAC-SEQ

每个条件60进行ATAC-seq两次独立实验简而言之,使用10mM Tris-HCl,10mM NaCl,3mM MgCl 2的溶液从每次重复的50,000个分选的细胞中分离细胞核。和0.1%IGEPAL CA-630。在细胞核分离后,立即使用Nextera Tn5转座酶和TD缓冲液(Illumina)在37℃下进行转座反应45分钟。使用Qiagen MinElute试剂盒纯化转座的DNA片段,用双指数(Illumina Nextera)条形码,并使用NEBNext High Fidelity 2×PCR master mix(New England Labs)进行PCR扩增。通过使用Agilent Bioanalyzer和KAPA定量RT-PCR(KAPA Biosystems)测定测序文库的大小分布和摩尔浓度。使用Illumina HiSeq X ten平台进行测序以获得至少 每个样品50个片段。使用Bowtie2将配对末端读数定位至hg38参考基因组。仅保持一致的映射对以进行进一步分析。使用MACS v1.4进行峰调用以鉴定序列标签富集区域。这些峰显示在IGV基因组浏览器中,并进一步处理以进行注释和差异开放染色质检测。

组织处理和免疫组织化学

根据标准程序固定,处理和染色组织样品。简而言之,从小鼠切除肿瘤并用中性缓冲的4%甲醛固定,并应用于由Biopathology Institute Co.,Ltd(Servicebio,China)进行的苏木精和伊红(H&E)染色。对于IHC,将切除的肿瘤组织浸入Tissue-Tek OCT化合物(4583,Sakura Finetek)中并快速冷冻以通过冷冻切片机(Thermo NX50)产生冷冻切片。用于IHC染色的一抗是多克隆兔抗人CD3mAb(17617-1-AP,蛋白质技术)或多克隆兔抗人IFN-γmAb(ab9657,Abcam)。使用显微镜(Leica,DM6000B)获得H&E染色样品和IHC切片的图像。

免疫荧光

将切除的肿瘤组织浸入Tissue-Tek OCT化合物(4583,Sakura)中并快速冷冻以产生冷冻切片。用Alexa Fluor 488-缀合的驴抗小鼠IgG H&L(多克隆,ab150109,Abcam)染色CAR-T细胞。一抗如下:兔抗人CD56抗体(克隆EP2567Y,ab75813,Abcam)和山羊抗人IFN-γ抗体(AF-285-SP,R&D)。Alexa Fluor 594-缀合的驴抗兔IgG H&L(ab150076,Abcam)和Alexa Fluor 647-缀合的驴抗山羊IgG H&L(ab150075,Abcam)用作二抗。原位细胞死亡TMR(Roche BR,12156792910)用于标记凋亡组织。DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚; Thermo Fisher Scientific)用于细胞核的染色。使用激光扫描共聚焦显微镜(ZEISS LSM 800)检测荧光信号。为了定量免疫荧光结果,用Imaris软件(版本7.4)(BITPLANE)使用Spot函数进一步分析活体和凋亡细胞之间的边缘图像,以定位和计数CAR-T细胞,IFN-γ,或CD56阳性细胞,基于大小和强度阈值。或者,CD8的绝对数量在感兴趣区域的9个高功率视野中每mm 2的+ T细胞,IFN-γ或CD56阳性细胞斑点进行统计学分析(来自每只小鼠的三个独立视野和来自每组的三只小鼠)。

LIPSTIC试验

LIPSTIC测定按照先前的报告进行,稍作修改44简而言之,在CD56 cDNA的5'末端截短信号肽; 通过基于PCR的连接分别添加在5'-末端具有信号肽的SrtA基因或G5基因。G5-CD56mut(具有突变K303A和F305A的CD56)用作对照。它们分别通过IRES基序与Her2-CAR连接。还通过与阳性对照相同的方法构建SrtA-PD-1和G5-PD-L1。对于体外试验,用携带SrtA-CD56-Her2-CAR或G5-CD56-Her2-CAR / G5-CD56mut-Her2-CAR的重组慢病毒转导CD8 +T细胞,分别以1:1的比例混合(10 6在1.5ml锥形管中加入化学合成的AlexaFluor488-SELPETGG,使其终浓度为100μM。将细胞在室温下孵育30分钟并洗涤三次,然后进行荧光激活细胞分选(FACS)染色。对于LIPSTIC体内实验,将6-8周龄雌性NSG小鼠皮下接种到右侧,其中5×10 6个 SKOV3细胞在100μL50:50基质胶(Corning)和PBS中。用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记G5-CD56-Her2-CAR-T / G5-CD56mut-Her2-CAR-T细胞。将SrtA-CD56-Her2-CAR-T细胞和G5-CD56-Her2-CAR-T / G5-CD56mut-Her2-CAR-T细胞以1:1的比例混合(10 6然后在第7天通过尾静脉转移到小鼠中。然后在72小时后将生物素 - 氨基己酸-LPETG注射(ip)到小鼠中。12小时后,杀死小鼠并切除肿瘤组织,然后消化用于FACS分析。在Sinobioway(中国漳州)定制合成与AlexaFluor488琥珀酰亚胺酯染料和生物素 - 氨基己酸-LPETGS(C-末端酰胺,95%纯度)缀合的SELPETGG(C-末端酰胺,95%纯度)。

FRET测定

FRET测定通过以下稍作修改先前的程序进行的6162简而言之,在CD56,CD56mut或PD-1的5'末端,如所示添加青色荧光蛋白(CFP)或黄色荧光蛋白(YFP)(在CD56 cDNA的5'末端截短信号肽,通过基于PCR的连接分别添加在5'末端具有信号肽的CFP或YFP。用携带如所示的CFP-CD56,CD56mut,YFP-CD56或YFP-PD-1的重组慢病毒转导CD8 + T细胞,其以1:1的比例混合(10 6将每个群体的细胞重新悬浮于无酚红培养基中,并接种于96孔黑色板(Corning)中。引入不同浓度的P3DE和P3G肽以阻断CD56-CD56相互作用。温育4小时后,使用Glomax Discover检测系统(Promega)测量495~505nm(供体)和500~550nm(受体)的发射。将数据绘制为500~550nm / 495~505nm比率,相对于P3DE / P3G肽的浓度。实验独立重复至少三次,结果表示为一式三份进行的单个实验的平均值±SEM。

细胞凋亡检测

根据制造商的说明,使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(DOJINDO,中国上海)检测细胞凋亡。用重组TNF-α(10ng ml -1)和FasL(10ng ml -1)培养24小时或培养6天后剥夺任何额外的细胞因子,CAR-T细胞用抗人标记APC-CD56(Clone TULY56,17-0566-42),膜联蛋白V和碘化丙锭,然后通过流式细胞仪BD FACS Aria检测。

统计分析

使用Prism(GraphPad)软件进行统计学测试。所有实验数据均以平均值±SEM表示。通过Kolmogorov-Smirnov正态性检验证实了高斯分布。使用未配对的双尾学生t-测试和单向方差分析与Tukey的事后测试进行进一步的多重比较。

报告摘要

有关研究设计的更多信息,请参阅与本文相关自然研究报告摘要

数据可用性

所有相关数据都包含在本手稿和/或其补充信息文件中。微阵列数据已经保藏在GEO(Gene Expression Omnibus,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中,登记号为GSE131107。ATAC-seq数据已保存在SRA(序列读取档案,https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra)中,登记号为PRJNA542504。图1和2的源数据。1 B-F 2 d,3 B,C,E,G,4 A,B,d,H,5 -d中,h和6的a,b,和补充图。1 d,e,2 b-d,3 a-c,5A-C,7的a,b,911,和12 B,C被提供为一个源数据文件。


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