病人与方法
1996年1月至2003年1月，在日本Mie大学医院接受结直肠癌手术的243名患者中，109名患者在5年内接受了随访，其中52名患者在随访期后5年内死于原发或复发疾病。另一个因素纳入这项研究是保留优秀的癌症和正常组织样本。161例患者中，男性104例。平均年龄64.6岁(37~86岁)。无围手术期死亡。术前未进行化疗或放射治疗。
通过钡剂灌肠、结肠镜检查、CT和磁共振成像(MRI)确定肿瘤和远处转移的位置。原发病变位于直肠70例，乙状结肠48例，升结肠30例，横结肠8例，降结肠5例。26例同时发生肝转移，3例同时发生肝转移和腹膜播散。所有患者均行原发肿瘤切除，12例同时行肝部分切除术治疗肝转移。12例为低分化腺癌，149例为高分化或中分化腺癌。所有患者均采用联合国际癌症分类系统(UICC)，根据切除标本进行分类。UICCⅠ期38例(T1~2N0M0)，Ⅱ期36例(T3-4N0M0)，UICCⅢ期52例(TXN-2M0)，UICCⅣ期(TXNXM 1)35例。Ⅲ、Ⅳ期患者接受氟尿嘧啶化疗，Ⅰ、Ⅱ期患者未接受术后辅助治疗。术后每隔3个月观察一次，每隔3个月观察一次，每6个月观察一次，每隔3年观察一次，然后每年观察一次。记录病史，每次检查均进行体格检查，并每年进行胸部X线、结肠镜和CT检查。中位随访时间为63.2个月(平均59.9±38.7)个月。在161例患者中，56例死于原发或复发疾病。研究的临床病理参数为：T分级、血管受累、淋巴管浸润、淋巴结转移和远处转移。
新鲜的结直肠癌手术标本在无菌条件下从切除标本的远端取出来，立即置于液氮中，保存在−80°C处，直至检测。
SIL-6R和IL-1的组织浓度β
共制备322份标本(161份癌组织和161份正常大肠粘膜)，分析sIL-6R和IL-1的组织表达情况。β..这些样品解冻，快速称重，然后放入5毫升磷酸盐缓冲溶液(Pbs)中.每100 mg湿重的组织均质于冰上，提取缓冲液每100 mg，用马达驱动的聚四氟乙烯(Teflon)支架作用5 min。1 2 0 0 0 r.pm离心后得到的组织提取物。在4°C下放置15分钟-μ1小瓶，保存于−80°C，用商用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定细胞因子在培养上清液中的浓度，检测sIL-6R和IL-1两种酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒。β(生物资源国际，美国加利福尼亚州卡马略)。用BCA蛋白分析试剂盒(皮尔斯化学，罗克福德，美国)测定蛋白质浓度。组织浓度以PG、sIL-6R或IL-1的形式表达。β每毫克总蛋白。每个研究对象都获得了知情同意。
免疫组织化学分析
随机抽取52例患者进行免疫组织化学分析。其中31例为男性。平均年龄62.7岁(37~81岁)。UICCⅠ期9例，Ⅱ期12例，Ⅲ期16例，Ⅳ期15例。中位随访时间为63.0个月(平均59.9±41.0)个月。在52例患者中，19例死于原发或复发疾病。石蜡块切成5-μM切片，在65°C与熔融蜡连接在玻璃玻片上，在3%过氧化氢中脱蜡、水化、孵育30 min。切片用冷自来水冲洗，用微波炉加热，在PBS(pH7.4)中洗3次，5 min。经PBS洗涤后，于4°C与原抗体孵育1小时，阻断非特异性结合。切片在4°C：抗IL-6(1：200；Santa Cruz BioTechnology，CA，Santa Cruz，CA)，抗IL-6(抗IL-6R)的温度下与相应的抗体共同孵育。α(1：200；圣克鲁斯生物技术)和抗gp 130(1：200；圣克鲁斯生物技术)。切片在室温下洗涤30 min，用适当的生物素化IgG稀释于PBS中。切片与亲和素/生物素复合物(ABC)试剂在室温下孵育3h。该颜色是在90年代开发的，使用矢量民建联底物试剂盒，并与Meyer‘s苏木精(载体实验室，伯林加梅，美国)抗衡。此外，用商业ELISA试剂盒(生物源国际)测定了52例癌症和52例正常大肠黏膜组织提取物中IL-6的浓度。组织浓度以PG、IL-6/mg总蛋白的形式表达。
抗体反应性评价
阳性和阴性对照组织切片染色证实免疫反应的特异性。抗IL-6、抗IL-6 R的程度α并根据切片中癌细胞和癌间质组织的百分比，对各组织切片的抗gp 130反应性进行评分。在本研究中，染色细胞超过50%的癌细胞和癌间质组织被定义为“阳性”，其他(<50%)定义为“减少”，如前面所述：小松等人，2000年)。三名独立调查人员对这些幻灯片进行了三次评估，他们对所用标本和抗体的性质视而不见。
细胞培养条件
人结肠癌细胞株HT-29来自日本东北大学发展、衰老与癌症研究所生物医学研究细胞资源中心。RPMI 1640培养基是从西格玛(圣路易斯，MO，美国)购买的。胎牛血清(FBS)和非必需氨基酸(NEAAS)是从GIBCO-BRL(美国纽约州格兰德岛)购买的.重组人IL-1β从英国伦敦的PeproTech House购买。重组人IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)购自R&D系统公司.(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)。所有细胞均保存在含10%FBS的RPMI 1640培养基中，最后浓度为1×10。5细胞ml−1在六孔板中培养。在无血清培养基中饥饿24小时后，无血清培养基中加入或不含IL-1。β(10纳克毫升)−1)和IL-1RA(100纳克毫升)−1)增加。条件培养基(CM)在0、1、3、6、12和24 h收集，保存于80°C，用ELISA法测定sIL-6R和可溶性gp 130(Sgp 130)(Quantikine，明尼阿波利斯，MN，USA)的上清液浓度。
总RNA提取及半定量RT-PCR分析
澄清IL-1β采用半定量RT-PCR技术检测缺乏跨膜(TM)结构域的IL-6R和sIL-6R的表达，提高IL-6R剪接变异的表达和(或)膜结合形式的脱落。Horiuchi等人，1994年)。细胞被保存在含10%FBS的RPMI 1640培养基中，并在1×10的浓度下播种。5细胞ml−1在六孔板中培养。在无血清培养基中饥饿24小时后，无血清培养基中加入或不含IL-1。β(10纳克毫升)−1)和IL-1RA(100纳克毫升)−1)增加。分别于0、6、12h收集细胞，用PBS洗涤肿瘤细胞，胰蛋白酶提取肿瘤细胞。在此之后，根据制造商的说明，使用RNeaseMidi试剂盒(Chatsworth，CA，Chatsworth，Chatsworth)提取总RNA。IL-6R的PCR引物如下：IL-6R或SIL-6R引物(正义，5‘-ACGCCTTGGACAATCCA-3’和反义，3‘-TGCTCGAGTATTGTCAGA-5’)。Horiuchi等人，1994年)。底漆β-Actin是用Primer 3软件设计的(加州大学圣地亚哥分校圣地亚哥超级计算机中心生物工作台3.2版)。顺序如下：β-肌动蛋白(Sense，5‘-ACAGCCGCCTTTGC-3’和反义，3‘-GCGGCGATATCATCATCC-5’)。线性扩增阶段的最佳循环参数为：91℃变性1 min，61℃1 min退火，72°C延伸1 min。同时进行了35次对照PCR。β-肌动蛋白作为样品正常化的标准。扩增产物经溴化乙锭染色后，在紫外光下进行电泳分离、可视化和照相，并由CA Analyzer 2.0版(日本东京ATTO公司)进行量化。
统计分析
使用MedCalc 7.2 for Windows进行了统计分析(Broekstraat 52，9030，Mariakerke，比利时)。结果以平均±S.D表示。曼-惠特尼U-试验用于评估未配对观察之间的差异。组织浓度比与临床病理因素之间的关联表用费舍尔精确概率检验或χ分析2-分析。采用Wilcoxon秩相关检验进行统计分析。采用Kaplan-Meier法获得精算生存曲线，并用对数秩检验进行比较.用单因素和多因素分析(Cox比例风险模型)检验预后因素。双面P-数值<0.05被认为是有统计学意义的。
