摘要
Upregulation细胞因子和趋化因子是经常发现在多发性骨髓瘤(MM)。 CCL3(也称为MIP-1α)是一种促炎症趋化因子水平的MM微环境与溶骨的病变和肿瘤负担。 CCL3和其受体CCR1 CCR5,有助于骨骼疾病的发展MM通过支持肿瘤生长和调节破骨细胞分化(OC)。 在这项研究中,我们确定了抑制成骨细胞(OB)函数作为额外的致病机制CCL3-induced骨病。 MM-derived外生CCL3压制矿化和骨钙蛋白生产的主要人类骨髓基质细胞和HS27A细胞。 我们的研究结果表明,CCL3影响奥林匹克广播服务公司是由ERK激活成骨的转录因子的差别和随后对这些osterix。 CCR1抑制ERK磷酸化和恢复osterix和减少骨钙蛋白表达在CCL3面前。 最后,用一种小分子CCR1抑制剂治疗SCID-hu老鼠建议。差别upregulation骨钙素的表达与OC对这些 我们的结果表明,CCL3,除了已知的异化的活动,减少骨形成通过抑制OB函数,因此有助于OB / OC解偶联毫米。
介绍
超过40%的多发性骨髓瘤(MM)患者骨骼并发症,危及他们的生活质量和经验极大地增加死亡的风险。1治疗预防骨病可能因此导致长期生存。 然而,有效的治疗方法需要识别潜在的致病事件。 在MM,研究骨活检确定了双骨破坏机制,由破骨细胞(OC) upregulation和抑制成骨细胞(OB)活动。2
OC激活MM一直得到广泛的研究和CCL3有至关重要的作用。 CCL3或MIP-1α旧的命名,是一个属于CC趋化因子的促炎细胞因子亚科。 CCL3调节OC分化绑定到g蛋白耦合的受体,CCR1 CCR5,激活ERK和一种蛋白激酶信号通路。 在肿瘤,恶性浆细胞和口服避孕药的主要来源是CCL3促进MM细胞迁移和生存,连同osteoclastogenesis的刺激。3.,4重要的是,临床级小分子CCR1拮抗剂,MLN3897,抑制CCL3-induced osteoclastogenesis和OC MM细胞的支持。5
OB障碍是经常发现在毫米,但潜在的机制尚未完全阐明。 奥林匹克广播服务公司表达CCL3受体和类似于其他炎性细胞因子,如肿瘤坏死factor-α和调整,CCL3也可能抑制OB在毫米。6,7,8然而,没有研究解决直接影响CCL3 osteoblastogenesis。
在这项研究中,我们首次描述CCL3除了已知的骨吸收作用,可以减少骨形成通过抑制OB函数。 我们的数据表明,CCL3损害矩阵矿化和抑制骨钙素(OCN)的生产。 特别是,CCL3上调ERK活性和会使成骨的转录因子osterix。 重要的是,通过MLN3897块CCR1抑制ERK磷酸化和恢复,至少部分,OCN表达式在体外和在活的有机体内。 这些数据表明,促炎症趋化因子CCL3可能导致OB / MM骨病的OC解偶联特征,促使对CCL3针对性的发展策略。
材料和方法
试剂
CCL3(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国)是用于50 ng / ml的浓度(除非另有说明),根据制造商的指示。 中和抗体对CCL3(研发系统)使用5μg /毫升的浓度。 PD098059(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国),特定的增殖作用的激活ERK激酶抑制剂(MEK) 1/2,在乙醇和储存在重组−20 30μC和使用的浓度米。 MLN3897,一个口服有效,小人类CCR1 molecule-specific拮抗剂,请提供的千禧制药(美国Cambridge, MA)。5 在活的有机体内方法获得的稳定的药物含量每天两次口服填喂法2毫克/公斤80年0.5%甲基纤维素和0.2%渐变MLN3897稀释。 达成的血浆浓度峰值的进度管理与50 n米随后,使用的在体外研究。
毫米和BMSC细胞
MM细胞系
Dexamethasone-sensitive (MM.1S)和耐药细胞系(MM.1R)人类毫米是请提供的史蒂文·罗森博士(美国西北大学、芝加哥、IL)。9INA-6人类细胞系IL-6-dependent毫米雷博士提供的汉堡10(基尔基尔大学、德国)和培养的2.5 ng / ml il - 6(研发系统)。 RPMI细胞系得到来自美国文化类型集合(写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国)。 在媒体RPMI 1640毫米细胞系都培养(σ化学,圣路易斯,密苏里州,美国)含10%胎牛血清,2 mM L谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升(美国纽约Gibco,大岛)。
伴着
我们生成人类bmsc MM患者通过将骨髓单核细胞在75毫米2培养瓶RPMI 1640媒体(σ化学)含20%胎牛血清,2 mM L谷氨酰胺、100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升(Gibco)。 一旦汇合的,细胞使胰蛋白酶化和通道。 只有细胞之间的第二和第四段。 我们也使用了BMSC细胞系HS27A, RPMI 1640年从写明ATCC和培养获得10%的媒体。
OB分化
我们培养BMSC或HS27A细胞(5000 /)的osteoblastogenic媒体如前所述。11
患者样本
我们研究骨髓(BM)患者血浆从22毫米CCL3和OCN表达的ELISA诊断。 所有病人提供书面知情同意/赫尔辛基宣言,机构审查委员会批准了的马萨诸塞州综合医院癌症中心(美国波士顿)。
ELISA
CCL3和骨桥蛋白(OPN)表达分析了ELISA检测从研发系统和购买OCN水平评估使用N-MID骨钙素酶联免疫试剂盒(Immunodiagnostic系统公司、泉山、阿兹,美国)。 上层清液的MM细胞系和成熟的观察,去籽10%胎牛血清RPMI 1640或20%胎牛血清α-MEM,分别为48或72 h是化验。 测量都是在重复执行。
流式细胞术
评估的表面受体表达,细胞悬浮在杜尔贝科的磷酸盐和孵化30分钟在4°C主要抗体anti-CCR1和anti-CCR5 (phycoerythrin-conjugated、研发系统)。 数据获得使用CellQuest软件BD流式细胞仪石中剑(美国BD生物科学,圣何塞,CA)和分析与FlowJo软件(版本8.2,树明星,Inc .)、亚什兰,或者,美国)。 结果表示为褶皱的变化意味着同形像控制相比,荧光强度。
实时定量聚合酶链反应
分析了基因表达定量pcr对RNA提取奥林匹克广播服务公司如前所述。11引物对ALPL(碱性磷酸酶),COL1A1(1型胶原蛋白α1),IBSP(骨涎蛋白),Bglap1(骨钙素),ATF4,RUNX2, SP7(osterix)获得SuperArray(美国马里兰州弗雷德里克)。 β-转录水平正常化肌动蛋白。
免疫荧光和免疫组织化学
OCN蛋白表达进行免疫荧光和免疫组织化学孵化后的样品在一夜之间接触的主要抗体克隆OC4-30 (Abcam、剑桥、马、美国)。 免疫荧光进行OB差异化文化幻灯片(BD生物科学,加州)2周的存在与否CCL3,媒体每周更换2次。 细胞被固定,沾染了初级抗体和二级anti-rabbit Alexa萤石488共轭抗体。 用DAPI复染色进行(46-diamidino-2-phenyl吲哚)。 免疫组织化学进行石蜡包埋部分从人类胎儿的骨骼。 抗原检索由孵化与蛋白酶K(罗氏,印第安纳波利斯,美国)。 孵化后的主要抗体,探讨了幻灯片与生物素化的二次抗体(施用)和信号检测与Streptavidin-horseradish过氧化物酶系统提供的TSA工具包(美国珀金埃尔默生命科学,MA),根据制造商的指导方针。 应用领域被确定一个阈值估计的基础上,两个积极控制图像,阈值是用来分析所有免疫组织化学图像。12然后纠正每骨小梁面积的值。
西方墨点法
HS-27A分化为两周成骨的媒体与CCL3没有刺激或存在MLN3897或PD098059和细胞溶解裂解缓冲(如前所述)。5样品接受了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移到聚乙二烯二氟化物膜,并与活跃的抗体,免疫印迹的兵,pAKT, pP38, pβcateninβcatenin(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)。 抗原抗体复合物被增强化学发光检测(美国Amersham,阿灵顿高地,IL)。 膜被剥夺和reprobed anti-actin抗体,以确保平等蛋白质加载。
在活的有机体内小鼠模型
所有动物研究机构批准的根据协议进行动物保健和使用委员会达纳法伯癌症研究所(美国波士顿)。 SCID-hu鼠标模型生成的如前所述。13我们六个小鼠口服MLN3897连续6天每天两次(2毫克/公斤/周)和五个小鼠4周的工具。 肿瘤细胞生长与每周监控ELISA人类可溶性白介素受体(sHuIL6R)(研发系统)在血液血清。 在3周的治疗,三个老鼠死亡(两个治疗和一个对照组)由于增加胎儿骨移植物大小。 作为我们的主要终点是骨头分析,其余八个老鼠死于治疗结束(周4)和骨移植收获。 72 - h后固定在4% paraphormaldehyde,骨头在20% EDTA脱钙3周和paraffin-embebbed。 截面的骨头在不同层次上进行,所有骨骼分析骨区域,肿瘤侵犯,OC和OB号码。 骨小梁面积和肿瘤组织总面积的比例量化在H&E-stained幻灯片使用尼康Eclipse 80我显微镜和图像分析软件。14OCs陷阱染色后发现苏木精复染色,表示为每毫米2骨小梁。 奥林匹克广播服务公司都指望H&E-stained部分bone-lining细胞,主动观察和骨细胞每毫米2骨小梁。
统计分析
每次实验一式四份执行和结果被表示为均值±s。 d至少三个不同的实验。 统计比较连续变量是由学生的双尾t以及。 OCN和BM CCL3水平之间的联系从MM患者血浆被皮尔森相关分析的评估。
结果
MM-derived主要造骨细胞和hs27a基质细胞系表达CCL3和其受体CCR1和CCR5
我们首先计算配体和受体表达水平在毫米patient-derived观察不同的成熟阶段。在体外骨生成包含三个主要时期的区别:(i)间充质干细胞增殖OB分化的第一个星期期间,我们定义为不成熟的观察,(ii)细胞外基质成熟分化的第二周期间,我们定义为成熟的观察,和(3)最终成矿的第三周。15所示图1一个CCL3检测到的平均水平在72 - h文化上层清液的成熟MM-derived观察范围1 - 231 pg / ml(平均103.63 pg / ml)。 CCL3生产低8到10倍与毫米细胞系(801.2 pg / ml±407.7)代表CCL3在肿瘤领域的主要来源。5,16评估的潜在影响CCL3 OB发展和功能,我们评估了受体表达水平由RNA和蛋白质含量。 成熟的OB表达高水平的CCR1和CCR5信使rna与不成熟的OB (2.5±1.75 vs 1.52±0.8成倍增加,补充图S1)。 同样,评估通过流式细胞术建议成骨分化调节受体2.1±0.81,1.7±0.38在MFI成倍增加,分别与同形像控制在14天(图1 b)。7我们也为CCL3通路在人工基质细胞系,人类BMSC HS-27A那概括主要的特点。 HS-27A细胞显示pre-OB特性,17,18在成骨的媒体面前,区分ALP-positive细胞采集矿物在表而不是结节(补充图S2)。 CCL3分泌调节和OB分化,类似于patient-derived观察,平均CCL3生产成熟HS27A-OB是112±48 pg / ml (图1 c)。 我们还观察到CCR1和CCR5表达HS27A细胞增加成骨分化(1.82±1.28,1.64±0.96折MFI与同形像控制相比,增加图1 d)。
分化成骨细胞分泌CCL3和表达它的受体。 (一个在72 - h) ELISA检测CCL3文化上层清液从几个骨髓瘤(MM)细胞系和patient-derived OB。(b)(上半部分)褶皱增加CCR1 OB分化期间和表面CCR5表达评估通过流式细胞术。 (下图)代表流仪分析受体表达在OB每天7和14的分化与同形像控制。 (c)从文化上层清液HS-27A CCL3表达水平细胞在OB分化和(d)表达CCR1和CCR5表面通过流式细胞仪检测到。
CCL3抑制OB成矿活动
已知的CCL3 upregulation毫米利基16受体的表达,观察促使我们OB发展和活动来评估其影响。 使用patient-derived细胞,我们观察到CCL3 (50 ng / ml)并不影响蛋白质碱性磷酸酶(ALP)活性,OB分化的标志(图2一个)。 相反,基质矿化明显受损OB文化中不断暴露于CCL3,如图所示降低了50%,钙沉积与未经处理的突发交换(图2 b,P= 0.01)。 这些数据表明,CCL3优先损害OB函数而不是OB MM-derived BMSC的分化。 同样,把成熟的受体阳性HS27A-OB 1周的CCL3浓度增加抑制矿化基底控制水平(图2 c),这表明接触CCL3抑制矿化和后期OCN表达连续治疗。 所示图1一个,MM细胞株产生大量的CCL3。 确认这个趋化因子的相关性在MM-induced OB障碍,我们暴露成熟HS27A-OB MM细胞培养上清液中和CCL3抗体的存在与否。 受损成矿中观察到的MM上层清液治疗逆转了中和抗体对CCL3 (图2 d),这表明CCL3可能调解MM OB活动的抑制作用。
CCL3抑制OB矿化。 (一个)碱性磷酸酶活性的比值相对可行的细胞的数量(API)在分化观察2周有或没有CCL3 50 ng / ml。 (b)(上半部分)代表茜素红染色检测矿化的形象从OB暴露CCL3 3周。 (下图)量化的钙沉积在OB分化有或没有CCL3 50 ng / ml为3周。 (c)茜素红的评估HS27A-derived成熟OB治疗1周和CCL3从10到100 ng / ml。 (d)量化的矿化通过茜素红HS27A-derived成熟OB暴露INA6 MM.1S细胞上清液对CCL3 1周有或没有中和抗体(*P< 0.05)。
通过ERK和osterix调制CCL3会使骨钙素的表达
OB函数是一个复杂的过程,主要包括矩阵的形成和矿化,并要求的共同表达特异性蛋白质。 OCN尤其最丰富non-collagen蛋白在骨基质和刺激骨矿物质通过刺激磷灰石晶体的生长成熟。19,20.CCL3治疗表达下调RNA和蛋白质含量OCN 40 - 23%,分别为(图3一,P< 0.05)。 相反,胶原蛋白类型我α,高山和骨涎蛋白基因表达,以及骨桥蛋白蛋白质含量没有影响接触CCL3 (补充图S3)。 CCL3 BM等离子体水平增加毫米广泛的骨疾病患者。21值得注意的是,我们观察到在溶解病变患者(n= 14)边缘显著,BM等离子CCL3和OCN表达之间的负相关(补充图S4,r=−0.53;P= 0.05)。
通过ERK和osterix调制CCL3会使骨钙素的表达。 (一个)骨钙素(OCN)表达在成熟MM-derived奥林匹克广播服务公司,有或没有CCL3 (50 ng / ml),通过检测(左面板)定量PCR分析,(中间面板)ELISA文化上层清液和(右面板)immunofluorescent检测OB文化(OCN沾满Alexa氟488年与DAPI复染色)。 (b)免疫印迹检测活跃、pAKT pP38, ERK1/2 HS27A-derived OB暴露CCL3 50 ng / ml为指定的时间点。 (c免疫印迹检测活跃和ERK1/2 HS27A-derived OB接触CCL3存在剂量依赖的相关性。 平均光密度分析以上三个实验。 (d)Osterix OB PCR基因表达的定量评估暴露于CCL3时间和剂量的增加。 (e)RUNX2和ATF4奥林匹克广播服务公司的基因表达评价成熟CCL3 (4 h, 50 ng / ml) (*P< 0.05,* *P< 0.01)。
CCL3 / CCR交互激活几个下游效应器,包括MAPK和一种蛋白激酶信号通路。4免疫印迹分析这些感受器被用来确定他们的贡献对OB CCL3抑制性影响函数。 我们观察到早期upregulation HS27A-OBs phospho-ERK的成熟,与P38和AKT在之后的时间点信号激活(图3 b)。 没有观察到βcatenin和phospho-βcatenin的变化(补充图S5A)。 在时间和接触CCL3存在剂量依赖的相关性,我们指出增加phospho-ERK表达早在30′CCL3和从10 ng / ml。 四健会治疗后整体一个双重的upregulation CCL3 50 ng / ml的观察(P< 0.01,图3 c)。 重要的是,未分化HS27A没有显示任何ERK途径激活CCL3治疗,提供进一步的证据,CCL3目标主要是成熟的OB (补充图S5B)。 ERK信号通路的下游一连串的转录因子OB功能已被确认的关键。 成骨细胞的转录因子的基因表达分析CCL3-treated HS27A-OBs显示时间和剂量依赖性,差别osterix对这些有一个双重的减少4 - h治疗后50 ng / ml的CCL3 (P= 0.01,图3 d)。 相反,接触CCL3没有显著改变RUNX2的表达水平或ATF4 (图3 e)。
CCR1抑制至少部分逆转CCL3效果在体外和在活的有机体内
提供额外的证据的抑制性影响CCL3 / CCR1通路OB函数,我们阻止了人类CCR1 CCR1使用小分子拮抗剂,MLN3897,以前anti-OC效应研究。5预处理的HS27A-OB CCR1抑制剂在50 n米抑制CCL3-induced ERK激活(图4一)。 此外,osterix转录抑制由CCL3至少部分地恢复了预处理CCR1抑制剂(图4 b)。 同样,预处理的HS27A-OB MEK1抑制剂,PD098059(西格玛奥德里奇)获救的差别osterix基因对这些CCL3(从0.29±0.27,1.72±1.5 PD098059-treated细胞)(图4 c)。 最后,OCN表达式的存在增加了MLN3897 CCL3(从0.39±0.19,3.4±2.6的MLN3897) (图4 d)。 这些数据表明,调制的ERK信号通路CCL3抑制OB OCN的差别通过osterix抑制函数,对这些基因的表达。 这些影响CCR1至少部分负责; 然而,等受体CCR5的作用不应该被排除在外。
CCR1介导至少部分CCL3抑制性的影响观察。 (一个免疫印迹检测活跃和ERK信号HS27A-derived OB CCL3处理存在的小分子CCR1抑制剂(50 n米)。 (b)Osterix基因表达定量PCR OB治疗4 h和CCL3有或没有CCR1抑制剂(50 n米)(左面板)或MEK1抑制剂,PD098059(30μ米1 h预处理)(右面板)。 (c)骨钙素基因表达的定量PCR与CCL3 OB治疗24小时有或没有CCR1抑制剂(50 n米)(*P< 0.05)。
然后我们调查的影响CCR1抑制肿瘤负荷和骨骼结构已设置使用一个人性化的MM骨疾病的模型。 共有11个小鼠皮下植入人类胎儿骨芯片和注射INA6MM细胞处理MLN3897或车辆。 串行量化分析肿瘤负荷治疗期间的sHuIL6R显示延迟治疗组肿瘤生长(图5一个左面板)。 没有观察到减肥或其他毒性。 重要的是,肿瘤浸润的骨骼标本从40.6%下降控制治疗小鼠的26%确认减少MM负担(图5一个右面板)。 治疗CCR1抑制剂诱导骨小梁面积每增加两个组织区(15.9±5.59 vs 27±14.9) (图5 b)和一个1.5折OC /骨小梁数量减少面积较对照组(46.2±26 /毫米2vs 29±12 /毫米2)(图5 c),确认我们之前在体外发现在osteoclastogenesis CCR1的重要作用。5然后我们评估的影响CCR1抑制肿瘤的OB室环境的评估OB数量和通过检测骨小梁OCN的活动。 没有差异的OB /小梁骨面积观察(575±94.4 /毫米2在对照组vs 506±62.1 /毫米2治疗组)(图5 d左面板)。 然而,OCN-positive地区每骨小梁面积的比值增加MLN3897-treated动物(0.26±0.28 vs 0.53±0.34) (图5 d、中、右面板)。 这些结果表明,CCR1抑制可能影响OB活动间接地通过OC抑制。 此外,基于我们的在体外数据CCR1抑制CCL3信号也通过障碍直接影响观察。 未来的研究将确定这些影响更大的样本量。
在活的有机体内CCR1抑制小鼠模型在一个毫米。 (一个)(左面板)每周评估肿瘤负荷通过人类可溶性白介素受体(shuIL6R)治疗期间的水平。 值表示为成倍增加。 (右面板)肿瘤入侵也是评估和组织面积的百分数表示。 (b)(左面板)代表的形象)染色MM-injected骨芯片的控制和治疗老鼠。 (右面板)骨面积数,表示为组织总面积的百分比。 (c)(左面板)代表图像的免疫细胞化学MM-injected陷阱活动从控制和治疗小鼠骨片。 (右面板)陷阱+细胞的数量每骨面积计算。 (d)(左面板)OB每骨面积数量评估控制和治疗骨骼。 (中间面板)代表图像的免疫组织化学检测OCN MM-injected骨芯片。 (右面板)的百分比OCN-positive区/骨区进行了分析。
讨论
理解肿瘤性骨环境内的细胞间的相互作用是至关重要的小说的发展代理,同时针对骨髓瘤细胞和扭转骨病。 促炎症趋化因子CCL3有至关重要的作用在肿瘤发展和破坏骨通过OC刺激体内平衡。 在这项研究中,我们首次证明CCL3可能导致OB / OC解偶联不仅通过促进OC的活动,而且还通过抑制OB活动。 我们调查了CCR / CCL3通路突发发现外生和tumor-derived CCL3抑制OB矿化和OCN表达式。 我们的数据表明,ERK信号的调制和调解CCL3 osterix表达效果,和CCR1抑制反向至少部分这些影响。
受体对BMSC已确定CCL3和OB表面,虽然表达水平根据细胞类型和不同物种。7,22,23在这项研究中,我们观察到upregulation CCR1和CCR5在从主细胞和骨生成人类基质细胞系,HS27A。 对成熟的细胞受体表达观察可能占优先抑制OB函数而不是分化; 解释不同的影响高山早期OB基因,OCN通常由成熟细胞。 值得注意的是,特定CCR1抑制只是部分逆转CCL3效果,而对CCL3完全恢复OB活动中和抗体,表明CCR5可能也有一个关键的角色在调停CCL3对突发交换的影响。 目标受体抑制将用于解决这个问题在未来的研究。
抑制骨活检的OB是一个频繁发现MM患者和与肿瘤负担。2MM细胞块OB分化通过contact-mediated RUNX2抑制,24肿瘤细胞分泌βcatenin DKK1等对手25和肿瘤导致生产BMSC的OB抑制剂,如苯丙酸诺龙。11观察与其他炎性细胞因子如调整和肿瘤坏死factor-α,我们观察到tumor-derived CCL3会使OB矿化活动,至少部分,通过OCN抑制。8,26
骨髓瘤广泛的骨疾病患者血清高水平的CCL3 (ref。21)另外,高表达的细胞因子水平已确定在浆细胞肿瘤,27关联与骨质溶解的程度。 有趣的是,我们观察到CCL3和OCN水平之间的负相关患者高溶骨的负担。 尽管增加了肿瘤负荷和OC活动通过OB抑制OCN水平下降,这些数据也反映了一个直接的负面CCL3 OCN监管。 因此,CCL3贡献溶骨的病变的发展依赖于对OC和OB双重影响。此外,我们的在体外和在活的有机体内数据表明,CCL3通路抑制恢复OB函数,因此对CCL3靶向治疗可能受益的扭转OB / OC解偶联的典型毫米。
MAPK信号通路是一种重要的调制器OB分化:共同激活和抑制ERK, p38和物调节几个成骨的转录因子的表达。28特别是,ERK通路产生相反的影响观察根据分化阶段。 持续抑制ERK信号促进OB发展,而在晚期分化抑制骨生成的激活。28,29,30.,31我们的数据表明,暴露的分化观察CCL3激活ERK信号,进而会使osterix表达式,与肿瘤坏死factor-α如前所观察到的。26有趣的是,一个由pro-inflammmatory OB抑制细胞因子的机制是sclerostin upregulation,8的作用在调节CCL3对奥林匹克广播服务公司将在将来的研究中评估的影响。 CCL3主要视为pro-osteoclastogenic细胞因子,促进骨骼疾病的发病机理中的异化的活动。 CCL3的结果确定小说的影响,作为抑制剂OB函数和一个中介的OB / OC解偶联毫米。因此,我们进一步证明重要的致病作用CCL3及其受体在毫米和需要在即将到来的评估目标这条通路的抑制剂的临床试验。