血管生成抑制剂是目前抗肿瘤治疗的重要组成部分。然而，肿瘤最初对抗血管生成药物或血管靶向药物有反应，可能产生耐药性.临床疗效有限的原因可能是肿瘤的异质性，或者是肿瘤血管细胞的独特表型，与所谓的“正常”内皮细胞有着广泛的差异。因此，明确导致这种多样性的分子机制可能为设计更有效地避免耐药性的组合疗法提供一个合理的基础。在此，我们证明从乳腺癌和肾癌中分离出的肿瘤源性内皮细胞(TECs)保留了内皮表型，但与生长因子无关。应用小干扰rna方法，我们证明白细胞介素(IL)-3，而不是由tecs释放的血管内皮生长因子，支持它们的自分泌生长，并促进其生长。体内血管形成与肿瘤血管生成。同时，我们发现膜结合试剂盒配体(MbKitL)的表达依赖于IL-3，对内皮祖细胞(EPCs)和炎症细胞与TECs的粘附至关重要。这些事件需要Akt激活。最后，MBKitL的缺失阻止了EPC和炎症细胞向血管微环境的迁移，这表明，与骨髓一样，mbKitL可以作为c-Kit表达细胞的膜/粘附分子。这些数据表明，IL-3自分泌环可以驱动肿瘤内皮细胞的开关，靶向IL-3可能具有明显的抑制肿瘤血管生成的治疗优势。

要使肿瘤发展成高度恶性和致命的表型，它必须吸收和维持自己的血液供应，这一过程被称为肿瘤血管生成(肿瘤血管生成)。Folkman，2007年)。肿瘤血管根据肿瘤细胞增殖的需要提供营养和氧气，充当肿瘤细胞逃逸进入循环的守护者，有利于肿瘤的转移。Folkman，2007年; Shchors和Evan，2007年; Kerbel，2008年)。事实上，与正常内皮细胞(NECS)相比，肿瘤源性内皮细胞(TECs)在形态上具有独特的表型。Baluk等人，2003年)。此外，有证据表明，在分子和功能水平上存在差异。与正常静止内皮细胞中的NECs不同，TECs具有较快的转换率，因此被称为“激活”。TECs的“激活”表型(Folkman，2007年)与胚胎基因的表达有关。St Croix等人，2000年)以及调控血管生长的基因，包括白细胞介素-3基因(Bussolati等人，2003年)。炎性细胞因子IL-3释放入肿瘤微环境Dentelli等人，2004年)，除了促进成熟内皮细胞的存活和增殖(Dentelli等人，1999年)，也是造血源性内皮祖细胞(EPC)的内皮分化因子。Zeoli等人，2008年)。事实上，肿瘤新血管被广泛认为有两种不同的癌外起源.第一种是通过一种叫做“血管生成”的过程产生的，它起源于肿瘤附近已有血管的新生毛细血管的萌发。第二种称为“血管生成”，起源于骨髓来源的造血/内皮祖细胞进入肿瘤床，随后分化为内皮细胞。Tonini等人，2003年; Folkman，2007年; Veraillie，2008年).

造血和内皮细胞以及EPC表达c-Kit受体，c-Kit配体(KitL)Flanagan等人，1991年)。KitL表达为膜结合(MbKitl)和可溶性(SKitl)形式(Huang等人，1992年; Matsuda等人，1993年)。在骨髓中，基质细胞表达的mbKitL作为造血细胞的膜结合粘附/生存促进分子。Flanagan等人，1991年)。造血细胞在肿瘤的发生发展中具有复合功能。de Palma和Naldini，2006年; Takakura，2006年)。尤其是髓系细胞通常被称为炎症细胞，大量浸润人类肿瘤(Takakura，2006年)。虽然这些细胞可以破坏肿瘤，但有一些证据表明，它们也可以通过促进肿瘤相关血管的发育来促进肿瘤的发生。Mantovani等人，2008年)。尤其是造血细胞移入肿瘤时，造血细胞位于新生血管周围，肿瘤形成增强。这些发现表明造血细胞的再生可能在肿瘤血管生成发生之前发生，并决定肿瘤血管生成的发生。Lin等人，2006年)。目前人们普遍认为，炎症细胞和EPC向肿瘤微环境的迁移依赖于TECs的粘附分子的本构表达。Ribati等人，2007年)。与炎症部位一样，粘附和信号事件的协调顺序，包括选择素介导的滚动、趋化因子激活白细胞、整合素介导的牢固粘附和剥离等，控制着这一过程(Vajkoczy等人，2003年; Bian酮等人，2004年)。研究表明，与典型的粘附分子/新生分子一起，内皮细胞增殖所表达的mbKitL有助于c-Kit阳性细胞向新生血管生成位点的转运。Dentelli等人，2007年)。因此，c-Kit配体的剪接变异体也可能成为肿瘤中c-Kit表达细胞的粘附/招募分子。

由于其在肿瘤生长中的重要作用，肿瘤血管被认为是潜在的抗肿瘤药物靶点。因此，在本研究中，我们试图剖析肿瘤内皮细胞转换的分子机制，以便为干预肿瘤血管生长提供合理的依据。

Tec表征与功能行为

TECS在表面标记方面与它们的正常对应物有很大的不同。Baluk等人，2003年; van Beijing num等人，2009年)。因此，用CD 105阳性免疫磁分选法从肾透明细胞癌和乳腺癌中分离出TECs。Bussolati等人，2003年; Grange等人，2006年)，首先进行内皮细胞表面标记物的细胞荧光分析。如报告中所述图1a结果发现，肾组织内皮细胞(RTECs)表达CD 105、CD 146(Muc-18)、血管性假血友病因子(Von Willebrand Factor)、血管内皮生长因子R2/FLK-1、Ti-2受体和CD 31等内皮细胞标志物。相反，rTECs与NECS不同，不表达CD 34祖细胞标记物和VEGFR 1/Flt-1血管生成细胞标记物(图1a)。在乳腺源性TECs(MTECs)中检测到类似的表面表达谱(数据未显示)。正如大量文献所述，在没有增长因素的情况下，技术经济共同体的更替率也与正常水平不同(Bussolati等人，2003年; Grange等人，2006年)。事实上，在不同时间间隔(24、48和72h)，在低血清浓度(2%)下监测RTEC和mTEC的生长，S期细胞增多(图1b，上面的面板可以被检测到，这增加了增殖率(图1b，下面板)维持了几个通道(12通道，数据未显示)。此外，我们发现rTECs和mTECs的运动活动不需要趋化刺激(图1c).

技术合作小组的特征和离体功能行为(a)对NECS和rTECs进行细胞荧光分析。以免疫前免疫球蛋白G(IgG)Ab为阴性对照。(bNECS、rTECs或mTECs在不同时间间隔(24、48、72或96h)进行荧光活化细胞分选(FACS)分析(上面板)和直接细胞计数(下面板)。数据以百分比±S.D表示。各细胞周期(上)或细胞数±S.D。每个字段的单元格数(下)。(c)细胞迁移试验在Boyden氏室进行，如材料和方法部分所述。未处理的NECS，或在迁移试验中用IL-3(20 ng/ml)处理的NECS作为对照(*)。P<0.05, NECs+IL-3, rTECs and mTECs versus NECs). All data reported are representative of three independent experiments performed in triplicate.

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IL-3对于tc的扩张至关重要。离体和体内

为探讨调节促血管生成能力的分子机制，研究了促血管生成因子的自分泌。与TEC基因表达谱数据一致(Bussolati等人，2003年) (图2a(左面板)我们证明rTECs和mTECs都能合成IL-3，而不能合成VEGF。通过westernblot分析证实了IL-3的释放。图2a、右板)和酶联免疫吸附试验(补充图S1a)从rTECs和mTECs中恢复的条件培养基。此外，westernblot和荧光活化的细胞分类分析表明，rTECs或mTECs都表达了IL-3受体β-公共亚基(IL-3βc)。图2b)，维持自分泌环支持其内在促血管生成行为的可能性。因此，对小干扰RNA(SiRNA)技术下的rTECs和mTECs进行了功能研究。如报告中所述图2crTECs和mTECs都内源性地耗尽了IL-3(补充图S2A)，表现为运动性活动受损，未能增殖(图2c和补充图S1B)。rTECs和mTECs经特异性IL-3中和抗体(Ab)处理后，得到了相似的结果。图2c和补充图S1B)。来验证这些结果离体和体内进行血管生成试验。报告的数据补充图S3和图3a，表明缺乏IL-3的tecs无法形成管状结构。离体 (补充图S3)或者把它们组织起来-自我组织成血管结构体内 (图3a)，进一步支持IL-3在控制这些过程中发挥的关键作用。

由tecs释放的IL-3离体技术合作委员会的扩散和迁移。(a用定量实时定量(QRT)-PCR(左面板)法检测NECS、rTECs或mTECs中IL-3和VEGF的表达.以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为归一化的IL-3或VEGF的折叠表达，是三份独立实验的代表。分别以Gibbon MLA细胞株和IL-3处理的NECS为阳性对照(+)，分别检测IL-3和VEGF mRNA的表达(*)。P<0.05, rTECs and mTECs versus NECs). The release of IL-3 was also analyzed by western blot on 40 × concentrated TEC-culture medium (right panel). Human recombinant IL-3 (hrIL-3, 2 ng/ml) was used as positive control. (b用westernblot或细胞荧光分析法检测IL-3受体β-公共亚单位(IL-3Rβc)在NECS、rTECs或mTECs上的表达。Westernblot分析用抗IL-3Rβc-Ab免疫沉淀细胞提取物(IP)，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。(c)用rTECs或mTECs进行细胞增殖(上板)和细胞迁移(下板)试验，分别用特定的IL-3中和抗体(40μg/ml)或内源性灭活IL-3(siRNA-IL-3)(*)进行细胞增殖和迁移试验。P<0.05, anti-IL-3 Ab-treated or IL-3-depleted rTECs and mTECs versus basal rTECs and mTECs). Cell-cycle data are reported as the percentage±s.d. of cells in each cell-cycle phase. All data reported are representative of three independent experiments performed in triplicate.

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IL-3是TEC促血管生成能力的关键.(a) 体内将rTECs或mTECs加入Matrigel基质，皮下注射(S.C)于SCID小鼠侧进行血管生成实验。在所示的IL-3或Akt耗竭的TECs中使用.进行组织学(上板)和免疫荧光(下板)分析。用人CD 31荧光染色(绿色)(较低)评价血管密度。采用DAPI核标记(蓝色)。本研究只考虑血管内含有红血球的未闭腔。直方图表示百分比±S.D。船只面积与整个Matrigel区域之比。鳞片显示100μm用于组织学(×10放大)，50μm用于免疫荧光(×20放大)数据(*)P<0.05, IL-3- and Akt-depleted rTECs and mTECs versus basal rTECs and mTECs). (brTECs或mTECs经抗IL-3中和抗体处理或内源灭活IL-3的细胞提取物，采用westernblot方法检测p-Akt、Akt和β-actin的含量。(c细胞周期进展采用荧光活化细胞分选(FACS)方法，分析rTECs或mTECs对Akt沉默或用Akt抑制剂Ly294002处理。细胞周期数据以百分比±S.D表示。每个细胞周期阶段的细胞。所有报告的数据代表三个独立的实验，一式三份。

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据报道，AKT对TEC的生存至关重要(Bussolati等人，2006年)。因此，经特殊的IL-3中和抗体处理或内源性灭活IL-3的TECs(补充图S2A)进行Akt活化分析。如图所示图3b在这两种实验条件下，我们都未能检测到Akt的激活。此外，TECs耗尽Akt的调查结果(补充图S2B)或接受LY 294002处理未能进入细胞周期并增殖(图3c和补充图S4A)表明Akt作为IL-3阻断，可以恢复静止的表型。事实上，由于Akt耗竭，tecs未能迁移并形成船只。体内 (图3a和补充图S4B).

mbKitl的表达受IL-3的控制，参与了epc和炎症细胞的贩运。

IL-3是一种促炎细胞因子，促进内皮细胞的增殖、迁移和功能激活。Brizzi等人，1993年; Dentelli等人，1999年)。因此，首次评价了IL-3诱导TECs粘附分子表达的能力.通过应用siRNA技术或中和抗体，我们证明了tecs释放的IL-3对细胞间粘附分子-1、E-选择素和mbKitL的表达至关重要。图4a)。此外，在Akt阻断或耗尽后，发现细胞间粘附分子-1、E-选择素和mbKitL的表达减少。补充图S4C)证实了Akt在控制IL-3介导的生物事件中的重要作用.就像在骨髓壁龛里一样Flanagan等人，1991年)在新生血管的部位，mbKitL对内皮细胞的增殖起着粘附分子的作用。Dentelli等人，2007年)。为探讨TECs对mbKitL的构成性表达是否也能调节炎症细胞和EPC向血管生成部位的转运，在不同的实验条件下进行了粘附实验。报告的结果图4b显示表达c-Kit的炎症细胞和EPC(图4c)粘附在技术经济体系上，防止粘着(图4b)当对IL-3或mbKitL的TECs进行沉默时(补充图S2B)。此外，根据Akt在介导细胞粘附中的作用Dentelli等人，2007年)，我们发现Akt对于EPC和炎症细胞与TECs的粘附也是至关重要的。图4b)。为了验证mbKitL在调节EPC和炎症细胞归巢进入血管生成活性部位方面的贡献，体内进行了实验。为此，rTECs被添加到Matrigel中和抗体的存在或不存在，并植入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下。7天后，恢复Matrigel插头并分析其是否存在炎症细胞。TEC植入后5天，经尾静脉注射EPCs，2天后恢复Matrigel插头并进行分析。如图所示图5，TECs形成功能血管，EPCs(约占CD 31阳性细胞总数的5%)可以发光结合到新生血管中。此外，在含有抗-mbKitlAb(图5)无论是发光插入的EPCs数量和位于新形成的血管周围的CD 68+细胞的数量都减少了，表明TECs表达的mbKitL可能是EPCs和炎症细胞的归巢信号。mTECs也得到了类似的结果(数据未报告)。最后，我们发现mbKitL的功能失活也会影响血管的形成。图5).

IL-3介导的mbKitL表达是EPC和炎症细胞粘附的关键.(a对NECS、rTECs或mTECs进行定量实时(QRT)PCR检测E-选择素、ICAM-1或mbKitL的表达.标记的粘附分子的折叠表达，归一化为甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，代表了三个独立的实验，一式三份(*)。P<0.05, NECs-IL-3 anti-IL-3 Ab-treated or IL-3-depleted rTECs and mTECs versus NECs+IL-3 or basal rTECs or mTECs). (b)贴壁实验采用化学镀红标记的EPC或炎性细胞于TECs上，未处理或按指示处理。贴壁细胞计数为平均±S.D。每场(×20倍)(*)P<0.05 adherent cells on treated TECs versus basal TECs). (c炎症细胞、EPC细胞和M07e细胞的细胞提取物为IP和免疫插槽(IB)抗c-Kit Ab。所有报告的数据代表三个独立的实验，一式三份。

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IL-3诱导的mbKitL的表达有助于EPC和炎症细胞向血管生成活跃部位的转运。SCID小鼠皮下注射(S.C.)含有2×10的Matrigel6TECS在有或没有抗-mbKitL抗体的情况下。植入后7d后恢复Matrigel插头，用抗CD 68抗体检测炎症细胞(上板)或抗荧光素/俄勒冈绿多克隆抗体(下板)检测EPCs。有关详细信息，请参阅材料和方法一节。在上面板，红色箭头显示CD 68+炎症细胞位于新生血管周围。在较低的面板中，红色箭头显示褐色标记的EPC，并与TEC新生血管结合。黑色箭头表示由TECs形成的血管。人CD 31染色检测血管密度。本研究只考虑血管内含有红血球的未闭腔。直方图表示数目(平均值±S.D.)(1)每场血管；(2)每支血管标记EPCs；(3)在不同实验条件下(×20放大)，每场炎症细胞。标尺表示50μm(*)P<0.05, experimental versus control values). Ten randomly selected fields from six different sections for each individual experimental group were analyzed.

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IL-3靶向对肿瘤血管形成和肿瘤生长的影响

肿瘤血管对肿瘤细胞的生长和侵袭至关重要。Shchors和Evan，2007年我们研究了IL-3在控制肿瘤新生细胞形成中的生物学意义。为此，在SCID小鼠中注射原发肾癌细胞时，是否存在特定的IL-3中和抗体。肿瘤生长在指示日期(图6a4-5周后，与注射IL-3中和抗体的小鼠(430±30 mm)相比，未治疗的小鼠出现明显的肿瘤肿块。3未治疗小鼠对110±20 mm3抗IL-3Ab处理小鼠)。这些肿瘤被恢复并进行血管密度分析。如图所示图6b a注射IL-3中和抗体的肿瘤血管密度降低，提示靶向IL-3对肿瘤血管也有影响。此外，如肿瘤体积所示，干扰IL-3也会影响肿瘤的扩张.

IL-3阻断剂能抑制肿瘤血管的形成。(a) 5 × 106原发性肾癌细胞皮下注射(S.C.)进入不含生理盐水或抗IL-3Ab的SCID小鼠侧翼。每2天在肿瘤区注射生理盐水和抗IL-3Ab.评估肿瘤生长(体积)。(b)取肿瘤标本，用苏木精-伊红染色测定血管密度.用人CD 31染色法测定新生血管密度，计数(平均±S.D)。每个场的血管数量(×20倍)。标尺表示50μm(*)P<0.05, anti-IL-3 Ab-treated tumors versus untreated tumors). Ten randomly selected fields from six different sections for each individual experimental group were analyzed.

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肿瘤组织中的血管是肿瘤微环境的主要组成部分。这些血管是在肿瘤细胞中表达的促血管生成因子刺激下形成的。因此，肿瘤细胞建立了促进肿瘤生长的特殊基质微环境，血管生成参与其中(Folkman，2007年; Shchors和Evan，2007年; Kerbel，2008年)。肿瘤相关血管生成通过复杂的细胞因子网络持续维持，即促血管生成因子介导的肿瘤细胞和基质细胞(包括ECs、非内皮间充质细胞和炎症细胞)之间的旁分泌和自分泌相互作用。Butler等人，2010年)。炎症细胞，包括T淋巴细胞，作为调节细胞释放大量的可溶性促血管生成介质，反过来，可以直接或间接地调节肿瘤血管生成。事实上，乳腺癌和卵巢癌组织中由CD 25/CD4/CD5+T细胞浸润的一组肿瘤细胞释放的白细胞介素3(IL-3)已经被报道能促进肿瘤血管生成。Dentelli等人，2004年)。我们在此证明体内人TECs具有一种内在的促血管生成能力，其特性与肿瘤微环境无关，并受其IL-3自分泌的驱动。此外，通过应用sirna技术，我们能够证明IL-3与其受体结合所发出的信号对于tc的增殖和迁移至关重要。离体而为了体内船只的形成也是如此。供应肿瘤的血管被认为是独一无二的，因为在没有生长因子的情况下，它们在形态学、病理生理学、基因表达谱和生长发育方面与正常人不同。St Croix等人，2000年; Baluk等人，2003年)。目前已有相当多的证据支持Akt在驱动TEC促血管生成表型(Bussolati等人，2006年, 2010)。我们的结果表明，IL-3，通过Akt，驱动tc独立的生长，并阻断了IL-3或其信号分子Akt。体内防止肿瘤血管生成和生长，为靶向IL-3获得更多的抗肿瘤作用提供了机制基础。

虽然肿瘤细胞最初被认为是促进肿瘤血管生成和生长的细胞事件，但现在已经有相当多的证据表明肿瘤浸润髓系细胞在这一现象中的中心作用。de Palma和Naldini，2006年; Takakura，2006年)。这些细胞从血液中被积极地吸收到肿瘤的微环境中。炎性细胞贩运体内受趋化因子、整合素、免疫球蛋白超家族和选择素粘附分子家族(Luster等人，2005年; Weber和Koenen，2006年)。在necs上，IL-3作为一种促炎分子，能够诱导粘附分子的表达，调节炎症细胞向炎症部位的转运。Brizzi等人，1993年)。本研究结果表明，IL-3通过Akt，除了作为促进TECs存活的因子外，还控制着E-选择素、细胞间粘附分子-1和mbKitL的表达。骨髓基质细胞特异性表达mbKitL，其表达是为了将造血干细胞锚定并维持在静止的壁龛中。Flanagan等人，1991年)。同样，在周围活跃的血管生成部位，mbKitL充当循环细胞的粘附受体(Dentelli等人，2007年)，维持了这样一种可能性，即在TECs中，mbKitL的表达可能有助于c-Kit表达细胞的招募。这样的事件被发现对EPC和炎症细胞都是至关重要的，因为无论是针对IL-3还是mbKitL，它们都不能粘附于TECs。

EPC定义上的差异使得我们很难识别这些难以捉摸的细胞。体内尤其是肿瘤。骨髓已被提议作为人类循环EPC和小鼠肿瘤模型的仓库，尽管目前还不清楚所识别的细胞是EPCs还是靠近血管壁的造血细胞(Yoder and Ingram，2009年)。此外，根据肿瘤部位、小鼠株、肿瘤进展阶段和定量方法，推测骨髓EPCs的绝对数量有很大差异。Nolan等人，2007年; 加奥等人，2009年)。由于这些原因，目前EPC的指定是基于EPC功能特性，特别是基于体内血管生成能力(Yoder and Ingram，2009年)。在此，我们提供证据，EPC可以发光结合到TEC形成的容器中，而mbKitL对这一事件也有贡献。

在多种肿瘤类型中，肿瘤浸润性炎症细胞密度与血管密度之间存在很强的相关性。此外，肿瘤浸润性炎症细胞的高密度也预示着许多癌症的预后不良(Nis为啥等人，1999年; Leek和Harris，2002年)。肿瘤浸润髓系细胞的促肿瘤特性确定了这些细胞是抗癌治疗的靶点。Sica等人，2007年)。我们的结果表明，由TECs表达的mbKitL可能是血管生成部位髓样细胞的归巢信号，其功能失活减少了血管形成，提示靶向MBKitL可能是一种替代治疗方法，可对肿瘤血管生成产生间接的有利作用。

肿瘤的完成来招募新的血管或重组现有的周围血管会导致血管生成和进展中的肿瘤。因此，靶向肿瘤内皮细胞诱导肿瘤消退的治疗潜力已被广泛认识。然而，抗血管生成疗法并没有达到最初的期望。目前，抗血管生成药物被认为是最有效的结合细胞毒性药物和/或治疗的目标是清除髓系细胞(费拉拉和克尔贝尔，2005年; Kerbel，2008年)。因此，我们的研究结果表明，IL-3可能促进肿瘤血管生成，并促进髓系细胞的再生，从而提供了利用IL-3作为替代靶点的机制理性，在互补的方法中，该靶点可能具有显著的治疗优势。

网上详细介绍了试剂和抗体、westernblot分析、siRNA技术、细胞迁移和酶联免疫吸附试验。补充数据.

细胞培养

来自肾脏和乳腺癌的人肿瘤细胞(这两种细胞系均来自原发肿瘤；乳腺癌细胞来自一名48岁的妇女：T3bG2N0M0，而肾癌细胞来自一名55岁男子：T1bG2N0M0)，由Camussi教授友好地提供，分离和生长了上文所述的肿瘤细胞(T1bG2N0M0)(T1bG2N0M0)。Bussolati等人，2003年; Grange等人，2006年)。rTECs和mTECs在内皮细胞基础培养基-2+2%胎牛血清中保存至第12代。在分娩后4h内从人脐静脉中分离出NECs，并按上述方法培养。Dentelli等人，1999年)。分离EPC(Yoder等人，2007年)用Ficoll组织不透明1077(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)分层培养外周血单个核细胞，在内皮细胞生长培养基-2中培养21天。Togliatto等人，2010年; Uberti等人，2010年)。外周血单个核细胞在高渗和等渗Percoll溶液中分离单核细胞，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(10 ng/ml)存在下培养，并在整个研究过程中表现为炎症细胞。批准由SIMT(Servizio免疫ematologia e Medicina Trasfusionale，意大利都灵)和医院的机构审查委员会批准。根据“赫尔辛基宣言”提供了知情同意。M07E细胞(Avanzi等人，1990年)和IL-3释放长臂猿MLA细胞株(Brizzi等人，2001年)分别作为c-Kit和IL-3表达的阳性对照。原发性肾癌细胞来源于一名接受临床手术的知情患者(细胞来源于一名50岁男子：T3bG2N0M0)。用含5%胎牛血清的RPMI对新鲜肿瘤进行细胞培养。在选定的实验中，rTECs或mTECs被预先孵育不同的时间间隔，与特定的抗IL-3或抗mbKitl中和抗体(各40μg/ml)或与特定的Akt抑制剂Ly294002(20μ)共同孵育。M)。实验结束时用台盼蓝评价细胞活力。培养24、48、72和96h后，用直接细胞计数法检测NEC、RTEC和mTEC的增殖活性(每样放大10字段)。每个实验一式三份，计数由三个不同的操作人员进行。

流式细胞术

为了分析细胞周期的进展，进行了荧光激活的细胞分类分析，如前所述(Defilipi等人，2005年)，在NECS、rTECs或mTECs上用2%胎牛血清培养24~48~72h，在抗IL-3中和抗体或Akt抑制剂Ly294002存在或不存在的情况下，或在IL-3或Akt缺失细胞上进行培养(48 h后进行分析)。治疗后，细胞用70%乙醇固定，DNA用碘化丙啶染色，流式细胞仪分析(FACSCalibur，Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)。百分比±S.D。用ModFit LT软件(Verity Software House，Inc.，TopSha，ME，USA)测定细胞周期各期的细胞数。流式细胞仪分析细胞表面分子在NECS和rTECs上的表达。

IL-3、VEGF、E-选择素、ICAM-1和mbKitL表达的RNA提取及实时定量PCR检测

总RNA是用TRIzol试剂(Invitrogen，弗雷德里克，MD，美国)从未经处理或48小时处理的细胞，如说明，按照制造商的指示。用反转录试剂盒从50 ng总RNA中合成单链互补DNA。在ABI PRISM 7700(应用生物系统，Foxter Cyto，CA，USA)中，通过定量实时PCR扩增出每个互补DNA.GAPDH以基因为标准参照。比较阈值周期法计算IL-3、VEGF、mbKitL、E-选择素和ICAM-1的相对表达.用特异性Taq-Man基因表达法检测IL-3和VEGFmRNA的表达.用以下引物序列检测MBKitL、E-选择素和ICAM-1 mRNA的表达：

感觉(5‘-CCATTGATGCCTTCAAGGAC-3‘和反义(5’-)GGCTGTCTCTCTTCGAGTA-3‘为mbKitL；

感觉(5‘-CAGTATCTAGCTTTCCGG-3‘)和反义(5’-)GCTGCCACAGTGATGATGACAA-3‘)为ICAM-1；

感觉(5‘-CCAGT-TATTTCAGC-3‘和反义(5’-)E-选择素的CATTGGGGCTGGGAAT-3‘)。

粘附试验

在静态条件下，检测EPC或炎症细胞与rTECs或mTECs的粘附(数据未显示)。Bian酮等人，2004年)。简单地说，EPCs或炎症细胞被标记为红色荧光PKH 26(Sigma-Aldrich)生命染料，并在14时离心后被标记。g在不含0.25%牛血清白蛋白的培养基中再悬浮10 min.然后加入细胞(2×10)5(每孔细胞)将未按指示处理或处理的TECs单层汇合，以中和IL-3、mbKitL或Akt的作用。共培养于37℃下孵育4h，用磷酸盐缓冲液冲洗三次，去除不贴壁细胞。样品用4%甲醛/磷酸盐缓冲液固定，在表观荧光显微镜下观察。三种不同的操作人员一式三份(每样放大×20倍，10字段)计数结合标记的EPCs或炎症细胞。

管状结构形成试验

为分析管状结构的形成，采用生长因子还原Matrigel包覆24孔板(BD生物科学，美国加利福尼亚州圣何塞).rTECs或mTECs被放置在聚合基质的顶部，无论是否存在抗IL-3中和抗体。另一种方法是使用耗尽IL-3或Akt的TECs。6h后，用三种不同的操作算子(每种实验一式三份)对管状结构的形成进行评估，在×20放大率下计数10个场。

体内实验

在血管生成实验中，从美国马里兰州威尔明顿查尔斯河实验室国际公司购买的SCID小鼠(每组5只)在左侧皮下注射含有2×10的生长因子还原的Matrigel。6rTECs或mTECs，单独或与抗IL-3中和抗体或TECs联合使用，为IL-3或Akt沉默。7天后，取出Matrigel插头，固定在10%福尔马林缓冲液中，石蜡包埋，组织学和免疫荧光分析。用苏木精-伊红染色切片对血管面积和总Matrigel面积进行了平面评定，如上文所述(Dentelli等人，1999年)。只有管腔未闭且含有红细胞的结构才被认为是血管。血管生成的百分比为±S.D。血管面积与总Matrigel面积之比(%血管面积，×10放大率)。血管内皮细胞CD 31染色检测新生血管的定量。任何染色的CD 31+细胞或CD 31+细胞簇，明显分离于结缔组织成分，被认为是一个单一的微血管，根据Weidner等人(1991年))。研究体内将EPC或炎症细胞归巢至肿瘤新生血管、rTECs或mTECs(未显示数据)，在有无抗-mbKitL中和抗体的情况下，加入Matrigel，皮下注射至SCID小鼠左侧(每组5只)。在注射Matrigel 2×10后5天评价EPC归巢情况6用荧光染料羧荧光素二乙酸琥珀酰酯(分子探针，Invitrogen)对EPC进行标记。T gel等人，2005年)并注入小鼠尾静脉。2天后处死小鼠，回收Matrigel插头，进行免疫组织化学分析。为研究炎症细胞归巢情况，将TEC植入SCID小鼠后7天，取相应的Matrigel插头，进行免疫组织化学染色。动物程序符合“实验室资源的护理和使用指南”(国立卫生研究所出版物第93-23期，1985年修订)。

免疫组织化学

将石蜡包埋的Matrigel插头切片收集到聚赖氨酸涂层的幻灯片上.6%H阻断内源过氧化物酶活性2O2室温下持续8分钟。为检测羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯标记的EPCs，采用抗荧光素/俄勒冈绿多克隆抗体(稀释1：1000，分子探针)于4°C过夜检测炎性细胞，采用抗CD 68多克隆抗体(稀释1：1000，DAKO，Glostrup，丹麦)。辣根过氧化物酶标记的抗兔视觉聚合物(DAKO)在室温下孵育30 min.以3，3-二氨基联苯胺溶液(DAKO)为原料，研制了反应产物.切片用苏木精染色。遗漏原抗体或用不相关的兔血清免疫球蛋白G替代作为阴性对照。用三种不同的操作器(×20放大率)在6个非连续切片中计数阳性细胞数(EPCs/血管或每个野炎性细胞)。用人CD 31染色评价新生血管的定量，并以计数(平均值±S.D.)为标准。每个场的血管数量(×20倍)。

免疫荧光分析

取石蜡包埋块的Matrigel插头切片，用抗人CD 31-FITC抗体和DAPI(Sigma-Aldrich)作为核标记物进行处理。在3种不同的标本(×20放大率)中，通过随机选择的10个场计数，检测人CD 31阳性血管。用蔡司LSM 5 PASCAL共焦激光扫描显微镜(德国耶拿卡尔蔡司)获得图像，其中配有氦氖激光(543 Mm)、氩激光器(450~530 mm)和EC平面Neofluar×40/1.3油浸DIC物镜。图像分析用蔡司LSM 5版本3.2软件。

异种接枝实验

为体内肿瘤生长5×106将原代肾癌细胞接种于SCID小鼠左侧皮下(每组6只)，分别注射抗IL-3抗体存在或不存在(生理盐水)。每2天在肿瘤内注射生理盐水和抗体，共36天。每3天用卡钳测量肿瘤大小，并根据公式计算：V=4/3π×(d/2)2 × (D/2) (d代表小肿瘤轴；D代表主要肿瘤轴)。大约在4-5周后，当肿瘤数量达到∼450毫米3..肿瘤切片固定后进行组织学分析。对肿瘤内血管密度的量化进行了上述评价。动物程序符合“实验室资源的护理和使用指南”。

统计分析

全离体和体内结果代表至少三个独立的实验，一式三份。使用Bio-RadGS 250分子成像仪(Bio-Rad实验室，大力士，美国)进行密度计分析，计算蛋白质水平的折叠诱导差异，这些蛋白质水平符合β-actin含量(*)。P<0.05, statistically significant between experimental and control values) and each western blot panel and relative densitometric histogram reported in the figures were representative of the results obtained in triplicate. Significance of differences between experimental and control values (*P<0.05) for both 离体和体内实验用Newman-Keuls多重比较检验进行方差分析，并在每个图形图例中详细报告。