Pim1激酶正向调节成肌细胞行为和骨骼肌再生 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

成年骨骼肌损伤后的再生依赖于正常的成肌细胞功能。然而，对肌成肌细胞行为控制的内在机制还没有很好的界定。在此，我们发现Pim1激酶是一种新的肌成肌细胞行为和体内肌肉再生的正调节因子。PIM 1基因敲除对成肌细胞的增殖有明显的抑制作用，加速了成肌细胞的凋亡，提示PIM 1对成肌细胞的存活和扩增至关重要。同时，我们发现在肌源性分化过程中，Pim1激酶表达增加，并从细胞质转移到细胞核。通过应用Pim1激酶抑制剂，证明Pim1活性的抑制阻止了成肌细胞的分化和融合，提示了Pim1激酶活性的必要性。机理研究表明，Pim1激酶与肌源性调节因子MyoD相互作用，调控其转录活性，诱导肌肉特异性基因的表达，从而促进肌源性分化。另外，在骨骼肌损伤小鼠模型中，删除PIM 1阻碍肌肉纤维的再生和肌肉力量的恢复。总之，我们的研究为在体外操纵肌成肌细胞行为和基于成肌细胞的骨骼肌损伤治疗提供了一个潜在的靶点。

导言

骨骼肌由于其固有的干细胞储备，在损伤后具有再生能力。1..骨骼肌干细胞，又称肌卫星细胞，位于质膜和基底层之间，处于静止状态。2..一旦骨骼肌受损，静止的干细胞立即被激活，产生称为成肌细胞的瞬时放大前体。3，进一步分化和融合，形成新的多核肌纤维，或修复现有肌肉纤维受损的部分。1..这些步骤的调控与干细胞中一系列肌源性调节因子的顺序激活密切相关。静止的干细胞高度表达转录因子pax7，而激活的SCs则遵循肌源性谱系的规定，开始表达myf 5、myoD、myogenin和mrf 4，决定成肌细胞进入肌源性分化程序，最终与受损的肌纤维融合以完成再生。4..同时，部分增殖的成肌细胞下调MyoD，维持Pax7，恢复静止状态，补充干细胞池。5.

然而，调节这些形态学和分子事件的肌肉干细胞的内在机制仍然缺乏了解。因此，在某些特殊情况下，如广泛的肌肉损伤和严重的肌病，骨骼肌由于肌干细胞的衰竭或功能缺陷而难以启动再生程序。尽管一些基于肌内成肌细胞移植的实验研究和临床试验显示出了令人鼓舞的结果。6,7,8,9这些结果对移植成肌细胞的存活、扩张和迁移能力的影响仍然是有限的。2,10,11,12..因此，探索干细胞的自我更新、增殖、分化和融合的内在机制，对于干细胞体外行为的操纵以及体内肌肉再生程序的重新启动具有重要的应用价值。

以往的研究表明，神经干细胞的功能受多种信号途径的调控。13,14,15..其中，蛋白激酶是哺乳动物细胞中极其重要的信号蛋白。16，对干细胞功能的调控起着至关重要的作用。例如，蛋白激酶ERK和jnk可以促进干细胞自我更新。17,18，TAK能促进干细胞增殖，抑制分化。19p38MAPK、Lkb 1和JAK能抑制细胞增殖，促进细胞分化。20,21,22..可见，这些已报道的蛋白激酶对干细胞的影响只是反映在一种状态下，或者在促进一种状态，但限制另一种状态。同时，肌肉干细胞在再生过程中的增殖、分化和融合是一个交错的顺序过程。因此，在肌肉再生过程中，对这些蛋白激酶靶点的利用应注意时间窗的选择。一旦申请机会不能很好地掌握，它将导致肌成肌细胞扩张不足或过早分化，这反过来又限制了适当的肌肉修复。这个问题实际上增加了临床应用报告的激酶靶点的难度和风险。因此，本文试图筛选有利于成肌细胞多种状态的新蛋白激酶，揭示其对成肌细胞行为和肌肉再生的影响，为骨骼肌损伤的成肌细胞治疗提供潜在的靶点。

材料和方法

生物信息学

从GEO(GeneExpressionOmnibus，GEO)数据库下载肌肉损伤模型的表达谱微阵列数据。选择野生型对照组和野生型新质蛋白(NTX)治疗组进行再分析。R平台的CLIMA R软件包根据用户指南筛选这两组间差异表达的基因(DEGS)。DEG的识别标准如下：P-数值<0.01。然后对DEGS进行进一步注释，并利用注释、可视化和集成发现数据库(David)v6.8(DAVID)V6.8对这些DEGS中的蛋白激酶进行基因本体论(GO)分析。https://david.ncifcrf.gov/)。在R平台上，通过gggmap软件包绘制了DEGS的火山图和差异表达蛋白激酶的热图。Venn图是通过网站“绘制Venn图”(http：/BioInformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/).

Pim1基因敲除小鼠的产生

PIM 1击倒PIM 1−/−)小鼠来源于生物模型生物(上海，中国)。简单地说，PIM 1−/−缺乏第一外显子第六外显子的老鼠PIM 1利用CRISPR/Cas9介导的C57BL/6J胚胎干细胞基因组编辑方法获得基因。为了获得纯合子，我们培育了杂合子动物。PIM 1−/−老鼠。这个PIM 1−/−用引物5‘-CGTTAGCGCACATTCTG-3’和5‘-GGAGAGTGACAGGGACTTAA-3’对小鼠株进行PCR分型。小鼠在特定的无病原体条件下24±2°C，12：12小时光/暗周期，羊水进入食物和水。所有动物实验程序均符合国家卫生研究院“实验动物护理和使用指南”，并经山东大学医学院动物实验伦理委员会批准(文件号：)。LL-201602035)。

肌肉损伤

在戊巴比妥钠麻醉(50 mg/kg)下，将10μL的NTX(10μg/ml，L 8104，Latoxan)肌肉注射到胫前肌，建立小鼠肌肉损伤模型。在注射后不同时间点取TA肌肉称重，然后在液氮中快速冷冻，保存在−80°C或直接浸泡于4%多聚甲醛中，直至分子和组织学分析。

细胞活力测定

用CCK-8试剂盒根据制造商规程测定C2C12细胞活力。将C2C12细胞接种在96孔细胞培养板上，密度为5000个/孔。接种后24、36、48和60h，将10μL CCK-8溶液加入100μL培养基中，37°C孵育1h，用MultiskanMk3微型平板阅读器测量细胞在450 nm处的光密度。细胞存活率按对照组的比例计算。

增殖和凋亡试验

C2C12细胞以10μM的终浓度孵育2 h，然后用Click-it Edu Alexa Fluor 555成像试剂盒(C 10638，Invitrogen)对细胞核进行染色。采用原位细胞死亡检测试剂盒(11684795910，ROCHE)，根据制造商的指示，采用TUNEL染色法检测细胞凋亡。然后用奥林巴斯BX 63荧光显微镜拍摄图像。位于细胞核内的桔红色Edu点或绿色TUNEL点被定义为增殖或凋亡细胞。计算增殖或凋亡细胞占细胞总数的比例。

荧光素酶活性测定

以24孔板C2C12成肌细胞为载体，转染pim1 K67M-Fg(200 Ng)、MyoD-HA(100 Ng)、E盒特异性4RE-荧光素酶报告子(4RE-Luc)(300 Ng)，进行MyoD转录活性测定。肌球蛋白启动子(1444 Bp)-荧光素酶报告肌球蛋白亲Luc(300 Ng)和肾荧光素酶(RL)报告(20 Ng)使用脂质体2000(Invitrogen)。将转染细胞诱导分化72h，用双Glo荧光素酶分析系统(Promega)微板光度计(Centro LB 960，Berthold)测定细胞的荧光素酶活性。将萤火虫荧光素酶活性归一化为每个转染质粒的肾荧光素酶活性，结果与碱性荧光素酶载体(4RE-Luc)的活性成比例。

肌力测量

通过测定神经刺激后在体肌肉的收缩情况来评价TA肌肉的功能。用戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉小鼠。将膝关节和爪子固定到位，防止其他肌肉群收缩运动，解剖TA肌远端肌腱，用丝结扎连接JZ 101张力传感器(中国上海玉岩仪器公司)。电刺激通过放置在TA肌下的两个针电极刺激胫神经。通过测量强直收缩时对电刺激(55 Hz，300 ms脉冲)所产生的绝对最大力来评估其产生力的能力。用Medlab数据采集和处理系统(Yuyan仪器)收集数据。肌力以肌肉质量为标准，作为特定破伤力的估计值。

统计分析

实验组间差异的统计学意义由一个双尾学生决定。t-使用SPSS13.0软件进行测试23..数据以平均值±SD或平均值±SEM(*)表示。P < 0.05; **P < 0.01; and ***P < 0.001).

结果

骨骼肌损伤后Pim1激酶的上调

为了筛选新的调节骨骼肌再生的蛋白激酶，我们首先从GEO数据库下载了表达谱芯片GSE 67032。对野生型对照组和野生型NTX治疗组的资料进行再分析，用R平台的角膜缘R包筛选DEGS。共获得2703个基因，其中1634个上调，1069个下调。1A)。通过对生物过程和分子功能的GO富集分析，我们从2703 DEGS中获得了89个参与蛋白磷酸化的基因和77个蛋白激酶(图1)。1B，c)。此外，通过这两个GO项的交集，获得了73个基因。1D)。Pim1是调节蛋白磷酸化的上调蛋白激酶之一。1E).

然后，用NTX肌肉注射法建立骨骼肌损伤小鼠模型，验证Pim1的表达。如前所述24Pim1的34 kDa亚型在全细胞裂解免疫载体中表现为两条带：高分子的磷酸化带和低分子的非磷酸化带。在本研究中，westernblot和qPCR结果表明，注射NTX后第3天和第7天，TA肌肉中Pim1蛋白和mRNA表达均显著上调，第14天和第28天恢复正常(见图)。1F，g)。重要的是，本研究中pim1上调的时间窗与成肌细胞增殖和分化的高峰相一致。5提示Pim1激酶可能参与成肌细胞介导的骨骼肌再生过程。

Pim1激酶是成肌细胞体外增殖和存活所必需的

为了更好地了解Pim1对成肌细胞行为的影响，我们通过LV-shPim1或Lv-Pim1感染建立了Pim1低表达和过表达的C2C12成肌细胞株。与预期的一样，感染Lv-shPim1可有效降低C2C12成肌细胞的Pim1蛋白水平(如图1所示)。2A)。如CCK-8实验所示，LV-shPim1感染以时间依赖性的方式抑制细胞的存活。2B)。相反，Pim1的过表达增强了C2C12成肌细胞的活力(图1)。2C)。同时，在lv-shpm 1感染后细胞活力下降的同时，细胞增殖也明显减少，这表现为edu数量的减少。+细胞(图1.2D，e)。同时，我们观察到TUNEL的增加。+细胞(图1.2F，g)在Pim1低表达的C2C12成肌细胞中，提示Pim1基因敲除促进了C2C12成肌细胞的凋亡。这些结果表明C2C12成肌细胞的增殖和存活依赖于Pim1激酶。与C2C12细胞株的结果一致，Pim1基因敲除也抑制了原代培养的成肌细胞的增殖，Pax 7的比例明显降低。+和MyoD+细胞(图1.2H-k).

Pim1激酶在肌源性分化过程中被上调，并从细胞质转移到细胞核。

为了探讨Pim1激酶与成肌细胞分化的关系，我们首先用免疫荧光法检测了Pim1激酶在增殖分化的干细胞中的定位。令我们惊讶的是，在干细胞增殖过程中，Pim1激酶存在于细胞质中，但在分化过程中主要转移到细胞核中(如图1所示)。3A)。然后，我们分析了Pim1在整个细胞裂解物中的表达在分化过程中的作用。值得注意的是，qPCR和westernblot显示Pim1mRNA和蛋白在C2C12细胞分化过程中逐渐增加。3B，c)。亚细胞分馏研究表明，在分化后第3天，胞质Pim1蛋白增加1.9倍，细胞核Pim1蛋白增加2.8倍。三维空间)。重要的是，细胞核Pim1在免疫球蛋白中被显示为较高部分的磷酸化带，而胞浆中的Pim1则是非磷酸化的(如图1所示)。三维空间)。我们进一步将野生型Pim1质粒和激酶活性Pim1K67M质粒导入C2C12成肌细胞。免疫荧光显示，在分化过程中，激酶活性的Pim1K67M没有转移到细胞核中(如图1所示)。3EPim1激酶的活性是其核易位所必需的。

核内Pim1激酶通过介导MyoD活性促进成肌细胞分化

为了进一步评价细胞核内Pim1激酶活性对成肌细胞分化的要求，我们在诱导分化过程中用Pim1激酶抑制剂TCS处理C2C12成肌细胞和原代成肌细胞。免疫荧光显示，抑制Pim1活性可抑制C2C12细胞和原代成肌细胞的肌原性分化和融合，其分化指数和融合指数均低于对照组。4A-f)。同时，TCS可抑制肌源性调节因子肌原素、肌肉结构蛋白MyHC和融合相关蛋白的表达，并呈剂量依赖性。4G)。同样，qPCR结果显示肌肉特异性基因的mrna水平显著下降(MyoG，Tnni2，Ckm，Mylpf，Acta 1，Mymk，和Mymx)参与TCS治疗后的肌源性分化和融合。4H).

为了探讨pim1激酶促进肌源性分化的机制，我们重点研究了肌球蛋白D，这是一种基本的螺旋-环螺旋(Bhlh)肌源性调节因子，推动成肌细胞分化为肌管。25,26..Pim1活性的抑制并不降低分化的C2C12细胞MyoD的蛋白表达。沙一)，而MyoD靶向基因的mRNA表达。肌球蛋白, CKM, Tnni2)明显受到抑制(图1)。4H)。因此，我们推测Pim1激酶的活性参与了MyoD依赖的转录激活。为了验证这一假设，我们分析了由MyoD结合核心序列控制的萤火虫荧光素酶报告质粒4RE-luc的活性。肌球蛋白萤火虫荧光素酶报告质粒肌球蛋白用荧光素酶报告法检测C2C12细胞的启动子)。如图所示。4i，j，pim1k67M质粒和pim1抑制剂tcs均能显著抑制pim1k67M质粒的活性。肌球蛋白亲吕克。为了探讨Pim1对MyoD转录活性的影响，我们对转染Lv-Fag-Pim1的C2C12细胞进行了共免疫共沉淀(Co-IP)实验。如图所示。4K用标记抗体对核蛋白进行共ip实验，发现Pim1与MyoD在分化后4天内相互作用。此外，共焦图像显示Pim1和MyoD在C2C12核和原代肌管之间有很强的共聚焦(图1)。4L, S2)。综上所述，Pim1激酶与肌源性调节因子MyoD结合，促进其转录活性，诱导肌肉特异性基因的表达，从而促进肌源性分化。

PIM 1−/−小鼠无肌病，但肌肉再生不足。

我们PIM 1击倒PIM 1−/−)小鼠通过切除第一外显子-第六外显子PIM 1基因通过CRISPR/Cas9-介导的基因编辑系统。5A)。所有小鼠均能存活，并通过尾部基因分型进行鉴定。5B)。首先，我们分析了其体重、肌肉重量和形态。PIM 1−/−小鼠和野生型(PIM 1+/+)年龄相配组的小鼠。在12周的随访中，体重PIM 1−/−小鼠明显低于对照组(图1)。5C-E)，表现为整体生长迟缓。但TA和气体肌肉湿重占体重的比例与对照组无明显差异(图1)。5F，g)。H&E染色也显示PIM 1−/−从出生到12周龄，小鼠没有出现以中央有核肌纤维为特征的严重肌病(如图所示)。S3).

以决定是否删除PIM 1在体影响骨骼肌再生，我们建立了10-12周龄ntx诱导的肌肉损伤模型。PIM 1+/+和PIM 1−/−雄性老鼠。值得注意的是，在生理盐水和ntx处理的离体TA肌肉中，pim1的mRNA和蛋白几乎完全缺失。PIM 1−/−老鼠(图1.5H, S4)，这确保了PIM 1TA肌肉中缺失基因。第一，PIM 1−/−小鼠在伤后7天表现出明显的细胞增殖阻滞，Pax7的数量明显减少就反映了这一点。+细胞(PIM 1+/+13.34±3.15%PIM 1−/−(6.86±2.81%)。5i，j)。mhc(emyhc，肌肉再生的早期标志)在层粘连蛋白染色中阳性肌纤维的频率在pim1的TA肌中显著降低。−/−小鼠伤后5天。5K，l)。其次，我们用组织学方法分析了Pim1在再生过程中对肌肉纤维形态的影响。相比较PIM 1+/+小白蚁，PIM 1−/−在损伤后14天，小鼠表现出肌肉再生受损，可见较小的纤维CSA，其中心位于细胞核(图1)。5米，n)。这些变化反映了伴随着延迟再生的肌肉结构的重塑。PIM 1−/−小鼠，作为损伤TA肌肉的相对重量PIM 1−/−在这段时间内，小鼠并没有减少(见图)。S5)。除了形态学外，我们还研究了Pim1缺乏的小鼠肌纤维再生受损是否改变了肌肉收缩功能。我们观察到肌肉收缩明显减少，这表现在Pim1受损的TA肌肉中破伤力的显著下降。−/−小鼠伤后第14天(图1)。5o，p)。总之，这些发现表明删除PIM 1骨骼肌损伤时限制肌纤维再生，延缓肌力恢复，强调了PIM 1对骨骼肌修复的要求。

讨论

Pim1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于Moloney小鼠白血病病毒(Pim)激酶家族的前病毒整合位点，由三种不同的亚型(Pim1，Pim2，Pim3)组成。27..根据分子量和细胞定位，pim1激酶包含两个亚型，一个位于细胞膜上的长44 kDa亚型，另一个位于细胞质和细胞核中的短34 kDa亚型。28,29..Pim1激酶在细胞中表达时具有结构活性，其活性与其表达水平直接相关。此外，翻译后修饰(如磷酸化或去磷酸化)也会影响pim1的活性。29,30.

从功能上看，研究证明34 kDa Pim1在细胞增殖、凋亡、线粒体完整性、细胞衰老、心肌损伤、狼疮性肾炎和阿尔茨海默病等多种细胞过程和疾病中发挥着重要作用。29,31,32,33,34,35,36,37,38..重要的是，作为JAK/stat信号通路的直接靶基因。21,39,40Pim1激酶也参与免疫调节和炎症反应。促炎症因子促进Pim1的表达，抑制Pim1活性可减少炎症因子和趋化因子的产生。41..此外，炎症参与哺乳动物几乎所有的生物过程。因此，Pim1激酶可能通过介导炎症反应发挥其作用。同时，新的证据表明，损伤后肌肉的再生需要适当的免疫反应和炎症信号，从而协调有效的肌肉干细胞功能。7,19,21,42,43,44,45..因此，基于上述推理，我们推测Pim1激酶可能是干细胞介导的骨骼肌再生的重要调节因子。

本研究通过对正常肌肉和受损肌肉的表达谱筛选、生物信息学分析和肌肉损伤小鼠模型的实验验证，发现Pim1激酶在肌肉再生过程中被上调。这种上调发生在肌肉损伤后的第3天和第7天。有趣的是，有证据表明，骨骼肌损伤后3天内，许多炎症因子和趋化因子的产生也急剧增加。7,42,44..因此，我们推测肌肉损伤后Pim1的上调可能是由于炎症因子的刺激和JAK/STAT信号通路的激活所致，但这一推断还需要进一步的实验证据。更重要的是，神经干细胞的增殖高峰也出现在伤后3~4天，然后在伤后6~14天进入分化融合阶段。5..Pim1上调的时间窗与SC增殖和分化的高峰期相一致，提示Pim1激酶可能参与了SC的成肌细胞分化进程。

接下来，我们建立了肌肉损伤模型。PIM 1−/−探讨Pim1激酶在骨骼肌再生中的作用。发现删除PIM 1显示中央核的肌纤维CSA明显减少，提示Pim1激酶对正常肌肉再生至关重要。由于干细胞是肌纤维再生的最终执行者，我们在不同的阶段进一步探讨了Pim1激酶对干细胞行为的影响。Pim1激酶在促进细胞增殖和抑制细胞凋亡方面具有重要的作用，本文发现Pim1基因敲除对成肌细胞的增殖有明显的抑制作用，加速了成肌细胞的凋亡，提示Pim1对成肌细胞的存活和扩增是必要的。6)。此外，我们还发现Pim1的表达水平和亚细胞定位在肌发生过程中发生了变化。Pim1主要定位于增殖性成肌细胞的细胞质，但分化后PIM 1被上调并转运到细胞核(图1)。6)。此外，在分化的肌管中，细胞核的Pim1被磷酸化，而细胞质的Pim1则未磷酸化。巧合的是，最近的一项研究强调，Pim1的功能作用取决于细胞内在人心脏前体细胞中的定位。46..提示心肌细胞核磷酸化Pim1的上调可能与肌源性分化有关。通过使用Pim1激酶抑制剂，我们证明Pim1活性的抑制阻止了成肌细胞的分化和融合，提示Pim1激酶的活性是合适的肌发生所必需的。6).

图6：图6显示了Pim1激酶在肌肉再生过程中对成肌细胞的调节模式和MyoD转录活性。

关于其机制，先前的研究证实pim1参与bhhlh转录因子c-myc依赖的转录激活。47..有趣的是，肌源性调节因子myoD也是bhlh结构域的转录因子。25,26..在本研究中，MyoD的直接靶点在Pim1抑制作用下被下调。因此，我们推测Pim1激酶可能通过介导MyoD的转录活性来促进成肌细胞的分化。通过Co-IP实验和荧光素酶活性测定，我们发现Pim1与肌源性调节因子MyoD相互作用，转染激酶活性不活跃的Pim1质粒，或应用Pim1抑制剂显著抑制MyoD依赖的转录激活，提示Pim1激酶活性通过控制bHLH成肌调节因子MyoD的转录活性，在一定程度上促进了成肌细胞的分化。

总之，我们首次证明了Pim1激酶是骨骼肌成肌细胞功能和骨骼肌再生的正调节因子，为骨骼肌损伤的基于成肌细胞的治疗策略提供了新的思路和实验依据。