人胚胎干细胞在化学条件下制备合格临床级功能性肝细胞的研究 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

肝细胞已成功地从人多能干细胞(HPSCs)中产生。然而，hPSCs产生的肝细胞的成本效益和临床分级还有待提高.在本研究中，我们报道了临床级人胚胎干细胞(HESCs)在良好的生产实践(GMP)要求下生产功能性肝细胞的情况。我们用完全定义的试剂从hESCs中依次生成原始条纹(PS)、最终内胚层(DE)、成肝细胞和肝细胞样细胞(HLCs)。在成肝细胞分化过程中，用二甲基亚砜(DMSO)、转铁蛋白、2-抗坏血酸2-磷酸倍加镁盐(VC-Mg)、胰岛素和亚硒酸钠代替细胞因子和FBS/KOSR。在体外将成肝细胞分化为具有典型肝细胞形态并具有成熟肝细胞代谢相关基因表达、白蛋白分泌、脂肪积累、糖原储存和诱导细胞色素P 450活性等特征的肝癌细胞。与Tet-uPA Rg 2肝整合的hlcs–/–IL2RG–/–(URG)小鼠，移植后部分恢复。此外，还进行了一系列与生物安全有关的实验，以确保今后的临床应用。总之，我们开发了一个化学定义的系统，在GMP条件下从hESCs中生成合格的临床级HLCs。HLCs已被证明是治疗肝衰竭的安全有效的方法。这个有效的平台可以促进hESC来源的hlcs移植治疗肝脏疾病.

导言

肝脏是人体最重要的器官之一，主要负责新陈代谢、解毒、蛋白质合成和消化所需生化物质的生产。1..此外，肝脏易患许多主要疾病，如肝纤维化、肝硬化、肝炎和肝癌，这些都是发病率和死亡率的主要原因。2,3..急性肝损伤或终末期肝病患者别无选择，只能接受肝移植。肝脏在器官中是独一无二的，因为它有能力再生一个完整的、生理功能正常的肝脏，即使只有25%的肝脏仍然存在。4..然而，供体肝脏的来源受到限制，导致病人在等待肝脏移植时死亡。近年来，肝细胞移植的发展为肝病的治疗提供了一种新的策略。肝细胞移植已在临床上应用于治疗肝功能衰竭。5,6,7,8,9,10..据报道，急性肝衰竭、暴发性肝衰竭和慢性肝病等后天性肝病患者，无论是肝移植还是非肝移植，均能从肝细胞输注中获益。然而，由于缺乏可用的健康供体，以及细胞增殖、功能缺陷、免疫排斥风险以及对伦理问题的关注，原代或胎肝细胞的使用受到限制。11,12..因此，其他类型的肝细胞，肝细胞样细胞(Hlcs)，可来源于人多能干细胞(HpSCs)，包括人胚胎干细胞(HESCs)和诱导多能干细胞(Ipscs)，已被报道可改善肝损伤动物模型的肝脏功能。13,14,15,16,17,18,19,20..然而，与原代或胎肝细胞相比，HLCs的再生潜能也存在一些问题。因此，没有对hlcs进行临床试验，因为人们担心hlcs是否具有与原代人肝细胞相当的功能，以及hlcs的生物安全问题。21,22.

一些研究报告了将hESCs分化为肝细胞样细胞的方法。13,15,17,18,23,24..邓等人高效无血清培养基三阶段法的建立17..随后，使用细胞因子，如fgf 2、bmp 4、hgf和kGF，建立了严格的协议。25,26，或使用fbs/kksr的低成本小分子。27,28.

这些研究为hPSCs来源的肝细胞样细胞的临床应用提供了可能。然而，据我们所知，尽管许多小组付出了巨大的努力，但仍没有成功地从hPSCs中生成合格的界定的肝细胞，先前报道的研究缺乏与生物安全有关的实验，这阻碍了临床的应用。

最近，有几次尝试在GMP级的HLCs的产生已经被报道.Hay和他的同事(2017)开发了一种产生肝细胞样细胞的方法，该方法重复性好，成本效益高，可以减少批间变异。29..Rashid等人(2019年)报道了在三维培养条件下利用临床级hpSCs产生肝细胞样细胞。30..这些研究为hPSCs来源的肝细胞样细胞的临床应用提供了可能。然而，据我们所知，尽管许多小组付出了巨大的努力，但仍没有成功地从hPSCs中生成合格的界定的肝细胞，先前报道的研究缺乏与生物安全有关的实验，这阻碍了临床的应用。

在本研究中，我们报告了从一种临床级hesc细胞系(q-cts-hesc-2)中获得合格的临床级功能性肝细胞的方法，该细胞系专为人类治疗和gmp条件下的生物库所用。31..我们通过原始条纹(PS)、确定内胚层(DE)和肝成纤维细胞谱系依次引导hESCs生成HLCs，从而模拟了自然发育过程。这些细胞在体外具有典型的肝细胞形态和成熟肝细胞的代谢相关基因表达、白蛋白分泌、脂肪积累、糖原储存和诱导细胞色素P 450活性等特点。此外，移植到URG小鼠后，在uPA激活下可诱发肝功能衰竭，hESCs衍生的HLCs能够整合到宿主肝脏，恢复肝脏功能。此外，还进行了一系列与生物安全有关的实验，以确保今后的临床应用。

材料和方法

所有用于临床hesc培养和肝细胞样细胞分化的试剂都显示在支持表中。沙一.

道德声明

所有程序均在中国科学院动物学研究所指导下完成，并经中国科学院动物学研究所批准。

细胞培养

临床hesc线(q-cts-hesc-2)的制备如前所述。31..临床hesc维持在商业上提供的必要8。TM维托菌素涂层板上的基础培养基(E8)(生命技术)(1微克/厘米)2)。使用Versene(生命技术)每5或6天传代一次。每周用支原体检测试剂盒(InvivoGen)检测hESCs，用毒物传感器检测内毒素污染。TM发色Lal内毒素试剂盒(GenScript，L 00351)所有培养均保持在37°C，5%CO。2和大气中的O2在一个加湿的孵化器里(热费舍尔科学)。冷冻原代人肝细胞(PHHs)是从中国上海肝病研究所购买的，维持在37°C和5%CO。2在HI培养基(HIS)(肝脏疾病研究所)被用于实验之前。

肝细胞分化

用CTS-Tryple(生命技术)将临床分级的hESCs消化成单细胞.细胞经1200 rpm离心3 min后，再悬浮于含10 M缓蚀剂(Y-27632)的E8培养基中。在2×10浓度的条件下，将细胞悬液接种到Matrigel(Corning)包衣板上。4每厘米活细胞2..培养24h后，在RPMI-1640培养基(LifeTechnologies)中加入100 ng/mL Activin A(R&D技术)和25、50和100 ng/mL Wnt3a(R&D技术)或2、3和5 M GSK 3抑制剂CHIR 99021(Stemgent)培养1天。然后将培养基改为RPMI-1640培养基，加入1×CTS-B27(生命技术)和100 ng/mL的激活素A，作用2d。第3天，培养基改为CTS-KO-DMEM/F12(生命技术)，外加1×非必需氨基酸(NEAA)(生命技术)，1×CTS-GlutaMAX。TM(生命技术)，5毫克/毫升转铁蛋白(Sigma-Aldrich)，50克/升抗坏血酸2-磷酸倍加盐水合物(VC-mg)(Sigma-Aldrich)，10克/mL胰岛素(Sigma-Aldrich)，0.1 ng/mL亚硒酸钠(Sigma-Aldrich)和1%DMSO(Sigma-Aldrich)。6天后，将培养基改为Iscove改良的Dulbecco‘s培养基(LifeTechnologies)，添加20 ng/mL HGF、20 ng/mL OSM(R&D技术)、10μM地塞米松(Dex)(Sigma-Aldrich)、2M SB 431542(Stemgent)和1个M RO4929097(Selleck)，为期10天。

聚合酶链反应

反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)用RNA制备纯细胞/细菌试剂盒(TIANGEN，DP 430)提取RNA。培养24h后，提取PHHs mRNA。用PrimeScript™First-Strand cDNA合成试剂盒(Takara，6110 B)将两微克的RNA反向转录成cDNA。采用战略烯Mx3005P系统(Agilent Technologies)进行实时定量PCR(QPCR)，并与SYBR绿色实时PCR主混合+(TOOOBO，QPS-201)进行分析。GAPDH成绩单用于内部正常化。

免疫荧光染色

用4%多聚甲醛(Aladdin化学有限公司，C 104190)固定15 min，含0.5%TritonX-100的PBS固定15 min，室温下用含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭60 min。Then，the cells were stained with 1:200 goat polyclonal IgG FOXA2(R&D Technologies，AF2400)，1:200 goat polyclonal IgG SOX17(R&D Technologies，AF1924)，1:200 mouse monoclonal IgG HNF4α(Abcam，ab41898)，1:200 mouse monoclonal IgG AFP(Sigma-Aldrich，A8452)，1:200 mouse monoclonal IgG ALB(R&D Technologies，MAB1455)，1:200 mouse monoclonal IgG CK18(Abcam，ab2254)，1:250 mouse monoclonal IgG AAT(Sigma-Aldrich，SAB4200198)，and 1:200 mouse monoclonal IgG ASGPR1(Thermo Fisher Scientific，MA1-40244)在4°C下，2%BSA在PBS中过夜.然后用PBS冲洗3次，然后用1：200 Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG(H+L)(Jackson免疫研究，705-546-147)或1：200荧光素(FITC)驴抗山羊IgG(H+L)(Jackson免疫研究，715-096-150)在2%BSA中在室温下孵育60 min。用Hoechst 33342(Invitrogen，H 3570)染色前重复洗涤步骤。

流式细胞术

取细胞，用4%PFA固定10 min，室温下用含0.5%TritonX-100和2%BSA的PBS渗透阻滞60 min。用2%BSA在4°C下对细胞进行一次抗体染色。在室温下，用二次抗体与细胞在黑暗中孵育1h。对ASGPR 1、Tra-1-81、Tra-1-60和SSEA 4细胞进行流式细胞分析，固定后仅与结合抗体孵育1h。培养后，细胞被清洗两次，用MoFlo(贝克曼)和相关软件进行分析。应用于流式细胞术的抗体为：1：200山羊多克隆IgG FOXA 2(R&D技术，AF 2400)，1：200山羊多克隆IgG SOX 17(R&D技术，AF 1924)，2μg/10。6小鼠单克隆IgGHNF 4α细胞(ABCAM，ab41898)，1：200小鼠单克隆IgG AFP(Sigma-Aldrich，A 8452)，0.25 g/106小鼠单克隆IgG ALB细胞(R&D技术，MAB 1455)，10L/106cells of rabbit anti-human ASGPR1-FITC(Miltenyi Biotec，130-109-490)，mouse anti-SSEA4-PE(BD Pharmingen，560128)，mouse Alexa Fluor 488-conjugated anti-Tra-1-60(Millipore，MAB4360A4)，mouse Alexa Fluor 488-conjugated anti-TrA-1-81(Millipore，MAB4381A4)，Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，705-546-147)，and fluorescein(FITC)-conjugated donkey anti-goat IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，715-096-150).

人白蛋白ELISA

培养48h后取细胞培养上清液，测定人白蛋白的分泌情况。对于维持在他体内的PHHs，培养48h后也收集上清液。移植实验采用尾静脉采血，室温放置10 min。然后用5000 rpm离心法收集血清，共15 min。用人白蛋白ELISA试剂盒(Assaypro，EA3201-1)测定人白蛋白水平。

PAS、ac-LDL、ICG和油红O染色的测定

细胞按照制造商的指示用周期性酸性希夫(PAS)(Sigma-Aldrich，395 B)和DII-ac-LDL(生物医学技术，BT-902)染色.采用吲哚青绿(ICG)(Sigma-Aldrich，I 2633)摄取法，将细胞转化为1mg/mL ICG培养基，37℃孵育1h，用PBS冲洗3次，倒置显微镜(Leica)成像。油红O染色用PBS冲洗3次，用4%PFA固定30 min。Ells用PBS洗涤三次，然后用油红O(Sigma-Aldrich，00625)溶解在异丙醇中30 min。用60%异丙醇冲洗两次，倒置显微镜观察。

CYP诱导和代谢试验

用药物培养HLCs和PHHs，检测CYP酶的诱导作用。详细地说，细胞在特定的诱导剂存在下孵育48小时，其中包括25种细胞色素P 450家族1亚家族A多肽1和2的细胞色素b-萘黄酮(Sigma-Aldrich，N 3633)(SIGMA-Aldrich，N 3633)。CYP1A1和1A2)，25毫克利福平(Sigma-Aldrich，R 3501)CYP2A6, 2C8，和3A4用qPCR方法检测不同的CYP 450亚基诱导表达水平。不同的CYP 450活性用市面上可用的细胞分析(P 450-Glo™法；Promega公司，麦迪逊，WI，美国)进行测定。

基因组变异呼唤

利用HiSeqX-10(Annoroad基因技术有限公司)提供的30X全基因组测序数据，分析了hlcs与ESCs之间的突变变化。如前所述32，全基因组测序数据由BWA(版本0.7.15)用默认参数的mem模式映射到hg 19基因组。带有独特基因组位置的映射读码被用来识别gtk中的单核苷酸变异(Snv)和插入和删除(Indels)事件。33..在两个样本中，只有不小于10个读取覆盖点，并且支持2或更多读的变体被保留。然后，删除位于重复序列和低复杂度区域的变异，并由RepeatMasker注释(Db20140131)。根据之前的报道，基因组中的均聚物区域也可能导致测序错误。32..我们还筛选了位于长均聚物区(≥5 bp)的位点。

RNA-seq文库的制备及数据分析

用Trizol(Invitrogen)法从HLCs和PHHs中分离出总RNA。用NEBNext Ultra编写了RNA-seq库TMIllumina RNA库准备工具包。用150 bp成对测序反应，对伊柳米纳·希塞克X-十测序仪进行测序.hESCs的大量rna-seq数据是从geo数据库下载的。34..所有rna-seq数据分析用Hisat 2(版本2.1.0)进行。35和袖扣(2.2.1版)36使用带有默认设置的UCSC hg 19注释。至少有一个样本使用具有独特基因组位置的读取和至少一个样本中不小于1FPKM的基因进行下一次分析(每个样本中的基因表达显示在补充表中)。S4)。以四倍变化作为筛选差异表达基因的阈值。david(版本6.8)对差异表达基因进行了基因本体分析。37..在R.

hlcs移植于URG小鼠体内的实验研究

男性TET-UPA Rag2–/–IL2RG–/–(URG)小鼠(8周龄)，以BALB/c为背景，购自北京Vitalstar生物技术公司(北京，中国)。URG小鼠维持在特定的无病原体(SPF)条件下。中国科学院动物学研究所动物保护和利用机构委员会批准了所有动物程序。细胞移植前12小时腹腔注射阿霉素(Dox)15 mg/kg(Sigma-Aldrich，D 1515)。细胞移植后的第一周，用饮用水注射DOX(0.25mg/mL)。细胞移植后1周，URG小鼠饮水中Dox浓度在6周内升高至0.5mg/mL。高级别委员会(n=5)和PHHs(n=5(2×10)6细胞/动物)在50升PBS或50升PBS(对照，n5)经脾内移植于URG小鼠体内。每周用尾静脉采集血样，用人白蛋白ELISA试剂盒(Assaypro，EA3201-1)定量人白蛋白。

组织学和免疫组织化学

组织采用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。石蜡切片(5m厚)进行免疫组织化学染色(IHC)。组织切片用单克隆鼠抗人肝细胞特异性抗原CK8/18(克隆5d3，中国麦辛)染色，免疫反应超敏。TM链霉亲和素-过氧化物酶试剂盒(试剂盒-9710，麦欣，中国)根据制造商的协议。用ImageJ(NIH)法评估每个野染色阳性细胞的面积，并对HLC细胞整合率进行分析。

致瘤性

以5×10的密度在CTS-DPBS中分离和悬浮细胞。7细胞/mL然后，用无菌立体显微镜下的无菌玻璃针，将20L细胞悬液仔细注射到6-8周龄的SCID小鼠(北京维他星生物技术)的睾丸内。注射两个月后，对小鼠进行安乐死，并按照动物保护和使用机构委员会的指导方针对畸胎瘤进行检查。

生物安全评价

测试项目列于表中。S2..“中华人民共和国药典，2015年版，第三卷”作为试验方法参考。

统计

数据以平均±SD表示。方差分析(ANOVA)用于确定与p=0.05为统计学意义。使用社会科学统计程序(SPSS，IBM)进行统计计算。

结果

合格临床级肝细胞样细胞的制备

在本研究中，我们用完全无异种试剂从临床分级的hESCs中依次生成原始条斑(Ps)、确定的内胚层(DE)和最终的成肝细胞和肝细胞样细胞(Hlcs)。沙一)。我们的差异化策略如图所示。1..hESCs衍生的HLCs具有典型的肝细胞形态，呈多角形，细胞核明显。1B)。此外，拷贝数变异测序(CNV-seq)进一步表明，在HLCs中没有染色体异倍体，也没有丢失或重复>10个Mbp片段。1D)。全基因组测序的体细胞突变分析表明，与体细胞传代相比，hESCs和hlcs的分化程度较低。38(无花果)S1a，b)。流式细胞仪的数据显示，没有残留的hESCs检测到第19天(图)。S2A)。因此，在NOD-SCID小鼠睾丸内注射hlcs后未见畸胎瘤形成。S2B，c)。此外，该系统已被证明对其他人类胚胎干细胞系有效(如图所示)。S3)。为确保安全，根据“人体体细胞治疗和细胞产品质量控制指南”进行了一系列与生物安全有关的实验，并验证了hlcs适合用于人体治疗(表)。S2)。国家食品药品监督管理研究院(NIFDC)对该项目进行了鉴定。

用Activin A和CHIR 99021代替Wnt3a诱导hESCs分化为确定的内胚层细胞

最终的内胚层分化是通过一系列的生长因子和小分子通过模拟体内肝脏的发育来实现的。17,25,26,27,28..然而，这些协议中的DE细胞通常由混合细胞组成，这导致了内胚层衍生物的低效率。39..脱细胞在体内起源于原始条纹(PS，E6.5)40,41..加入转化生长因子β和wnt对hESCs分化为ps细胞至关重要。42..据报道，wnt3a通过激活wnt信号来促进DE的生成。20,43..本研究利用磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂CHIR 99021，考虑到Wnt3a蛋白的高成本和不稳定性，诱导PS分化。我们发现用2-5M CHIR 99021可以诱导PS。2A第1天，基因表达分析显示CHIR 99021处理组PS转录水平高于Wnt3a处理组。此外，PS的形成也失败了，单独使用激活素A，而不激活WNT信号(如图所示)。2A)。因此，尽管Activin A是必需的，但仅Activin A还不足以生成PS。因此，我们认为外源性WNT激动剂，无论是Wnt3a还是CHIR 99021，都是PS诱导所必需的。然而，wnt信号的激活在最初的24小时内对ps的诱导起着至关重要的作用，然后在第2天到第3天的下一阶段被抑制了DE的形成。42..因此，在24小时后，通过改变添加激活素A和CTS-B27的培养基诱导DE分化，可以去除Wnt3a或CHIR 99021。治疗2天后，DE标记基因的表达，如Sox 17和FOXA 2，已确定。2B)。结果表明，与Wnt3a处理的细胞相比，CHIR 99021在第1天诱导了较高水平的DE标记的表达。同样，我们观察到，当Wnt信号在第1天失活时，DE的形成失败；在第3天，我们也检测到PS标记的表达。布拉切里, MESP 1，和MIXL1)和中胚层标记(MESP 2和HAND 1)(图1.2C)。CHIR 99021在第1天的两个微鼹鼠是最适宜的DE形成浓度，第3天PS和中胚层标记表达水平较低，导致90%以上的分化细胞表达明确的内胚层标记基因，如SOX 17和FOXA 2(图1)。二维f)。本研究结果表明，活化素A与CHIR 99021的组合能有效地诱导DE的形成。

在无异种条件下肝母细胞与DE细胞的分化

据报道，在小鼠肝脏发育过程中，心脏中胚层的成纤维细胞生长因子(FGF)信号和骨形态发生蛋白(Bmp)信号对小鼠肝脏发育过程中的肝功能有着重要的影响。44,45,46..FBS或KOSR也是肝细胞分化所必需的。13,14,15,16..然而，FGF和BMP，以及FBS或KOSR，是相对昂贵的或起源于动物。我们建立了含有四种因子(转铁蛋白、VC-Mg、胰岛素和亚硒酸钠)和DMSO的无异种分化体系，分别取代FGF、BMP、FBS或KOSR。的表达式轮廓HNF 4α和法新社证实在诱导后第9天肝成纤维细胞相关基因的表达水平显著增加。20(无花果)3A)。然后，我们尝试用四种不同的方法从DE细胞中诱导成肝细胞。3B)，其中A组诱导成肝细胞标记物的表达效率最高。HNF 4α和法新社第9天(图1)。3C免疫表型证实，90%以上的分化细胞表达肝成纤维细胞标记物HNF 4α和AFP。3E，f)。接下来，我们根据先前报道的协议，研究了分化成肝成瘤细胞的肝细胞成熟过程。20表明A组肝细胞特异性标记物的表达水平高于其他治疗组(图1)。三维空间)。这些发现证实了我们所描述的不含异种物质的系统将hPSCs分化为成肝细胞的有效性。

HLCs诱导的拮抗胆管细胞

成肝细胞对肝细胞和胆管细胞具有双向分化潜能。47,48,49..HGF、OSM和Dex通常用于肝母细胞对hlcs的诱导，而肝成纤维细胞分化成胆管细胞的方法尚未完全解决，最终导致hlcs和胆管细胞的混合产物。13,14,15,16,17,18,19,20..转化生长因子β、Notch、wnt、bmp或FGF信号转导调控成肝细胞或胆管细胞的分化50,51,52..据报道，抑制转化生长因子β和Notch信号在体内阻止胆道分化。51,53..本研究在B组中加入2 MSB 431542(转化生长因子β抑制剂)和1 MRO4929097(Notch抑制剂)，抑制成肝细胞的分化。4A)。结果表明，肝细胞特异性标志物的表达水平越高，胆管细胞标记物的表达水平越低。SOX 9不成熟标记法新社B组与A组根据先前报告的治疗方案进行比较(图1)。4A)。免疫荧光染色显示肝细胞标志物ALB、AAT、ASGPR 1和CK 18表达。4B)。流式细胞仪结果显示，80%以上的分化细胞表达肝细胞特异性蛋白ASGPR 1和ALB。4C)。虽然肝细胞特异性标记物mRNA水平低于原代人肝细胞(PHHs)(AFP)，但根据酶联免疫吸附试验(EL ISA)的结果，肝细胞中血浆蛋白碱性磷酸酶(ALB)的分泌水平与正常人肝细胞(PHHs)相当。4D，e).

具有cYP酶活性、胆汁排泄能力和肝细胞特异性功能的hlcs。

为了进一步确定HLCs在体外的功能，我们研究了HLCs是否能对CYP酶诱导剂的作用作出反应。CYP 450酶在正常培养基中有一定程度的表达，不附加化学诱导。据报道，CYP 450基因转录通常由核受体AHR(CYP1A1和CYP1A2)、CAR(CYP3A4和CYP2C8)和PXR(CYP2A6、CYP2C8和CYP3A4)调控，这些核受体在HLCs中高表达。5B)。48小时后β-萘黄素或利福平诱导，CYP基因的mRNA表达水平，CYP1A1和1A2，或CYP2A6, CYP2C8，和CYP3A4肝脏中最重要的代谢细胞CYP3A4和CYP1A1的酶活性经荧光素酶测定证实。5A，c)。qPCR结果也显示了一些关键转运基因在HLCs中的高表达水平。5D)。此外，HLCs还具有成熟的肝细胞特异性功能，包括糖原储存、乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)摄入、吲哚青绿(ICG)吸收以及中性甘油三酯和脂质的胞质积累。5E).

此外，我们还对hlcs和phhs进行了全基因组分析，并将它们的基因表达与hesc进行了比较。34..采用主成分分析(PCA)的全基因组分析证实，HLCs与PHHs在无监督的层次聚类分析中聚类在一起，表明它们的全局表达谱相似(图一)。6A)。因此，在HLCs和PHHs中，多能基因被显着地灭活。6B)。全球差异表达基因分析表明，与ESCs相比，HLCs和PHHs中高表达的基因与脂质代谢相关过程丰富。S4)。其结果与肝细胞的相关代谢功能一致。接下来，我们分析了肝细胞特异性基因的表达谱。6C)。与PHHs相似，HLCs的基因表达模式与hESCs完全不同。有趣的是，我们发现一些基因在HLCs中的表达水平高于PHHs。这些基因涉及脂肪消化和吸收(载脂蛋白B, ApoA 1, FABP 1，和APOC 2)、补体和凝血级联(FGG, FGB, CFI，和F10)，第二阶段代谢酶(UGT2A3, UGT2B15，和UGT2B7)、紧密连接(OCLN和GJB 1)和胆汁分泌(SCL51A, SLCO2B1，和SLC10A1)。这些结果可能为高级别委员会的使用提供深入的见解。综上所述，这些数据表明HLCs具有体外成熟肝细胞的特性。

Tet的再人口-UPA Rg 2–/–IL2RG–/–小鼠肝

接下来，我们研究了hlcs在tet-upa(尿激酶型纤溶酶原激活剂)rg 2细胞内的再生能力。–/–/IL2RG–/–注射+饮水给药致uPA激活致小鼠肝功能衰竭的实验研究54(无花果)7A)。为消除小鼠血清白蛋白干扰，检测人白蛋白ELISA试剂盒的特异性。结果表明，该试剂盒与小鼠白蛋白无交叉反应。S5a)。HLC移植后，小鼠血清中人白蛋白分泌逐渐增加，第7周达到最高水平321±44 ng/mL，远低于PHH处理动物血清中人白蛋白分泌的3.45±0.62μg/mL(如图1所示)。7b)。重要的是，小鼠血清中ALT和AST的浓度在HLCs和PHHs中均显著降低到可比较的水平(图一)。7C，d)。人CK 18免疫组织化学染色显示，hlcs可使受体肝脏恢复~3±1.7%。7E还有无花果。S5b，c)。人特异性实时PCR阿鲁序列进一步证实了hlcs在受体肝脏中的定植(图)。7F，g)。因此，人类特异性基因阿尔布，人肝细胞特异性代谢基因Ⅰ期酶CYP1A2和CYP2A6，II相酶UGT1A1，以及人类特有的转运体MRP 2和NTCP在受体肝脏中检测到。S5d)。移植受者在HLC或PHH注射后第7周均未见肿瘤发生。总之，这些数据提示HLCs能整合到URG小鼠肝脏中，改善UPA积聚所致的肝功能障碍。

讨论

近年来，来源于hPSCs的肝细胞由于其巨大的肝再生潜力而受到世界各国的广泛关注。这项研究的目的是开发和描述一种系统，允许有效地产生临床级的高级别的高放细胞.决定命运是使hESCs产生HLC的关键一步。在体内，转化生长因子β和WNT信号协调DE从PS分化。然而，wnt3a在ps诱导中起着重要的作用。55由于Wnt3a成本高、不稳定，我们对Wnt3a替代其它廉价的WNT激动剂(如CHIR 99021)进行了可行性评估。与Wnt3a相比，CHIR 99021处理后24h PS诱导效率较高，但BMP和WNT信号的持续激活对DE的形成有明显的抑制作用。陆恭蕙等人报道bmp或wnt信号抑制足以消除中胚层的形成，但在本研究中没有观察到这一点。42..因此，在诱导DE谱系时，我们随后只删除了CHIR 99021。RPMI-1640+B27是DE分化最常用的基础培养基。为了解决来自常规B27的异种污染的相关问题，本研究使用了一种不含异种的CTS-B27补充剂来诱导DE。克服了对所述细胞因子和其他组成部分的高成本和可变性的关切。27,28通过使用一种确定的化学配方(含转铁蛋白、VC-Mg、胰岛素和亚硒酸钠)，使DE在不添加FBS或KOSR的情况下形成。

为了说明成肝细胞向肝细胞或胆管细胞的双向分化潜能，应通过抑制胆管细胞的形成来产生高纯度的高密度细胞。在本研究中，我们引入tfβ和notch抑制剂来阻止肝成纤维细胞对胆管细胞的诱导，并观察到高纯度hlcs表达高水平的肝细胞特异性标记物，包括：阿尔布, AAT, CK 18，和ASGPR 1..此外，HLCs具有CYP酶活性，并显示出大量成熟肝细胞的功能。然而，HLCs与成体肝细胞并不等价。mRNA水平法新社HFC组高于PHHs组。这可能表明，高级别委员会的分化状态仍处于早期阶段。在未来，协议的区分时间将被延长。此外，许多三维分化系统已经被报道能产生更好地模拟活体情况的成熟肝细胞。24,56,57..因此，可以利用三维培养系统来促进hESCs向成熟肝细胞的分化。ALB阳性细胞百分率为86%.在高级别委员会可用于人类治疗之前，计划进一步了解剩余人口的性质。

为探讨肝细胞对小鼠肝脏再灌流的能力，将URG小鼠脾内注射HLCs。有趣的是，实验结果表明，PHHs移植后白蛋白的分泌仅为3g/mL。然而，邓等人。报道了将PHHs移植到URG小鼠肝脏后，白蛋白的分泌量为150μg/mL。58..原代肝细胞来源变异可能是造成这一差异的原因之一，因为本研究使用了冷冻PHHs。重要的是，肝细胞重新填充1.1-4.7%的肝实质在受体.7周时小鼠的再菌率较低，人白蛋白水平也不稳定。将实验延长到12~16周对提高白蛋白水平具有重要意义。此外，HLC患者血清ALT、AST水平明显降低。因此，我们生成的肝细胞有可能恢复肝功能衰竭。在未来，需要对不同的疾病模型进行进一步的动物研究，以验证HLCs的有效性。

近年来，hESCs通过各种协议产生了HLCs。临床级hlcs的产生不是依赖于一个指导方针，而是依赖于多个要求，这是必须满足的。首先，在gmp条件下，严格执行临床级hesc的生成。31..在用化学定义的系统生成高级别化学品后，根据NIFDC准则进行了一系列与生物安全有关的实验。这些与生物安全有关的试验包括细菌、真菌、支原体、病毒(通过体内和体外方法)、多能细胞残留物、致瘤性试验和生物修复试验(内毒素法和牛血清白蛋白残留法)。这些数据表明，在本研究中，HLCs的安全性与肝治疗学未来应用的有效性验证结果是一致的。

总之，我们开发了一个安全合格的系统，在GMP条件下从hESCs中生成临床级的HLCs.HLCs已被证明是治疗肝衰竭的安全有效的方法，我们的研究结果为基于HLC的细胞疗法的发展提供了一个平台。