非特定的症状，以及缺乏对接受初级保健的病人进行成本有效的测试，导致诊断时间的增加和脑癌患者的不良预后。一种快速、经济、有效的分诊试验可以显著改善患者的这一途径.利用衰减全反射(ATR)-傅里叶变换红外光谱(FTIR)检测脑癌的血液试验，连同机器学习技术，正朝着临床方向发展。然而，虽然方法很简单，不需要大量的样本准备，但这种方法的吞吐量是有限的。在这里，我们描述了分析血清的仪器的开发，该仪器能够区分癌症和对照患者，其敏感性和特异性分别为93.2%和92.8%。此外，我们还提供了第一项前瞻性临床验证研究的初步数据，展示了这一创新技术如何能够对患者进行分类，并允许快速获得成像。

脑瘤患者的症状通常是非特异性的，并且更多的是与良性的非肿瘤状态相关。1..头痛，成人脑瘤最常见的症状2，也发生在4.4%的初级保健咨询中3..因此，及时诊断脑瘤具有挑战性。在英国，脑瘤是最常见的癌症类型。1而这些病人中的许多人已经看过他们的全科医生(GP)好几次了。

很难确定哪些有非特异性症状的病人最有可能患脑瘤，应该优先进行紧急医学成像。4..对疑似脑瘤最好的基于症状的转诊指南只期望在转诊人群中以大约3%的频率识别脑瘤。需要新的战略来支持决策，特别是在初级保健方面。5.

在路径的这一点上进行血液测试可以促进根据症状而被认为有危险的患者的分层，优先考虑病人的紧急脑成像(如图所示)。1)。据报道，这一高危人群中脑瘤的患病率低至1.6%，因此没有必要进行很大比例的扫描。6,7.

一项针对脑癌分类的血液测试的建议。缺乏特定的症状往往导致脑癌患者在接受诊断之前多次去看他们的全科医生；初级保健中的血液测试可以有效地优先安排病人进行紧急脑成像，从而减少诊断的时间。ATR-FTIR光谱测试符合标准血液分析的要求。

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衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)是一种简单、无标签、无创、无损的分析技术，无需大量的样品制备就能表征样品的生化特征。通过红外(IR)光对生物样品的询问，可以得到特定的生化指纹图谱。因此，ATR-FTIR光谱技术具有很强的诊断潜力。8..询问血液(及其衍生物，血清和血浆)等生物液体，可以提供人体的系统快照。9报告的诊断应用包括疟疾的检测。10、阿尔茨海默氏病11，以及多种癌症，包括：卵巢癌12、结直肠13肺14，和大脑15.

在脑肿瘤人群中，对胶质瘤患者和非癌症患者的血清水平进行了比较。16，在高级别(胶质母细胞瘤)和低级别胶质瘤之间17，在迄今最大的一项研究中，433名患者的样本探索了一系列原发性(胶质瘤、脑膜瘤)和继发性(转移性)脑癌。15..这些研究是在回顾性的生物库血液收集中进行的。诊断输出是由机器学习算法产生的，它了解了癌症所特有的IR特征的差异。这一领域的大部分进展集中在这些需要微调的计算方法上。18,19,20..在回顾性研究的基础上，采用传统的ATR-FTIR光谱仪对脑肿瘤的敏感性和特异性分别为92.8%和91.5%。

通常，ATR-FTIR光谱仪有一个单一的分析点，内反射元件(IRE)是由高折射率的材料(如金刚石、锗或硒化锌)制成的。低折射率的血清样品直接沉积在胎膜表面。21..红外光进入IRE并在内部反射，导致在IR-SAMPLE界面处形成一个消失波。正是这种波在一定的穿透深度(取决于IRE和样品的折射率、红外光束的波长和入射角)询问样品。22.

IRE的主要限制是它们通常是高成本的，从而抑制了具有高吞吐量能力的仪器的生产。这导致了一种不灵活的技术，没有固定的分析点，没有批量处理的能力。工程的红外透明性和相对较低的成本使硅(Si)成为IRES的理想材料。23..在红外研究中，Si IRES通常不受青睐，因为Si晶格振动出现在与生物相关的指纹区，掩盖了1500 cm以下的信息。−1波纹24..这往往是由于较大的晶体，以及多弹跳系统。类似于ATR-FTIR光谱克服了水分吸收的现象，通过减小红外光束通过硅线的路径长度，可以将Si晶格振动的贡献降到最低。25..微制作的Si IRES可以允许单次反射内部反射，有效地减小了红外光束的路径长度，避免了Si不必要的光谱贡献。

详细探讨了在临床中实时应用这一测试所固有的技术考虑，包括样品处理的检查。26、准备17,27,28，并探讨血清沉积模式对光谱响应的影响机制。29..还评估了将试验纳入临床途径的情况。30.

在我们对疑似脑肿瘤患者的建议路径中(图一)。1)由ATR-FTIR光谱分析得出的结果不被用作绝对诊断，而是作为一种分类工具，为gp提供更多的信息，为他们的推荐决策提供信息。31..我们开发的一次性硅线样品幻灯片，允许快速制备和分析多个样品，使高通量ATR-FTIR光谱优化临床研究(图一)。2)。这些东西可以用传统的价格来购买。根据显微镜幻灯片的设计，这些光学样品幻灯片包含有四个样品区的硅线，一个用于背景测量，三个用于单个病人的重复测量。该装置用于对患者样本进行三份一次的测量，并优化了光谱吞吐量和性能。我们描述了这一技术的过渡，建立了应用ATR-FTIR光谱检测脑癌的血清，以及随后对临床翻译的影响。这一技术进步导致了对目标人群的前瞻性临床验证研究，这里提出了中期分析。将这一早期发现脑癌的血液测试转化为临床，既描绘了一项技术步骤，也描述了改善该疾病患者临床途径的一步。

光学样品幻灯片的扩展视图。硅内反射元件(SiIRES)夹在3D打印塑料保持架和医用标签之间。后者定义了硅线的光学活动区，分为四口井，三口用于三份样品分析，一口用于背景测量。全组合幻灯片尺寸为75 mm×25 mm，模拟标准显微镜幻灯片。

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硅线评价

在硅片上成功地制备了V形沟槽阵列.这些阵列定义了硅线的光学活性区，在那里沉积血清，然后用红外光进行分析。硅线的刻蚀表面是面向红外光束的，因此光是通过平行于沟槽方向的硅线耦合而成的(如图所示)。3).

用于临床光谱学的Si IRES的原理图表示。a样本侧，b面向侧面，cV形槽(不缩放)

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该刻蚀工艺精度高，刻蚀效率高，保证了硅IRES的光学特性在误差小于2%的范围内准确。这最大限度地减少了增加光谱可变性的风险，这可能是由于可丢弃的IRE的光学活动区域不一致而引起的。开发了一种内部衍生协议，用于新生产的硅IRES的质量测试，确保背景能谱在一定的接受范围内。

为了探索人血清的分析方法，将Si IRES的光谱输出与传统的ATR-FTIR光谱进行了比较。4)。在这个例子中，分析了人的混合血清，以消除生物变异。从SiIRES得到的光谱在光谱之间的变化更大，表现为在平均光谱周围有较大的标准偏差阴影。这主要是在2700至2000厘米之间可见。−1波纹，虽然在光谱的这一区域很少出现生物峰。指纹区(1800~1000厘米)−1)被认为是生物感兴趣的区域，其变化的边际变化是可见的，但并不比金刚石的光谱明显增加。两个IRES之间的一些光谱特征略有不同；值得注意的是，N-H蛋白带的肩部(3500-3300厘米)。−1)，酰胺I和酰胺Ⅱ峰之间的比值，以及Si晶格振动(1100 Cm)的贡献。−1).

人血清光谱从Si IRATR-FTIR光谱中得到。着色表示从Si(蓝色)和金刚石(红色)IRES得到的十个光谱的标准差。

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回顾性病人队列

对一组724名回顾性患者进行了研究，以评估基于硅线的ATR-FTIR光谱的诊断性能。这个队列包括一系列原发性和继发性脑癌以及对照组(非癌症)患者(表)。1)。多形性胶质母细胞瘤(GBM)是本研究中最大的原发癌组，反映了多形性胶质母细胞瘤的高发病率。在可能的情况下，患者的年龄和性别在这两个疾病组之间是匹配的，同时也考虑到自然疾病的流行率(表)。2)32..这个队列的年龄匹配的子集(n也进行了分析，以确保疾病组之间的任何区别仅与癌症的存在有关(补充表)1和补充图。3).

利用机器学习，可以通过在已知数据集(称为监督学习)上训练模型，然后在盲测试数据集上进行测试，从而从光谱数据中预测疾病状态。本文给出了支持向量机(SVM)分类的预测结果，说明了ATR-FTIR光谱与机器学习相结合的潜在预测能力。癌症和非癌症之间的二元分类主要是为了将建议的使用描述为一种分类工具。对单个患者的九个光谱中的每一个进行预测，并将多数选票作为对该患者(癌症或非癌症)的诊断预测。可以通过观察外部测试集的正确和不正确的预测数来推断分类器的准确性，该测试集包含未用于训练该算法的数据(图1)。5)。以每名病人为基础，平均超过51个随机训练和测试集分裂，对测试集计算的灵敏度和特异性分别为93.2%和92.0%，表明该方法可以有效地检测癌症和控制患者。当考虑这个队列中年龄匹配的子集时，对这两个指标的同样高的敏感性和特异性(89.5%)表明，这种有希望的表现可能与疾病的分化有关，而不是在队列年龄或性别上的差异。该模型的曲线下面积(AUC)，由接收机工作特性(ROC)曲线(补充图)导出。2)的值为0.96，可以认为是优秀的。

ATR-FTIR光谱结合SVM分类预测血清疾病。a每个病人分类的混淆矩阵b混淆球视觉的敏感性和特异性。所有数据都涉及重放和平均测试集预测。

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前瞻性临床验证研究

从回顾性患者数据中获得了有希望的结果，在前瞻性招募的患者队列中评估了该试验在临床环境中的适用性。从他们的脑显像中被推荐来排除脑瘤的病人，以及最近被诊断为新的脑瘤的病人都被招募到了神经外科病房。本研究的结果有两方面：第一，对经过训练的病人算法进行盲目分析；第二，更好地理解来自前瞻性队列的未知病人方差。

在这一过程中，在724个回顾性队列上训练的先前描述的支持向量机算法被用来预测作为前瞻性临床验证研究一部分的104名测试患者的疾病状况。6)，在队列的第一次中期分析中。在整个过程中，在算法结果被报告之前，分析对成像结果是盲目的。报告的敏感性为83.3%，特异性为87.0%，与回顾性患者结果相比，显示出明显的下降。这最初意味着检测癌症患者或非癌症患者的能力下降；然而，敏感性的值超过了已经定义的成本效益阈值。33..特异性也可以这样说，在80%以上的数值表明，当作为二级医疗和初级保健的一种分类工具时，这项测试将为英国和美国的卫生服务节省成本。

应用ATR-FTIR光谱对一组疑似脑癌患者进行疾病预测。采用对回顾性患者队列进行训练的支持向量机算法进行盲分析。a每个病人分类的混淆矩阵b敏感性和特异性的混淆球可视化

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在这个预期的病人队列中，共有12名患者被观察到患有癌症。肿瘤分型包括：4例GBM，3例间变性星形细胞瘤，2例寡核星形细胞瘤，1例髓母细胞瘤，1例室管膜瘤和1例胶质肉瘤。表中很清楚1其中一些肿瘤分类在训练数据集中没有很好的表达，因此可能是不必要的假阴性预测的来源。例如，室管膜瘤病例被错误地识别为非癌症(数据未显示)，在724个病人训练数据集中只发现了这类肿瘤的6例。

在初级保健中对脑癌进行早期诊断的简单测试有可能对病人的生存和生活质量产生重大影响，同时也能在世界各地的卫生服务中节省资源和费用。15..用ATR-FTIR光谱技术分析血清是一项向临床迈进的技术，旨在填补空白，作为一种帮助gp转诊决策的分类工具。33..到目前为止，这项技术一直受到低吞吐率技术的限制，这种技术需要用户的密切关注，潜在地抑制了临床的摄取。通过允许批量处理样品和将商用光谱仪转换为高通量分析器，SiIRES将传统的ATR-FTIR光谱进行了转换。

将SiIRES集成到分光计中是通过专利待决技术简化的；优化设计的Si IRES支架便于操作，一个标引单元引导幻灯片穿过光谱仪的开孔。Si IRES的光谱输出与金刚石等常规IRE材料的光谱输出质量相当，没有表现出来自Si本身的强烈光谱特征。虽然用Si IRES获得的光谱之间的可变性有所增加，但对于背景参考光谱基本上是从单独的IRE获取的方法来说，这是最小的。金刚石和硅IRES之间的差异可以归因于表面下沟槽的不同基线；然而，这可以使用迭代过程建模。

SiIRES在追溯数据集上的分类性能也相当于先前报告的关于钻石的数据。用SiIRES对724例患者进行分析，其敏感性和特异性分别为93.2%和92.8%，而回顾性433例患者的敏感性和特异性分别为92.8%和91.5%。18..在这两个例子中，一个基于支持向量机的分类协议被用来提取原发性和继发性脑癌的信号。虽然病人队列是由不同的病人组成的，因此不能完全比较，但高诊断能力是积极的。该技术灵敏度的提高可能是由于改变了IRE材料，从而改变了消失波的穿透深度，或者是由于病人群体中存在更多的差异。

随着在Si IRES上的诊断性能的确认，回顾性数据集是预测未来患者的基础。通过对这一已知群体进行分类算法的训练，可以根据从数据集中提取癌症信号来预测盲数据。这种方法将模仿血液测试的实际应用，因此是一种正确的诊断准确性的衡量标准。使用ATR-FTIR光谱技术进行的第一项前瞻性研究，是对一项正在进行的前瞻性验证研究的中期分析。

83.3%的灵敏度显示了这项试验的巨大临床潜力，有效地识别了那些迫切需要脑部扫描的病人。从病人的角度来看，由于早期发现和治疗癌症的机会，较高的敏感性对生活质量的影响最大。34..从经济角度来看，具有高度特异性的测试是可取的，因为不必要的脑部扫描数量可以减少；仅在英国，估计每年就有600万至1200万英镑。33..在87.0%的特异性，引入ATR-FTIR光谱分析基础上的血液测试，在初级保健将提供显著的成本节省服务。

值得注意的是，这一初步临床数据提供了对这一血液测试诊断准确性的早期洞察，并附有小病人数量的警告(n =104)限制了灵敏度和特异性的可得值。考虑到可能减少不必要的脑部扫描的数据，在这104名患者中，只有12名患者会被转介到二级治疗。考虑到50%的病人仍将接受家庭医生推荐的健康经济学观点，不管光谱血检结果如何，这仍然会导致脑部扫描次数减少44%。33.

本工作为ATR-FTIR光谱技术在临床上的应用提供了一个新的途径.这一步骤向高通量分析有意义的红外光谱领域以及临床环境。应用此技术对血清进行分析将最适合临床路径作为脑癌的一种分类工具。为了有效地治疗这种疾病，必须及早发现肿瘤-目前的诊断途径尚不能满足这种需要。初级保健中可用的分类工具将为全科医生提供更多信息，为他们的转诊决定提供信息；为有风险的病人提供二级护理成像服务，同时也为那些没有风险的病人提供保证。因此，脑癌患者的诊断时间可以减少，同时也能为医疗服务带来成本效益。

为了深入了解这一问题，我们将指导读者查阅有关ATR-FTIR光谱仪器和理论的关键文献。8,22,35.

硅线生产

Si IRES自行设计，在2.5~25m的中红外波段进行光谱采集优化，根据最佳的光通量、光谱质量和重现性选择了SiIRES的尺寸。采用传统的各向异性湿法刻蚀方法，在红外表面刻蚀了一系列v-沟槽，分别进行了光掩模设计、硬掩模沉积、光刻胶的应用和硬掩模刻蚀。刻蚀后，硅晶片被切成单个四孔硅IRES.这些硅IRES被放置在塑料胎圈持有人，开发和3D打印内部，并与粘合的顶层，这也定义了沉积区域的样品表面(图一)。2)。一旦组装，这就构成了光学样本幻灯片。

建造了一个自定义的平移台，将光学样品幻灯片与商业上可用的FTIR光谱仪连接起来。这些阶段可以自动化，以进一步提高吞吐量，减少所需的人力资源。

回顾性病人队列

为了比较Si IRES与传统IRES的光谱诊断能力，对照组和癌症患者进行了大队列回顾性研究。样本来自三个来源：沃尔顿中心NHS信托基金(利物浦)、皇家普雷斯顿医院(Preston)以及商业组织解决方案有限公司(英国格拉斯哥)。本研究获得伦理认可(Walton Research Bank BTNW/WRTB 13_01/BTNW申请#1108)，并在收集血清前获得所有患者的知情同意。癌症患者的纳入标准如下：(1)经病理证实的原发性或继发性脑癌患者，(2)组织取样时未进行化疗或放射治疗。对于对照组患者，纳入标准规定，该人不应有癌症史，或正在接受任何治疗。本研究共纳入724例患者。在S-Monovette(德国Sarstedt)收集管中采集血样，并允许凝块长达1小时，然后以2200×离心机离心。g室温下持续15分钟。随后取血清在−80°C冷冻，直到分析时为止。

前瞻性临床研究

为了比较血液检测的诊断准确性，包括硬件和软件，在爱丁堡西部总医院建立了一项前瞻性验证研究，并得到当地伦理认可(2017/0320/SR 938，15/ES/0094)。所有患者在采集血清前均获得知情同意。洛提安地区的病人如果被GP怀疑患有脑瘤，则有资格直接通过当地的开放式CT(OACT)服务进行脑成像。这是最有代表性的目标病人队列，我们的分流血液测试。全科医生进入OACT途径的标准仅仅是他们对病人症状的评估需要紧急脑成像；需要紧急成像的病人被转介到急诊科，或者确实通过中风转诊途径。因此，这些病人代表了一组病人，GP已经选择了转诊脑成像。通过脑成像的OACT路径转介的患者，只要能够给予知情同意，就有资格参加这一验证研究。接受神经外科检查的脑肿瘤新诊断患者也有资格被纳入。用我们的策略对血样的分析是对病人是否有脑瘤的模糊看法。样本处理协议与前面提到的回顾性患者队列的协议是一致的。

这项研究是为了有一个适应性的设计，以确保最佳人数的病人被招募，以便能够评估测试的敏感性和特异性。对于初始样本量估计(80%的功率，5%的显着性水平)，5%以内的特异性估计需要200到600个样本，假设2%的患病率(或98%没有脑瘤)的假设特异性在95%的范围内(n=188)至75%(n=622)。就敏感性而言，在30%以内显示90%的敏感性需要400人(3%的患病率)或600人(2%的患病率)；在我们先前的研究中，注意的特异性为91%。在整个研究过程中，计划通过定期的中期样本分析对样本大小进行校准，这里提出的队列是第一个从较大的研究中得到分析的病人组。由于成像病人中实际脑肿瘤的患病率为1-3%，我们期望能比敏感性(真阳性和假阴性)更快地产生特异性证据(真阴性和假阳性)。通过将预测的诊断与金标准(脑成像和必要时的活检)相关联，对血液测试的总体特异性进行了评估。这一临时分析是在设计的适应性因素范围内进行的，目的是评估在全面研究中需要多少额外的样本来估计特异性。补充图1显示验证研究和补充表的配偶流程图。2显示患者的人口学数据，无论是接受者还是拒绝参与这项研究，以强调无偏见的接近病人招募。

样品制备

血清样品在室温(18-25°C)下解冻至少15 min。血清被沉积在光学样品幻灯片的三个样品井上，确保背景井保持空。准备好的幻灯片放置在干燥装置(Thermo Fisher Heratherm，GE)中，在35°C下加热1h，为控制血清液滴的干燥动力学提供均匀的热量和气流。29.

光谱采集

光学样品幻灯片既是样品衬底，又是红外光谱的通用通道，易于与商用光谱仪接口。在本研究中，一种与光学样品幻灯片相结合的镜面反射附件取代了传统的IRES。目的是建立“滑动标引装置”-一种连接直线电机的简单滑车-允许在光谱仪孔径上精确地移动，在井间标引光学样品幻灯片。这个自动化单元最终可以提供高吞吐量的分析，这不需要技术人员的持续关注。在此情况下，我们使用SiIRES的最佳光谱仪参数收集光谱，其定义为4cm。−1分辨率(1厘米)−1(数据间隔)和16加扫描。

光谱分析

数据处理是这项技术的基础，也是知识产权和临床使用硅IRES技术的关键部分。总之，光谱分析可以分为光谱预处理和光谱分类；前者降低数据集中不必要的方差，后者执行疾病预测步骤。

在预处理方面，将基线校正、标准化和数据缩减结合起来，可以显示重要的生物信息，在这种情况下，疾病状况，并提高分类性能。20..采用反复迭代的方法确定了最优的预处理方案，并适用于硅线分析。

在光谱分类方面，将机器学习技术应用于光谱数据集。这种方法的目的是从已知的病人队列中识别出癌症信号，建立经过训练的分类模型，然后根据实际应用情况，利用这些信息预测未知人群中癌症的存在。在这种情况下，回顾性患者队列将形成“培训”数据集，而潜在患者队列将形成外部“测试”数据集。在这项研究中，我们提出了利用支持向量机学习来提取癌症的光谱模式。支持向量机是一种受监督的技术，它通过高维空间中投影的数据构造一个超平面，允许对光谱和病人数据进行分类。36.

为了训练分类模型，将患者随机分为训练组(70%)和试验组(30%)。没有一个病人可以出现在这两个部分。算法参数通过网格搜索来最大限度地利用每个光谱计算出的Kappa，在训练集上进行5倍的交叉验证。然后使用调谐模型对外部测试集中的光谱进行预测。每个病人产生的九个光谱中的每一个都被独立地分析，并在报告的诊断结果(癌症或非癌症)的光谱中进行了一致表决。对整个过程进行了51次迭代，获得了足够的归纳法统计样本。在结果部分中报告的性能指标，如灵敏度和特异性，是根据对外部测试集的正确和不正确的预测数得出的。

然后，为了预测预期的患者队列，迭代机器学习算法再次被训练在724个回顾性患者队列的训练部分，使用测试集进行内部验证，然后应用于一个盲外部测试集；在这种情况下，是预期的患者队列。每个病人的诊断结果报告为所有预测的一致表决。