PMEPA1同种型胶质母细胞瘤的驱动发展促进激酶LATS1 Hippo的蛋白质降解途径

摘要

Hippo信号通路控制器官发展,也称,在癌症、肿瘤抑制作用。在Hippo的途径,我们在这里展示,在人类神经胶质瘤,跨膜蛋白的功能交互,跨膜蛋白,前列腺癌雄激素诱导1 (PMEPA1)和大型肿瘤抑制激酶1 (LATS1)。我们在主要显示PMEPA1调节人类的神经胶质瘤。 PMEPA1a PMEPA1对碘氧基苯甲醚主要表达在神经胶质瘤标本和细胞系,和异位表达的蛋白质体外促进神经胶质瘤生长和入侵和原位裸鼠异种移植模型。在co-immunoprecipitation实验中,与Hippo肿瘤抑制激酶LATS1 PMEPA1a相关。这种相互作用导致的蛋白酶体降解LATS1通过招聘的泛素连接酶、神经前体细胞表达,发育表达下调4 (NEDD4),导致沉默河马的信号。丙氨酸替代在PMEPA1a PY图案LATS1退化导致失败。针对Hippo下游组件的信号通路,狂吠,shRNA,干扰的增长促进活动PMEPA1a体外和体内。总之,提出工作表明PMEPA1a导致神经胶质瘤发展失调的Hippo信号通路,从而代表了一种有前途的神经胶质瘤的治疗目标。

介绍

Hippo信号通路的失调代表一个公共事件在许多癌症包括神经胶质瘤(1,2,3.,4]。近年来,大型肿瘤抑制激酶1/2 (LATS1/2)和核心组件的Hippo信号在人类癌症中引起相当大的关注。一旦刺激上游监管机构,LATS1/2磷酸化狂吠,导致其胞质保留和失活; 否则,YAP把原子核和下游proproliferative和凋亡基因的转录激活(5,6]。 LATS1已被确定为一个肿瘤抑制,减少表达LATS1一直与神经胶质瘤患者的不良预后相关(7].

在先前的研究中,我们表明,LATS1在星形细胞瘤由于启动子甲基化表达下调,这恢复表达诱导细胞凋亡在神经胶质瘤细胞8]。最近的研究表明,关键部件的河马信号可以由泛素化。一系列的E3泛素连接酶被发现调节这些蛋白质的几个,包括LATS1 [9,10,11],LATS2 [12,13],AMOT [13,14],YAP /小胡子[15,16]。 E3泛素连接酶神经前体细胞表达,发育表达下调4 (NEDD4),在蛋白质识别一个特定的主题,PY主题,导致LATS1/2[泛素化11,13]。我们最近的工作也为Hippo-YAP照亮一个关键的角色在人类神经胶质瘤的发展,可能涉及监管的蛋白酶体降解[17].

前列腺跨膜蛋白(TM)、雄激素诱导1 (PMEPA1),也称为TM前列腺androgen-induced RNA,据报道引起睾酮或其衍生品,已被证明有一个角色在肿瘤发生[18,19]。额外的研究表明,表皮生长因子,改变增长factor-β(TGF-β)和突变型p53也促进转录PMEPA1[20.,21,22]。 PMEPA1是一种Ib TM蛋白质包含两个PY主题与HECT-type E3泛素连接酶,如NEDD4 [19]。先前的研究表明,PMEPA1高度表达的许多实体瘤类型,如乳房(23)、前列腺癌(18)、肺(24)和卵巢癌20.),但这很难检测白血病和淋巴瘤(25]。大量的研究表明,PMEPA1诱发的几个关键蛋白质降解癌症的发展,如雄激素受体(26],TGF-βI型受体(24),Smad 2/3的蛋白质(27],c-Maf [28]。因此,PMEPA1可能作为肿瘤抑制基因或一个致癌基因。

基于这一先验知识,我们的目的是解开人类神经胶质瘤PMEPA1函数的潜在机制进展。在这项研究中,我们表明,PMEPA1蛋白过表达在人类神经胶质瘤组织和细胞系主要相对于非肿瘤引起的脑组织样品和正常的人类星形胶质细胞(NHA),在神经胶质瘤PMEPA1a是主要的同种型样品和细胞系。蛋白质显示增长促进活动在体外和体内,和被发现直接与组件交互的肿瘤抑制河马信号通路。结果确定PMEPA1a的角色失调的河马信号作为一个公认的分子靶向治疗人类恶性胶质瘤(本研究)。

结果

人类神经胶质瘤PMEPA1蛋白过表达

我们发现PMEPA1蛋白质含量增加优质神经胶质瘤(iii iv;n= 40)相对于正常的大脑组织(n= 6)和低级别胶质瘤(II;n= 20; 无花果。1 a, b)。免疫印迹的溶解产物准备于原发性肿瘤(n= 16; 谁的成绩II-IV)和非肿瘤引起的脑组织样品(n= 4)也证实PMEPA1超表达在人类神经胶质瘤(无花果。1 c),但无显著相关性IDH1的地位。高表达(包含IHC得分> 2)在4 20低级别胶质瘤(II; 20%),24 40优质神经胶质瘤(iii iv; 60%),因此与增加肿瘤成绩显著相关(补充表S1,P= 0.0034)。 PMEPA1蛋白质含量也增加神经胶质瘤细胞系相对于NHA文化,除了U87MG的情况下,PMEPA1几乎检测不到(NHA; 无花果。1 d)。

PMEPA1a是神经胶质瘤组织和细胞系中高度表达的比其他或者拼接PMEPA1亚型

四个或者拼接亚型的存在PMEPA1基因(亚型PMEPA1a-d)和膜结合蛋白(亚型PMEPA1a, b, d)已被证明具有致癌功能在前列腺癌细胞和实体肿瘤,而胞质蛋白(同种型c)对癌症恶化[没有影响27,29]。因此,我们评估的表达水平PMEPA1亚型在我们的神经胶质瘤细胞系,用PCR引物具体PMEPA1a,PMEPA1b,PMEPA1c,PMEPA1d记录。PMEPA1a是最高度表达同种型,相对表达水平> 5×高于其他亚型在U251, A172, GBM # P3细胞。在U87MG细胞PMEPA1d同种型是比其他人更高度表示虽然整体相对水平仍很低(图。1 e)。我们也评估水平的表达PMEPA1在一群主神经胶质瘤和非肿瘤的亚型大脑组织样本。的相对水平PMEPA1a肿瘤样本(n= 9)高于正常脑组织(n= 3; 无花果。1 f)。PMEPA1a因此可能的同种型神经胶质瘤发展中最重要的角色。

PMEPA1a促进神经胶质瘤细胞生长、迁移和入侵在体外和体内

我们首先检查我们构造的效率PMEPA1a成分和异位表达不同的亚型。我们使用两个shrna目标PMEPA1a,都导致了~ 4×减少蛋白质和mRNA水平评估由西方印迹和A172和U251的存在。构造对同种型PMEPA1a U87MG细胞高效表达(补充图。S1A,B)。

增长显著减少A172 U251-sh-PMEPA1a细胞,但在U87MG-PMEPA1a增强细胞(图2)。集落形成试验的结果证实(无花果。2 b; 补充图。S2A); 殖民地的数量降低了50% ~ A172 U251-sh-PMEPA1a细胞,但在U87MG-PMEPA1a细胞增加~ 30%。最后,迁移和入侵减少A172 U251-sh-PMEPA1a细胞,但在U87MG-PMEPA1a增强(~ 30%; 无花果。2摄氏度和补充图。开通)。

修改细胞也orthotopically裸体小鼠的大脑植入体内评估增长。他染色显示U251-sh-PMEPA1a异种移植比控制,限制而U87MG-PMEPA1a细胞入侵(无花果。二维)。免疫组织化学染色的部分还强调了在异种移植生长特性的差异。 Ki67扩散的标志,与PMEPA1a表达水平呈正相关,而LATS1 PMEPA1a呈负相关(补充图。S2C,D)。最后,整体提高了动物的生存PEMPA1a击倒(中位数生存、34和49天,U251-NC U251-sh-PMEPA1a,分别P< 0.01; 无花果。2 e),但减少肿瘤轴承动物U87MG-PMEPA1a集团(中位数生存、30和25天,U87MG-NC U87MG-PMEPA1a,分别P< 0.01; 无花果。2 e)。在一起,这些结果表明,PMEPA1a提升神经胶质瘤体内发展。

LATS1 PMEPA1a-interacting蛋白质

描绘路径(s)参与PMEPA1a响应,我们执行co-immunoprecipitation (Co-IP)化验确定合作伙伴的蛋白质在人类神经胶质瘤。 U87MG细胞转染与Flag-tagged PMEPA1a或控制向量(Flag-empty-vector)和Co-IP化验之后进行蛋白质组学分析孤立PMEPA1a-associated蛋白复合物(补充图。S3A,B)。质谱显示已知PMEPA1a-interacting蛋白质,如NEDD4,但也有一些新颖的蛋白质。根据TCGA数据库、MYH9 DHX9, DDB1, HMGB1不显示不同的表达水平与非肿瘤的“绿带运动”样本(数据未显示),而VDAC1已报告在GBM细胞代谢中发挥作用和MTA2表达水平与神经胶质瘤细胞增殖和入侵30.,31]。 LATS1,有趣的是,河马通路的重要组成部分,也是一个相互作用的蛋白质。根据我们先前的研究中,河马信号通路是至关重要的维持恶性神经胶质瘤细胞的行为和值得进一步调查17]。因此,我们选择LATS1激酶作为我们主要的机械学习。

验证之间的交互PMEPA1a LATS1激酶,我们同时表示Flag-tagged PMEPA1a和Myc-tagged LATS1在HEK293细胞中。在这些细胞中,我们可以确定一个互动Flag-PMEPA1a Myc-LATS1, Co-IP国旗或执行的Myc抗体(图。3)。我们也证实了内源复合物的存在包含PMEPA1和LATS1 U251 U87MG细胞(无花果。3 b, c)。复合物了PMEPA1或LATS1抗体同时含有蛋白质。

映射绑定地区LATS1 PMEPA1a,缺失突变体LATS1和PMEPA1a构建和表达的细胞。结果表明,氨基酸100 - 165绑定LATS1 PMEPA1a是必要的,而氨基酸351 - 700 LATS1构成PMEPA1a-interacting域(图。3 d, e)。

PMEPA1a调节河马激酶信号通路

LATS1是河马的肿瘤抑制信号通路,使其失去活性致癌转录监管机构通过磷酸化YAP ser - 127 (1,15]。失去LATS1 YAP活动会导致相应的增加。免疫印迹分析显示LATS1 U87MG-PMEPA1a细胞中的蛋白质含量的下降。相比之下,A172 LATS1增加-和U251-sh-PMEPA1a细胞(无花果。4)。因此,PMEPA1a抑制LATS1蛋白质在神经胶质瘤细胞的内源性PMEPA1a表达式。

此外,改变PMEPA1a也导致检测YAP及其活动的变化。核本地化YAP在U87MG-PMEPA1a增强细胞和减少A172 U251-sh-PMEPA1a细胞(无花果。4 b, c)。这些结果符合一个激活的通过增加PMEPA1a狂吠。事实上,分析转录活动的YAP支持这一假说。我们演示了YAP活动增加的PMEPA1a通过YAP启动子荧光素酶记者构造和下游YAP内源性基因的存在(无花果。4 d-f)。这些数据表明PMEPA1a增加YAP活动减少LATS1蛋白质水平。

LATS1 PMEPA1a促进蛋白酶体降解

改变的表达PMEPA1a对mRNA水平没有明显的影响LATS1(无花果。4 e, f)。因此,我们测试了是否PMEPA1a调节LATS1蛋白质的稳定性。我们首先检查LATS1蛋白质含量在转基因细胞系与蛋白酶体抑制剂MG132治疗。我们发现MG132 LATS1蛋白质的差别部分扭转了对这些U87MG HEK293-PMEPA1a细胞(无花果。5)。此外,LATS1蛋白的半衰期是这些细胞改变。存在的蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX),我们发现LATS1的半衰期是减少U87MG HEK293-PMEPA1a细胞(无花果。5b, c, f, g)。相比之下,LATS1蛋白的半衰期延长在A172 U251-sh-PMEPA1a细胞(无花果。5d、e、h、i)。因此,PMEPA1a促进proteasome-mediated LATS1退化。

水平的LATS1泛素化也符合提高蛋白酶体降解。 LATS1 HEK293-Flag-PMEPA1a细胞表达HA-Ub,泛素化是增加(图。5 j)。此外,内生LATS1泛素化是通过PMEPA1a监管。在U251-sh-PMEPA1a细胞,polyubiquitination LATS1减少,而在U87MG-PMEPA1a细胞,LATS1 polyubiquitination的增加(图。5 k, l)。综上所述,PMEPA1a起着至关重要的作用在调节LATS1由蛋白酶体降解的蛋白质含量。

PMEPA1a撼动LATS1通过E3连接酶NEDD4

先前的研究已经表明,PMEPA1介导蛋白质降解通过其天然蛋白质伙伴,NEDD4 [26,28]。作为小说LATS1最近被确定为衬底NEDD4 [11,13),因此,我们执行Co-IPs来确定这三个蛋白之间的关系。水平提高的HEK293细胞转染Flag-PMEPA1a,和Co-IPs进行溶菌产物与anti-NEDD4抗体。在这种情况下,LATS1包裹着NEDD4增加(图6)。 Co-IPs也从U251-sh-PMEPA1a和U87MG-PMEPA1a细胞溶解产物准备执行。在缺乏PMEPA1a U251-sh-PMEPA1a, LATS1包裹着的数量NEDD4下降(无花果。6 b)。然而,增加表达PMEPA1a U87MG细胞,与NEDD4 LATS1包裹的数量增加(图。6摄氏度)。因此,增加或减少的水平PMEPA1a产生一个相应的增加或减少的数量与NEDD4 LATS1复杂。

进一步确认PMEPA1a调节通过NEDD4-mediated LATS1蛋白酶体降解的程度,PMEPA1a突变(太; Y161/232A)展品几乎检测不到绑定NEDD4,转染到U87MG HEK293细胞(补充图。S4A)。在免疫印迹,LATS1水平不降低PMEPA1a MT(图的存在。6 d)尽管这变异保留LATS1-binding能力(补充图。S5A,B)。泛素化的LATS1也不会增加转染PMEPA1a MT(图的存在。6 e)。另外,击倒的NEDD4小干扰RNA (si-NEDD-2; 补充图。S6A- - - - - -C)产生相似的结果; 野生型PMEPA1a未能导致LATS1蛋白质水平降低(图。6 d)或增加polyubiquitination(无花果。6 e)。两个构造PMEPA1a突变体,PMEPA1a-Y161/232A PMEPA1aΔ100 - 165 aa,有效地表达了在U87MG细胞(补充图。S7A)。细胞生长在U87MG-PMEPA1a细胞显著增强,但在U87MG-PMEPA1a-Y161/232A保持不变或pmepa1aΔ100 - 165 aa电池与NC组(补充图。S7B)。结果证实在集落形成试验和transwell化验(补充图。S7C,D)。 luciferase-expressing修改U87MG细胞orthotopically裸体小鼠的大脑植入体内评估增长。体内生物发光显示异位表达的PMEPA1a U87MG细胞导致增加体内细胞生长和减少肿瘤轴承小鼠的存活时间(~ 25和30天,PMEPA1a与数控P< 0.05),而PMEPA1a-Y161/232A或pmepa1aΔ100 - 165 aa对细胞生长没有影响,和总生存期保持不变在这两个组与NC组(33 - 30和30天,PMEPA1a-Y161/232A或pmepa1aΔ100 - 165 aa与数控,P= n。补充图。S7E- - - - - -G)。

进一步验证这一机制,LATS1突变(LATS1太; Y376/559A)对NEDD4-mediated蛋白酶体降解,转染到HEK293细胞连同PMEPA1a(补充图。S4B)。我们发现,尽管LATS1太仍能够与PMEPA1a(补充图。S5A,B),LATS1太蛋白质含量保持不变(无花果。6 f)。异位表达PMEPA1a也没有增加polyubiquitination LATS1 MT,这进一步证实了与NEDD4的交互(图的缺失。6克)。

这些结果表明PMEPA1a之间的交互和NEDD4 LATS1调控至关重要。此外,在LATS1 PMEPA1a蛋白质的影响可以通过删除NEDD4废除。

河马通路介导PMEPA1a信号

检查是否河马通路下游PMEPA1a,我们使用shrna操纵LATS1和YAP水平和表达结构U251-sh-PMEPA1a或U87MG-PMEPA1a细胞(补充图。S8A)在生长曲线和评估特征,集落形成试验,迁移化验。的表达式构造YAP包含一个既定的蛋白质的活性形式由于突变抑制LATS1/2磷酸化网站(15]。增长抑制U251-sh-PMEPA1a细胞相对于控件,但击倒LATS1或超表达YAP (YAP-5SA)增强这些细胞生长和迁移(补充无花果。S8B- - - - - -D;S9A,B)。然而,在U87MG-PMEPA1a细胞,慢病毒表达LATS1或成分针对YAP减少细胞生长和迁移(补充无花果。S8B- - - - - -D;S9A,B)。

在皮下肿瘤模型中,PMEPA1a的致癌效应对神经胶质瘤生长也证明是由河马信号/狂吠。 U251-sh-PMEPA1a细胞的肿瘤生长增加击倒LATS1或超表达YAP(补充无花果。S8E;S9C,D)。相反,肿瘤生长U87MG-PMEPA1a细胞减少了超表达的肿瘤抑制LATS1或击倒YAP(补充无花果。S8E;S9C,D)。总的来说,这些数据表明,Hippo-LATS1-YAP轴可能发挥功能性作用PMEPA1a-induced人类神经胶质瘤的发展。

不朽的GBM细胞系实验数据并不完全模拟肿瘤异质性GBM患者中观察到。因此,我们进行更多的实验使用# P3 GBM细胞,更忠实地保留遗传特性的匹配主要“绿带运动”(32]。在Co-IPs PMEPA1还发现与LATS1(无花果。7一个)。在西方的墨迹,LATS1 GBM # P3-sh-PMEPA1a细胞中蛋白质含量增加以及磷酸化YAP(无花果。7 b)。击倒的PMEPA1a GBM # P3细胞也导致降低体外细胞生长(图。7 c)和体内(无花果。7 d, e),延长肿瘤轴承小鼠的存活时间(~ 28日与34天,控制与PMEPA1a击倒; 无花果。7 f)。

最后,在人类神经胶质瘤样本,主要包含IHC得分PMEPA1 LATS1分数负相关(P <与CYR61得分(0.01)和呈正相关P <0.05),表明蛋白质之间可能的关系,而PMEPA1之间没有显著相关性被发现和p-YAP (Ser127)(图。7 g h)。这些结果与我们的协议提出PMEPA1a的机制,这可能下调的蛋白质含量LATS1然后发挥致癌作用在人类神经胶质瘤。

讨论

这里,我们确定的功能角色PMEPA1a同种型神经胶质瘤级数和的途径协调其活动。我们的数据表明,PMEPA1a同种型人类神经胶质瘤中高度表达,和超表达的蛋白质增强神经胶质瘤细胞株体外生长特性和体内。 PMEPA1a促进LATS1通过招募的E3泛素化和降解连接酶NEDD4,导致抑制河马信号和激活的增长促进基因狂吠。 PMEPA1a因此有一个公认的致癌作用,人类的神经胶质瘤。

先前的研究已经揭示了不同角色的PMEPA1在各种癌症18,19,20.,21,22,23,24,25]。在我们的研究中,我们获得和执行功能丧失体外和体内实验证明PMEPA1在神经胶质瘤进展具有致癌作用。我们发现PMEPA1a干扰河马信号通过直接与LATS1交互,使协会NEDD4和随后的蛋白酶体介导的降解。 LATS1蛋白质并没有显示当PY图案被降解PMEPA1a NEDD4突变或没有。这些结果证实了以前的研究报告LATS1未能与NEDD4突变在PY图案,因此,减少蛋白酶体降解[11]。我们发现PMEPA1a也未能调节LATS1突变在PY图案。这一发现与之前的研究一致,PY-mutated或PY-deleted PMEPA1失去能力促进c-Maf退化(28]。这些结果符合形成PMEPA1a / NEDD4 LATS1复杂,导致polyubiquitination最后LATS1退化。

然而,如何PMEPA1同种型神经胶质瘤中有一个重要的致癌功能还不清楚。可能的解释可能是基于两个关键因素。首先,跨膜(TM)域为PEMPA1活动是至关重要的(27,28),其次,NEDD4被磷酸化激活在质膜或其他因素(14,33]。根据我们的数据,我们提出以下模型(无花果。8)。膜结合PMEPA1具有氨基端区域,类似于同种型c,但也是一个TM域,新兵NEDD4等离子体膜内部的一面,它可以更容易地激活。激活NEDD4诱发LATS1泛素化和退化。我们还发现,氨基酸100 - 165 PMEPA1a含有最接近TM PY主题域,并可能负责PMEPA1a和LATS1之间的交互。我们建议膜结合PMEPA1附近形成一个复杂的和NEDD4 LATS1内在的质膜,在激活NEDD4与LATS1相互作用,导致polyubiquitination最后LATS1退化。但是需要进一步调查证实这一假说。

许多研究已经证明,河马信号,这通常是和灭活在许多癌症特异表达,是肿瘤恶化的关键34,35]。最近的报道显示一组E3泛素连接酶,破坏河马通路的关键成员,照亮另一个类的蛋白质与潜在驱动肿瘤发生[9,10,11,12,13,14,15,16]。最近,我们报道,actin-like 6促进YAP /小胡子蛋白质稳定性与beta-TrCP通过防止互动,从而导致经济增长促进基因的转录激活潜在的神经胶质瘤进展(17]。在这项研究中,我们发现PMEPA1a调节LATS1蛋白质通过促进其与NEDD4互动,E3泛素连接酶,蛋白酶体降解,导致核积累和激活狂吠。此外,在PMEPA1a击倒的实验中,增长促进活动的跨膜蛋白可以通过操纵部分恢复下游组件的河马通路,表明河马通路可能调解PMEPA1a的致癌功能发展的人类神经胶质瘤。

总之,我们的研究表明,膜结合PMEPA1,尤其是PMEPA1a,在神经胶质瘤进展具有致癌作用。与NEDD4 PMEPA1a LATS1促进协会,这导致polyubiquitination和蛋白酶体降解。超表达PMEPA1a有效地导致河马通路的失调。最后,本研究确定了PMEPA1a作为公认的分子靶向治疗策略的人类神经胶质瘤的治疗。

材料和方法

道德声明

实验和人体组织的使用都是山东大学的研究伦理委员会批准(山东、中国)。人类脑部肿瘤和非肿瘤的组织样本取自接受手术的齐鲁医院神经外科(山东、中国)。知情同意书是获得所有的病人。正常脑组织脑外伤病人获得部分脑切除。动物研究都是通过和的指导下执行机构的动物保健和使用委员会(IACUC)山东大学。

细胞培养和转染

HEK293细胞和人类神经胶质瘤细胞系,LN18 U87MG, U251, A172从文化的集合获得中国科学院(中国上海)。 NHA和初级胶质母细胞瘤(GBM) # P3卑尔根大学的细胞获得挪威。补充表中列出所使用的质粒S2。使用的shrna序列和siRNAs补充表中列出S3。

核能和cytoplasmatic分馏

核和胞质提取试剂(热费希尔科学信号。沃尔瑟姆,美国马)被用来获得核和胞质细胞小分支根据制造商的指示。蛋白质的亚细胞分布,包括狂吠,用免疫印迹分析测定。 GAPDH和组蛋白H3担任加载控制胞质及核蛋白质分数。看到更多的细节补充方法和材料。实验进行了一式三份。

免疫组织化学、免疫荧光和免疫印迹

免疫组织化学(包含IHC)、免疫荧光和免疫印迹进行如前所述[36]。图片是使用蔡司LSM780共焦显微镜(卡尔蔡司显微镜GmbH,耶拿,德国)。 IHC-stained样本由两个盲病理学家进行了综述和评价。分数在0 - 4由如下决定:0,没有染色; 1、弱染色在< 50%的细胞; 2、弱染色细胞在≥50%; 3、强染色在< 50%的细胞; 4、强染色细胞在≥50%。免疫印迹实验进行了一式三份。

Co-immunoprecipitation (Co-IP)

细胞细胞溶解在缓冲区里帕(皮尔斯; 美国罗克福德,IL)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ)。总蛋白(200µg; 1µg /µL)孵化与初级抗体(4µL)或免疫球蛋白(4µL)一夜之间在4°C温柔颤抖,然后蛋白质A / G磁珠(热费希尔科学)在室温下2 h。免疫沉淀反应复合物被洗净,煮的蛋白质加载缓冲区,和免疫印迹或进行质谱分析(ekspertTMnanoLC; AB Sciex TripleTOF 5600多; SCIEX; 雷德伍德城、钙、美国)。质/无国界医生的结果分析了使用ProteinpilotTM软件(SCIEX)。泛素化分析,细胞治疗20µM MG132 6 h消散之前,和随后的co-IP和免疫印迹分析。

环己酰亚胺(CHX)追逐

LATS1和PMEPA1a表达质粒cotransfected在HEK293细胞使用Lipofectamine 3000(热费希尔科学)。 U87MG细胞慢病毒感染全身的异位表达PMEPA1a(OBiO技术)。 48小时后,CHX(25µg /毫升)被加入到培养基抑制翻译,和细胞培养0、2、4或6 h。细胞溶解产物都准备好了,和蛋白质(20µg)是利用免疫印迹分析检查。实验进行了一式三份。

细胞迁移和入侵检测

细胞迁移和入侵检测进行了如前所述[17]。 Matrigel-coated(美国BD生物科学,贝德福德,MA)和裸transwell钱伯斯(孔隙尺寸:8μm; 美国纽约康宁合演)被用来评估细胞入侵和相应的迁移。实验进行了一式三份。

细胞生存能力分析

如前所述(执行细胞生存能力分析37]。转染48 h后,细胞被播种到96孔板(5×103.细胞/)和孵化一夜之间在37°C。与CCK-8孵化后的解决方案(10μL /; Dojindo; 熊本、日本),吸光度在450海里(OD450)测量标(Bio-Rad; 赫拉克勒斯、钙、美国),结果绘制与时间天产生增长曲线。实验进行了一式三份。

集落形成实验

转染后细胞(1.0×103./)被播种到six-well盘子和培养一个额外的2周。细胞被固定为4%多聚甲醛(Solarbio; 中国北京)和沾5%结晶紫。殖民地的50多个细胞数。实验进行了一式三份。

逆转录聚合酶链反应

从细胞或人类组织总RNA分离使用试剂盒试剂(热费希尔科学)。反转录成RNA(2µg) cDNA使用高效逆转录工具包(Toyobo生命科学; 中国上海)根据制造商的协议。定量PCR进行使用SYBR预混料Taq交货(豆类; 日本东京)实时PCR检测系统(罗氏,480 ii; 瑞士巴塞尔)。 GAPDH担任内部控制规范化。补充表中列出了用于PCR引物S4。实验进行了一式三份。

荧光素酶报告分析

修改U87MG和U251细胞cotransfected萤火虫荧光素酶(100 ng)和renilla记者(100 ng)使用Lipofectamine 3000(热费希尔科学)。荧光素酶检测进行24 h后使用Dual-Luciferase记者分析工具包(Promega)。 Renilla活动规范化使用荧光素酶记者活动。实验进行了一式三份。

动物研究

稳定转染神经胶质瘤细胞群(1×106细胞)植入还是裸体小鼠的额叶(上海SLAC实验动物有限公司; 中国上海)使用立体框架(KDS310 KD科学; 美国马Holliston)。

Luciferase-expressing GBM # P3和U87MG细胞植入orthotopically裸体小鼠的大脑,并使用生物荧光肿瘤生长是检查(新谱,PerkinElmer; 美国马数据)。皮下GBM模型建立了如前所述[17].

统计分析

数据意味着±SEM。学生的t以及为成对的数据被用来比较平均值。方差分析是用来分析潜在的连续变量采用两组之间的差异。 kaplan meier生存曲线估计的方法,而使用生存率较。之间的相关性PMEPA1和LATS1,p-YAP (Ser127),或CYR61使用双尾表达水平确定χ2测试或确切概率法。统计分析是使用GraphPad Prism 7.00版本软件进行程序窗口(GraphPad; 美国拉霍亚,CA)。所有测试都是双面的,P值< 0.05被认为是具有统计学意义。

PMEPA1同种型胶质母细胞瘤的驱动发展促进激酶LATS1的蛋白质降解

摘要

介绍

结果