TLR7/8激动剂R848对胰腺癌肿瘤和宿主的影响 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

癌症研究中的一个优先事项是创新不仅对肿瘤进展有效的治疗方法，而且要解决诸如恶病质等限制生命质量和数量的共同问题。我们证明TLR 7/8激动剂R 848能诱导胰管腺癌(PDAC)小鼠抗肿瘤反应和减轻恶病质。在体内，三种细胞系中的两株肿瘤均为R 848敏感，导致肿瘤体积变小，免疫复杂性增加，CD8增加。+T细胞浸润和活性降低，Treg频率降低。R 848小鼠表现出行为和分子恶病质的改善，使存活时间增加近一倍。敲除小鼠的研究表明，TLR 7是R 848介导的反应所必需的，而不是肿瘤。在病人样本中，我们发现TLR 7在胰腺肿瘤各期间质中普遍表达，但在上皮中表达。TLR 7表达是相对罕见的。这些研究表明，包括R 848在内的免疫增强方法可能对PDAC和癌症相关恶病质有帮助。

导言

近年来，随着肿瘤免疫治疗领域的进展，许多高效的治疗方法被开发出来，以提高抗肿瘤免疫能力。其中一些方法，如免疫检查点抑制剂和过继细胞转移，已经证明对一部分癌症患者有好处。1,2..不幸的是，尽管这些进展对多种形式的癌症，免疫治疗方法对胰管腺癌(PDAC)缺乏。中位生存期为6个月，5年生存率为8%，PDAC的结果仍然黯淡，迫切需要新的治疗方法。3..由于PDAC缺乏有效的免疫治疗反应，许多生物学理论被认为是潜在的障碍，包括PDAC中的肿瘤微环境具有深刻的免疫抑制作用。在胰腺癌中，不仅免疫细胞浸润稀少，而且大量的T细胞抑制性髓系细胞被认为干扰了抗肿瘤免疫反应的各个阶段。4,5..这些因素表明，要创造成功的PDAC免疫治疗途径，必须改变这些肿瘤的免疫状态。

在PDAC中重建肿瘤免疫成分和功能的一个很有前途的策略是抑制髓样细胞和淋巴样细胞共同的促肿瘤炎症信号通路，包括Toll样受体(Toll样受体)。TLR的刺激不仅导致肿瘤微环境中髓系细胞活性的改变，而且增强了适应性免疫的活性和特异性。例如，最近的研究强调，刺激tLR 7，这是一种传统上与病毒应答相关的内体ssRNA受体，降低了T细胞上pd-1(程序化细胞死亡蛋白1)的表达，并增强了CD8。+T细胞毒性反应6..TLR 7激动剂包括天然的ssRNA和小分子，如咪唑喹啉和苯并氮卓类。7咪唑喹啉类药物在结构上与TLR 7激动剂的结构相似，包括食品和药物管理局(FDA)批准的咪喹莫特及其更有效的对应类雷西莫(R 848)。8小分子TLR 7激动剂已在皮肤科恶性肿瘤，包括基底细胞癌中获得成功。9，但需要对其他类型的癌症进行进一步优化。虽然TLR 7在胰腺癌病变中大量表达10目前对PDAC治疗性TLR 7刺激的研究尚不多见。

另一个未被探索的问题是，与传统的化疗相比，靶向免疫疗法对恶病质和治疗相关毒性的效果如何。恶病质是癌症的一种常见和毁灭性的共病，它限制了治疗的选择，降低了生活质量，增加了死亡风险。11,12..对于像PDAC这样的恶性肿瘤来说，这是一个高度相关的临床问题，其中高达80%的患者患有恶病质。13,14..许多化疗药物通过独立导致厌食症、体重减轻、肌肉萎缩和疲劳而诱发或加重恶病质。15,16..急性全身炎症反应，通常是由免疫疗法引起的，导致诸如发烧和疲劳等不良事件。17..根据治疗结果是治疗对肿瘤和宿主的影响之和的观点，评价免疫治疗策略对肿瘤和宿主生理的影响是至关重要的。

在本研究中，我们研究了TLR 7/8激动剂R 848是否在同基因原位(OT)小鼠PDAC模型中引起抗肿瘤反应，以及这类治疗对PDAC相关恶病质是否有益或有害。此外，我们还利用定量多重免疫组织化学(MIHC)和流式细胞术揭示了TLR 7激动剂是如何改变肿瘤免疫微环境的。对荷瘤动物进行恶病质状态行为和分子表型分析，探讨R 848的疗效，探讨R 848的安全性。在建立了肿瘤负担和恶病质严重程度的证据后，我们确定了R 848在肿瘤微环境中的作用是依赖于间质瘤还是肿瘤细胞TLR 7。最后，为了探讨R 848在人类人群中的治疗活性，我们比较了R848的间质和上皮表达。TLR 7和相关的RNA-序列分析(RNA-seq)在激光捕获显微切割人病变跨越胰腺肿瘤各阶段的转录本。

结果

R 848降低PDAC肿瘤负担和改变肿瘤微环境

tlr激动剂用于多种恶性肿瘤的诱导抗肿瘤免疫。9,18,19,20，我们假设这可能发生在PDAC的上下文中。此外，我们推测，这种反应将取决于肿瘤上皮细胞因子调节免疫细胞的吸收和新抗原的质量，这两者都是CD8的必要组成部分。+T细胞介导的抗肿瘤免疫。为评价R 848诱导抗肿瘤反应的效果，将3种kras中的一种植入动物体内。LSL.G12D/+p53LSL.R172H/+PDX-CRE(KPC)源性肿瘤细胞系(KxPxCx，FC 1199，FC 1242)或假手术(Sham)。将每株细胞植入C57BL/6小鼠体内，采用无瘤性腹腔内(IP)或手术OT途径，作为探讨胰腺炎症在药物反应中的作用的一种手段。植入后2天，将小鼠随机分为体重、身体成分和基础食物摄入的协变量，然后分配给每日R 848或车辆，直至研究终点。在肿瘤反应研究中，所有组的实验终点都是末期恶病质的发作或在任何实验臂达到最大肿瘤负荷。

3株KPC衍生细胞系中有2株在终点时肿瘤体积明显减少，在植入法的基础上无敏感性差异(图1)。1A)。在最敏感的R 848细胞株中，KxPxCx的抗肿瘤效应在IP种植中更为明显(减少71.7%)，P < 0.005) than OT implantation (56.6% reduction, P < 0.01). In the second R848-sensitive cell line, FC1242, sensitivity was also greater for IP implantation (57.0% reduction, P < 0.0001) than that of OT implantation (19.7% reduction, P < 0.05). No tumor mass differences were observed between R848 and vehicle treatment for cell line FC1199 with any method of implantation. For cell line KxPxCx, R848 resulted in decreased extra-pancreatic tumor growth, without gross evidence of invasion of lymph nodes, mesentery, liver, or other abdominal structures.

对肿瘤端点进行组织学分析，目的是阐明R 848反应变异的结构和细胞相关性。所有细胞系的OT植入都会产生胰腺肿块，符合中到低分化的PDAC(如图所示)。1B)。用R 848处理的KxPxCx和FC 1242移植动物的肿瘤表现为淋巴细胞浸润增加和瘤内淋巴样结构形成(图一)。1B、箭)。相反，来源于FC 1199的肿瘤的组织学检查没有显示淋巴样结构或增加淋巴细胞浸润的反应R 848。这些结果共同表明，在R 848治疗过程中，上皮依赖于免疫细胞的聚集和活动。

用流式细胞术比较治疗10天后载体和R 848处理的KxPxCx肿瘤的肿瘤免疫群体频率(图1)。1C)。CD 45的总频率+白细胞在R 848治疗的肿瘤中增加，T淋巴细胞和髓样细胞的数量都有广泛的差异(图一)。1D)。CD3频率+CD8+T细胞经R 848处理后增加一倍以上(图1)。1D-e)(2.27%CD 45)+(车辆)对5.23%CD 45+(R 848)，P < 0.01). CD3+CD4+T细胞频率在R 848处理后增加(2.39%CD 45)。+(车辆)对4.17%的CD 45+(R 848)，P < 0.01). Among CD3+CD4+细胞，FOXP 3的比例+调节性T(Treg)细胞经R 848(34.86%)CD4治疗后明显下降。+(车辆)与25.07%(R 848)比较，P < 0.01) (Fig. 1E)。尽管在组织学上存在瘤内淋巴样结构，但B细胞频率没有整体差异。

在粒细胞群中，经R 848处理后，中性粒细胞增多(占CD 45的21.48%)。+事件车辆与R848的比例分别为31.53%和31.53%P < 0.05). Both total macrophages (CD45+F4/80+)和CD11c−巨噬细胞随R 848呈上升趋势，但无统计学意义。用R 848治疗后，两者均为CD11b+和CD11b−树突状细胞(CD 45)+MHCII+CD11c+)频率下降(合并；3.75%CD 45)+事件车辆和R848的比例分别为1.39%和1.39%P < 0.0001). Similarly, monocyte (CD45+MHCII−CD11b+)治疗后频率下降(占CD 45的24.12%)+车辆对CD 45的7.98%+R 848，P < 0.0001).

为了深入研究肿瘤免疫微环境，采用23标记定量mIHC(实验管道和门控策略)，对经载体或R 848治疗的KxPxCx肿瘤组织切片进行原位分析。1)21..该方法允许在同时进行空间定位的情况下量化肿瘤的细胞组成。这一方法揭示了R 848导致CD 45的总体增加。+细胞穿过肿瘤的边缘和核心，免疫细胞的复杂性和功能状态都发生了广泛的变化(如图所示)。2A，b和附图。2, 3).

与流式细胞仪分析相一致，R 848不改变B细胞的相对比例(CD 45)+CD3−B 220+)(2.83%CD 45)+(车辆)对2.82%(R 848)。然而，尽管大多数B细胞在接受药物治疗的肿瘤中扩散到肿瘤实质，但R 848治疗的肿瘤显示淋巴团的形成频繁(如图所示)。2F和补充图。4)。CD3+CD4+T细胞也显示出普遍的增长(0.27%的总量(车辆)与0.60%的总量(R 848)，P < 0.05), with significant changes to CD3+CD4+子集频率(附图)2C)。TLR 7激动剂促T作用机制的研究H1分化22，最常见的CD3+CD4+R 848治疗肿瘤的谱系为GATA 3。−Foxp 3−罗格特−，共同代表TH0和TH1个细胞(34.11%CD3)+CD4+在车辆和R 848分别为41.86%和41.86%，P < 0.05). In contrast, the most common CD3+CD4+经药物治疗的肿瘤细胞亚群为Tregs(35.97%)。+CD4+细胞在车辆和19.07%的R 848，P=0.001)。

对抗肿瘤免疫，CD8的重要性+经R 848处理后，T细胞更集中，分布于上皮和间质间。2C，d)(占细胞总数的0.85%(车辆)和2.5%(R 848)，P < 0.0001). CD8+T细胞密度从84.6个/mm增加到236.2个/mm。2经R 848治疗后(P < 0.0001) (Fig. 二维空间)。此外，颗粒酶B+CD8+处理后T细胞密度增加(21.62个/mm)2车辆对71.09单元/毫米2R 848，P < 0.0001), indicating improved cytotoxic effector function. R848 increased the cell density of proliferating CD8+用Ki 67(55.87个/mm)评估的T细胞2车辆对164.1 R 848，P < 0.0001). R848 also resulted in increased CD8+T细胞表达TIM3(0.68%与2.739%R 848，P=0.001)和Eomes(0.47%的车辆对1.43%的R 848，P < 0.01), reflecting their varied differentiation and/or functional state. Within cell populations pertinent to T cell function, decreases in programmed cell death ligand-1 were observed among PANCK+肿瘤细胞(30.30%)和CD11b(20.69%R848)+细胞(16.20%的车辆和12.83%的R 848)，然而，这些变化没有接近统计学意义。

CD 45细胞亚群分析+密集肿瘤区显示，在免疫细胞富集区，R 848处理后巨噬细胞从平均0.55%增加到8.08%。P < 0.01, n=20个感兴趣区域/组，补充图。3C)。R 848处理后巨噬细胞的CSF1R阳性率相对升高，CD 206阳性率下降(补充图)。三维空间)。CD 45+富集区R 848的粒细胞浸润也从平均1.93%增加到4.41%(P < 0.01). However, dendritic cells were decreased from a mean of 1.5% CD45+车载肿瘤细胞CD 45为0.54%+R 848肿瘤细胞(P < 0.001).

R 848耐受性好，可改善PDAC恶病质表现。

尽管TLR激动剂对肿瘤反应有积极的作用，但对其潜在的系统性毒性仍存在着重要的关注。事实上，癌症恶病质是一种经常致命的共病，人们普遍认为它是一种炎症反应障碍。因此，确保恶病质不会因改变全身炎症信号的免疫治疗而恶化是至关重要的。为评估小鼠的耐受性，将3株KPC衍生细胞系(KxPxCx、FC 1199、FC 1242)中的一株或给予假手术(Sham)，并分配给R 848或车辆治疗，然后追踪摄食量、体重、运动活动和体温(图1)。3)。与已知的TLR激动剂的作用一致，R 848治疗诱导导致短暂的吞咽和体重减轻。在此阶段之后，R 848处理的小鼠在恶病质前期表现出与车辆处理的kpc荷瘤小鼠相当的食物摄入量。然而，正在进行的R 848治疗增加了恶病质期食物的摄取量，超过了车辆处理的肿瘤动物在所有三种细胞中的摄取量(如图所示)。3A-c)。与未经治疗的KxPxCx相比，R 848处理的KxPxCx荷瘤小鼠最初出现了明显的腹胀和体重增加，但随着治疗的进展，小鼠经历了随后的体重减轻和腹胀消退(如图所示)。三维空间)。相反，FC 1242和FC 1199没有产生腹水，而接受R 848的小鼠在疾病后期不受体重减轻的影响(图1)。3E-f)。在恶病质前期，用R 848治疗的KxPxCx小鼠在运动方面表现出与治疗相关的减少，但在疾病后期，相对于车辆治疗的受试者，其运动能力有所改善(图一)。第三代).

虽然车辆处理的KxPxCx小鼠在恶病质期变得低温，但R 848处理的KxPxCx小鼠在整个研究过程中明显降低了低温(图一)。3H)。重要的是，单用R 848治疗没有出现发热或体温过低的现象。在假手术对照组中，R 848只导致体重和食欲的短暂下降，表明对R 848的疾病反应是暂时的，可以用适当的剂量动力学来克服(图1)。3A，b)。这些发现联合表明，R 848是可以忍受的，特别是当交付在一个一致的重复给药时间表。

R 848降低PDAC相关性恶病质的心肌和瘦质分解代谢

为了评价肿瘤负荷和R 848对机体组成的总体影响，采用核磁松弛法测定肿瘤植入前和身体解剖前的瘦质量和脂肪。在所有的细胞系中，肿瘤负担导致了瘦组织和脂肪组织的消耗(图一)。4A，b)。对于KxPxCx，R 848处理的小鼠比车辆处理的小鼠表现出更好的瘦质量保持能力(P < 0.05). No improvements were noted in fat mass retention in any cell line tested.

在尸检中，R 848并不能导致假手术动物肌肉分解代谢，但不能挽救KxPxCx植入引起的肌肉损失(图一)。4C)。经R 848处理后，骨骼肌分解代谢基因信号有明显改善。与载体处理的kxpxcx移植小鼠相比，R 848处理的小鼠e3泛素连接酶减少。马弗克斯和MuRF 1，以及转录因子Foxo 1..对84份与肌变和肌病相关的转录本进行了骨骼肌靶向阵列谱分析，并将假操作动物与携带R 848的荷KxPxCx动物进行比较(附图)。5).

主成分分析显示，R 848修饰骨骼肌转录体，使其比载体治疗的荷瘤动物更接近假手术动物(如图所示)。4D)。在这些转录本中，有21份在α=0.05倍变化>2.0比一个或多个实验组(图1)。4E)。在r 848之后，骨骼肌基因转录更像假手术动物，除了促炎细胞因子外。IL1b和肌肉分化修复转录因子Myod1，将R 848处理的KxPxCx移植小鼠与载体处理的KxPxCx移植小鼠和健康对照小鼠进行比较。

除了改善骨骼肌的分子生理学外，用R 848处理的KxPxCx荷瘤动物还显示出保存的心脏肿块(P < 0.05 vs. vehicle-treated KxPxCx, n.s. vs. sham). Quantitative reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR) of cardiac muscle demonstrated that R848 decreased expression of 马弗克斯和MuRF 1，而自噬相关转录本在恶病质期心脏组织中常被上调(Bnip 3, CTSL, 加巴拉普)(图1.4F).

R 848对PDAC过程中下丘脑和全身基因表达的影响

癌症恶病质通常被认为是由肿瘤与多种生理系统之间的致病串扰引起的。随着肿瘤负担的成功减轻，周围组织中异常的炎症信号可能因恶病质相关的肿瘤源性介质的丢失而改善。由于食欲和行为的改善，下丘脑被询问与恶病质相关的炎症转录本的变化。与先前的研究一致，kxpxcx同种异体移植引起的恶病质引起了车辆处理的动物下丘脑炎症，同时增加了cachexia的表达。塞普, IL1b, IL1r1, TLR 7, CCL 2，和伊坎1(无花果)4G和补充图。6A)。用R 848治疗后，下丘脑炎症基因在这些转录本中的一部分表达减少，其中包括IL1b和塞普，但这些变化并没有达到统计学意义。

考虑到肝脏在处理炎症刺激中的中心作用，我们假设R 848和肿瘤负担都会对肝脏基因表达产生影响。与以前的研究一致，我们发现肿瘤负担导致肝脏升高。IL1b, IFNA, Lcn 2, 装甲运兵车, CRP，和Orm 1(无花果)4H)。当R 848交付给健康的假手术动物时，这些转录本没有改变。然而，用R 848处理的KxPxCx动物的肝脏与其他实验组相比有明显的炎症特征。两个转录本，细胞因子IL1b和IFNA，与单用车辆相比，R 848对荷瘤动物的影响更大。P < 0.0001 and P < 0.01, respectively, analysis of variance (ANOVA) with Tukey’s test). One transcript, the acute stress response signal Lcn 2，在R 848和载体治疗的荷瘤动物(P < 0.0001 vs. sham-operated vehicle for both groups). However, three classical acute phase reactants, 装甲运兵车，ORM 1，和CRP，与载体相比，R 848治疗的荷瘤动物明显减少，与肿瘤负荷相关的炎症反应减少相一致。

作为评估肿瘤进展和R 848治疗过程中全身免疫反应的另一种手段，对脾脏进行了大体形态、组织学和细胞组成的研究。由于KPC肿瘤负担和R 848治疗，坏死时脾脏肿块明显增加(补充图5)。6B)。从R 848处理的荷瘤动物脾脏组织学分析显示，白色牙髓扩张，与反应性淋巴样增生相容(附图)。6C)。用流式细胞仪检测R 848处理的KxPxCx移植动物的脾脏CD11b，与载体处理的kxPxCx动物相比，CD11b增加。−CD11c+树突状细胞(P < 0.0001), a decrease in monocytes (P < 0.01), and an increase in CD3+CD4+T细胞(P < 0.05) (Supplementary Fig. 6d)，提示R 848后树突状细胞向淋巴组织的转运增多。

连续R 848治疗延长小鼠PDAC存活时间

当R 848改善肿瘤负担和恶病质时，我们接下来将研究这是否转化为生存的变化，以及治疗时间如何影响这些结果。因此，我们包括两个R 848治疗臂的生存分析：一个五剂量的“爆裂”给药方案和连续给药方案(图一)。5A)。动物的生存时间比较，而被跟踪的恶病质。连续使用R 848可使kxpxcx移植动物的存活时间增加近一倍，35天存活率达到12.5%(中位存活15天的车辆与28天连续处理的R 848相比，对数秩检验)。p < 0.0001) (Fig. 5B)。相比之下，R 848的爆裂治疗可以适度延长生存期，但只有一小部分患者有持续的反应(中位存活15天的车辆与17天的爆裂治疗的R 848相比，日志等级检验)。P=0.056)。尽管老鼠在疾病晚期接受了R 848治疗，但相对于车辆治疗的KxPxCx，小鼠的食物摄入量在大多数研究中都得到了改善(图一)。5C)。在研究过程中，R 848连续处理的小鼠体重继续下降，表明可能存在药物毒性或持续吞咽不足的结果(图一)。5D)。除了延长存活时间外，接受R 848治疗的小鼠在开始治疗后数周内表现出正常行为，包括身体疾病体征减少(补充电影)。1).

R 848的抗肿瘤作用是由宿主介导的，而不是肿瘤性的TLR 7介导的。

TLR激动剂对肿瘤免疫功能的影响可归因于肿瘤细胞、基质细胞、宿主或二者的联合作用。虽然早期的结果表明，上皮因子介导R 848反应，但治疗后肿瘤免疫复杂性的变化使我们推测R 848诱导的肿瘤免疫也需要间质瘤TLR 7。由于TLR 7是一个X-连锁基因，用含有TLR 7半缺失的雄性小鼠(TLR7KO)来质疑宿主TLR 7在R 848介导的肿瘤反应中的作用。TLR 7KO小鼠植入R 848应答的KxPxCx肿瘤细胞，追踪肿瘤生长和恶病质。6A)。与TLR 7-充分小鼠的结果相反，KxPxCx-移植的TLR 7KO小鼠与载体处理的小鼠相比，肿瘤生长增加(图1)。6B，c).

由于TLR 8在小鼠中不敏感咪唑喹啉，因此我们预计TLR 8对TLR 7KO小鼠的宿主没有影响。的确，虽然与治疗诱导相关的食物摄入量或体重并没有减少，但由于这些不良反应在小鼠体内被靶向和完全通过TLR 7介导，治疗组在恶病质期开始明显发散。KxPxCx-移植的TLR7KO动物经R 848治疗后，厌食症和体重减轻明显比车辆治疗的动物严重(图一)。6d-f)。同时，含KPC的TLR7KO动物经R 848治疗后，瘦块丢失加重(图一)。6g)，骨骼肌分解代谢。6I)，以及心脏萎缩。6J)。这些结果证实了宿主而非肿瘤性TLR 7对R 848的有益作用是必要的，并证实了如果不受免疫反应的抑制，TLR 7的活性可能会增加肿瘤负担。

TLR 7在人胰腺肿瘤间质中的表达

根据肿瘤间质中是否存在TLR 7的差异效应，我们利用激光捕获人胰腺病变的RNA-seq文库，研究了肿瘤区R 848反应基因的频率。为了确定胰腺上皮内瘤变(Panin)和导管内乳头状粘液瘤(IPMN)和PDAC两种病变的表达在疾病发展过程中是否存在差异。绝大多数样本表示基质。TLR 7，包括12/12 IPMN样本、23/23 Panin样本和111/124 PDAC样本(图)。7A). TLR 7上皮标本中含量较少，其中8/19份IPMN标本中至少有1 TPM，7/26份Panin样本，59/197份PDAC样本(图1)。7b)。虽然一般认为小鼠TLR 8是不活跃的，但人TLR 8的表达量很高，并且对包括ssRNAs和咪唑喹啉在内的配体有反应。我们发现TLR 8显示了类似于TLR 7跨期胰腺肿瘤，大多数间质细胞至少有一个TPM表达，只有少数上皮细胞呈阳性。TLR 8表达式(图1.7C，d)。编码TLR 7胞内穿梭蛋白TLR 7非协调同源基因93 B1((Unc93b1)，典型地存在于上皮和间质中，表明将TLR 7传送到其活跃的信号室的机械是完整的(如图所示)。7E，f)。这些数据表明，大多数胰腺肿瘤患者的肿瘤基因表达谱符合TLR 7激动剂的治疗反应。

讨论

在本研究中，我们证明R 848改变了PDAC中的肿瘤免疫微环境和宿主反应，并最终与存活率的改善有关(图一)。8)。R 848诱导的抗肿瘤反应主要表现为三级淋巴结构的形成，CD8的增加。+T细胞浸润有明显的活化和细胞毒性作用，并降低Treg浓度，所有这些都与人类恶性肿瘤的预后改善有关。23,24,25..基于TLR 7缺失宿主缺乏肿瘤减轻和恶病质恶化的特点，我们报告R 848的有益作用需要宿主而不是肿瘤性TLR 7。鉴于并不是所有的上皮性PDAC肿瘤细胞对R 848表现出肿瘤反应，我们发现R 848的敏感性还依赖于肿瘤细胞的内在因素。这与最近的工作相一致，说明肿瘤细胞的内在因素影响肿瘤的免疫微环境，包括T细胞浸润的程度和在PDAC期间对联合免疫治疗的反应能力。26..虽然TLR 7激动剂与急性疾病反应有典型的联系，但我们观察到，持续的治疗会导致疾病反应的快速性，而不会减弱治疗效果。抗肿瘤反应加上缺乏持续性疾病，导致恶病质的改善和治疗过程中组织分解代谢的减少。这代表了与许多细胞毒性化疗的一个关键区别，并表明某些类型的免疫治疗可能对恶病质相关恶性肿瘤的治疗有好处。

越来越多的免疫治疗方法显示出相当大的前景，如肿瘤疫苗、细胞因子、单克隆抗体和免疫刺激小分子，但临床应用中仍然存在关键的未知因素。27,28..与T细胞检查点抑制剂有关的免疫相关不良事件很常见。29..免疫治疗优化可能会变得更加复杂，因为其他的临床变量，如恶病质被考虑。患有恶病质的PDAC患者的选择往往令人吃惊地狭窄，即使是最成功的治疗方案，如FOLFIRINOX，对组织消瘦患者的治疗效果也会降低。30,31..恶病质增加了癌症治疗过程中的并发症，降低了治疗耐受性，是PDAC临床试验中生存时间的一个关键决定因素。31,32,33..然而，随着进一步的优化，免疫疗法有可能提供有效的肿瘤反应，而不像细胞毒性化疗那样具有同样程度的全身毒性。

最近的几项研究强调了TLR 7激动剂的双重利与弊潜力，它们作为抗肿瘤药物有很大的前景，但会引起急性毒性。34,35,36..事实上，我们观察到治疗诱导与急性吞咽功能减退、体重减轻和运动活动降低有关。然而，这些作用迅速脱敏，与TLR 7活性在免疫中的紧密调控作用一致。值得注意的是，最近的研究表明，TLR 7/8/9拮抗剂imo-8503改善了Lewis肺癌恶病质模型的瘦质量保持和减少肌肉分解代谢，而肿瘤大小没有任何变化。37..基于这一发现，我们推测，我们在肌肉中观察到的保护作用是通过治疗性诱导免疫耐受，在宿主组织水平上对致病性TLR 7信号脱敏所致。然而，肿瘤内在因素也可能介导恶病质的减少.与TLR 7/8/9在LLC中的拮抗作用不同，R 848可以减少大多数PDAC细胞株的肿瘤大小。然而，根据FC 1199来源的肿瘤对R 848没有反应，但动物在恶病质方面仍有改善，R 848很可能在宿主组织中赋予肿瘤外部保护信号。

TLRs是先天免疫系统的组成部分，对病原体中常见的分子基序作出反应。38..TLR 7和TLR 8都是检测多种富含嘌呤的ssRNA的内质体受体。8..在小鼠中，TLR 7主要表达于类浆细胞树突状细胞和B细胞，并在巨噬细胞和T细胞亚群中表达。39..在炎症刺激后，TLR 7被泛素化，并由内质网(ER)常住伴侣UN93B1将其包装成COPII包被的小泡。40,41..TLR 7信号在与ssRNA结合后，产生促炎细胞因子和Ⅰ型干扰素、T细胞增殖和T细胞诱导。H1份答复42,43..我们在用R 848治疗的PDAC肿瘤中观察到许多这些元素，包括CD8。+T细胞增殖和效应功能降低H2 CD4极化+T细胞然而，具有TLR 7激动剂的R 848对免疫群体的广泛改变意味着在恶性肿瘤期间对许多免疫细胞系的广泛影响。

癌症的一个主要特征是通过肿瘤微环境内的免疫抑制信号逃避免疫。44..这一特点在PDAC中很常见：局部免疫抑制和结构障碍，例如间质增生，都是治疗的主要挑战。tLR 7激动剂imiquimod被fda批准为一种治疗基底细胞癌的单一药物，而tlr 7激动剂的潜力正在扩展到其他恶性肿瘤。9..在某些情况下，单用TLR 7刺激T细胞就足以产生抗肿瘤反应：纳米粒给药R 848至CD8。+T细胞可提高小鼠结直肠癌模型的抗肿瘤免疫能力，延长生存期。20..TLR 7激动剂还显示联合阿霉素治疗T细胞淋巴瘤有好处。19，接种膀胱癌疫苗18，并结合放射治疗在胃肠道肿瘤中的应用45.

虽然本研究没有采用组合疗法，但对于进一步研究TLR 7/8激动剂作为联合治疗的一部分的有效性和耐受性，仍有很强的理论依据。单用单一疗法，R 848治疗的KPC来源小鼠最终发展为肿瘤进展，导致恶病质和死亡率。有趣的是，对R 848的不良反应，如吞咽不足和体重减轻，显示出相对快速的脱敏动力学，但长期给药时，抗肿瘤反应则要强得多。这提示R 848的系统不良反应和抗肿瘤反应可能是由不同类型的细胞介导的，具有不同的信号动力学和受体调节功能。用肿瘤坏死因子观察到中枢神经系统免疫耐受和抗肿瘤反应的类似解偶性，表明这种现象可能发生在不同的环境中。46..事实上，大多数病原体相关的分子模式和损伤相关的分子模式在重复刺激后表现出行为性快速反应，类似于r 848最初的疾病反应。17,47..相反，细胞毒性化疗没有观察到有限的病程反应，从而导致剂量依赖性的有害效应。48，或与急性和慢性免疫相关的不良事件相关的检查点抑制剂。29..因此，使用TLR 7/8激动剂，低剂量或较短疗程的其他治疗可以在不加重恶病质的情况下获得有效的肿瘤反应。

进一步的研究将是至关重要的，因为这类药物是评估临床使用。我们使用胰腺癌的同基因OT模型来避免全胰功能障碍的风险，这种风险可能发生在基因工程的小鼠胰腺癌模型中，并干扰了对恶病质的评估。由于基因工程小鼠模型能更准确地再现肿瘤生物学，未来的工作应该利用这些模型来评估TLR激动剂。此外，还将有助于评估恶病质的其他方面，包括肌肉力量、运动表现、耐力以及行为的认知和情感成分。

作为成功地将这些发现转化为临床应用的一部分，有几个因素是很重要的。最重要的是TLR 8在小鼠和人类之间赋予不同的配体特异性。咪唑喹啉类药物虽然能同时刺激人TLR 7和TLR 8，但不与小鼠TLR 8结合，只引起小鼠TLR 7依赖的信号转导。49,50..R 848被用于这些研究，因为它比tLR 7特异性imiquimod强得多。8..然而，在临床使用之前，R 848对肿瘤内、外生物学的影响还需要在表达TLR 8的模型系统中进一步研究。或者，一种有效的tLR 7特异性激动剂可用于翻译这些研究，如CL 097或852 a。51..先前使用系统性TLR 7激动剂的临床试验与毒性有关，包括发热和疲劳。52然而，我们的数据表明，这些影响是严重的，而不是慢性的。我们认识到，导致急性毒性的药物在人类试验和临床应用中提出了独特的挑战。然而，具有比这里描述的更严重的毒性的药物在临床肿瘤学中是普遍存在的。事实上，许多化疗方法不仅与厌食和体重减轻有关，而且对心脏、骨髓、肺、神经、肾脏、胃肠道等构成重大风险。53,54,55,56,57..然而，由于与癌症进展相关的发病率和死亡率，这些风险被接受。虽然目前尚不清楚胰腺癌患者是否能耐受全身给药模式，但现有的外用咪喹莫特的临床数据和我们对系统R 848的小鼠研究都鼓励长期使用这类药物。

最后，这些结果强调了用整个动物生理学方法评估免疫治疗效果的重要性。PDAC的结果可以被认为是两个领域的总和：肿瘤本身和疾病发生的宿主。在同样的肿瘤负担水平上，一个更有复原力的宿主相对于虚弱的宿主将有更好的结果，恶病质患者的发病率和死亡率的增加就说明了这一点。PDAC最有效的治疗模式应该是有效的治疗原发肿瘤，并系统地发挥中立或有益的作用。虽然并非所有形式的免疫治疗都会对宿主的病理如恶病质产生积极的影响，但在我们努力改善胰腺癌的结果时，像R 848这样具有局部和全身性益处的药物将是非常有价值的。

方法

实验设计

本研究的主要目的是在PDAC临床前模型中同时评估肿瘤和恶病质对免疫治疗R 848的反应。此外，我们旨在揭示有关观察抗肿瘤免疫的必要成分的机制数据，包括肿瘤异质性和间质免疫受体表达的影响。最后，我们试图验证抗肿瘤反应所需的机制因素是否存在于大量的胰腺肿瘤标本中。为了评估恶病质的预后和肿瘤的反应，我们使用了最近在我们的实验室开发的一种小鼠PDAC相关的恶病质模型。58..用三种不同的肿瘤细胞系解释了药物反应中的肿瘤异质性。以TLR 7基因敲除小鼠为研究对象，探讨宿主生物学在R 848应答中的作用。人类数据被用来进行临床相关性的基因表达模式，我们发现是必要的良好的R 848反应。样本大小的选择根据先导数据评估肿瘤的终点肿块和厌食症在恶病质期。对任何定性分析，包括组织学解释，都进行致盲。如下文各分节所述，事先指定了端点和数据收集。

动物

雄性C57BL6/J小鼠(JAX，目录编号000664)和TLR 7−/y将小鼠背交至C57BL6/J背景(JAX，目录号008380)，在26°C和12 h光/12h暗周期条件下进行实验。向动物提供了获得水和食物的机会(啮齿动物饮食5001；Purina Mills)。在植入前一周，动物被转移到个人住房以适应实验条件。每天监测动物的摄食量和体重，在1200-1300小时内进行治疗，所有研究均按照NIH“实验室动物护理和使用指南”进行，所有规程均得到俄勒冈州卫生和科学大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的伦理评价和研究批准。

KPC衍生肿瘤细胞系

kpc模型表达双杂合子敲入胰腺特异性条件等位基因kras。G12D和TP 53R172H通过PDX-1-CRE驱动器，是PDAC的首选模型，因为它密切重述人类疾病.为了研究KPC来源的肿瘤，代表肿瘤细胞异质性的光谱，我们使用了三种上皮性肿瘤细胞系，每种细胞系都来自同一基因C57BL6背景下的不同的KPC小鼠。这些服务由Elizabeth Jaffee博士(KxPxCx)和David Tuveson博士(FC 1242和FC 1199)慷慨提供。59,60..这三种细胞均为男性细胞系，均为快速表达。TLR 7(补充图。7和源数据档案)。细胞在rpmi 1640中添加10%胎牛血清、1%最低必需培养基(非必需氨基酸)、1mm丙酮酸钠和50 U/mL青霉素/链霉素(吉布CO)，孵化器保持在37°C和5%CO。2.

PDAC模型的生成与治疗范式

8周龄男性C57BL/6J野生型或TLR 7−小鼠骨科或IP植入10只。6KPC衍生肿瘤细胞或等量生理盐水，2天后随机分为ip R 848(10g)或载体，直至终点。R 848来自恩佐生命科学(#NC 9739083)。在比较恶病质状态和肿瘤免疫反应的研究中，所有动物在任何研究臂出现末期恶病质或超过IACUC指南的肿瘤负担时都被杀死。末期恶病质是根据食物摄入量而不是体重来定义的。这是因为在这个模型中，当宿主组织的丢失与肿瘤肿块的生长同时发生时，很难量化活体物体的瘦质量变化。因此，我们采用定量指标(持续绝对每日摄食量<1.5克)和定性指标(身体检查结果，包括驼背或呼吸不足的证据)来评估恶病质状态。在交叉比较肿瘤和恶病质反应的研究中，所有组都是在任何一组中的大多数受试者证明有末期恶病质的证据时被杀死的。在比较生存期的研究中，个体受试者在IACUC发病后被杀死-这是死亡行为的指定迹象。

肿瘤固定与组织学

肿瘤标本用福尔马林固定，石蜡包埋，切片作进一步分析。苏木精和伊红染色通过对实验组(TKM)认证的病理学家评估肿瘤分级和免疫细胞特性。

流式细胞术

杀瘤后，用磷酸盐缓冲液灌流荷瘤小鼠，清除血管免疫细胞。在Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(DMEM)中收集肿瘤，然后在含有1.0mg/mL胶原酶IV(吉布科，#17104~019)、1.0mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂(吉布科，#17075~029)和50 U/mL DNase 1(#10104159001)的DMEM中进行酶切和酶解。样品在37℃下孵育30 min，在125 r.pm.下搅拌，通过100 M细胞过滤器过滤，400×离心。g在4°C下培养5 min，再悬液，立即进行流式细胞术染色。补充表中可找到标记细胞的抗体和试剂1..流式细胞术在BD Fortessa上进行，数据用Flowjo软件进行分析。

多重免疫组织化学染色

来自车辆和R 848处理的kxpxcx植入动物的典型肿瘤用一个23标记mihc面板染色，如前所述。21..简单地说，肿瘤用多聚甲醛固定，石蜡包埋，染色前立即切片.用于顺序染色的抗体在补充表中作了说明2..采用抗大鼠(Nichirei Bioscience，#414311 F)和抗兔(#414144 F)的组织芬单染最大试剂(#414144 F)，用AEC(VectorLab，SK-4200)进行染色。将幻灯片放在水中，然后用Leica Aperio对每一个标记物进行扫描。苏木精染色在第2周期和最后一周期后进行，以识别细胞并解释任何组织损失。

多重免疫组化分析

应用ImageScope软件(Leica)选择5个固定大小的ROI(5000×5000像素)作为样本，占肿瘤横截面积的50%以上。ROIS平均含有47，476个细胞(范围：28，236~61，573个)，平均每个肿瘤分析的细胞数为237，380个(范围：165，960~266，659)。使用MATLAB中的SURF算法对所有标记进行ROIS登记。将注册区域导入斐济-ImageJ，利用反褶积从背景中提取AEC信号，生成单细胞分割掩模，在此基础上生成融合的伪彩色图像作为感兴趣的标记。用细胞轮廓仪测量每一节段细胞的每个标记的平均强度。将输出导入FCSExpress 6.0图像细胞计量学中，通过门控层次对每个标记的真实、正或真负值进行手动加门和图解，以直观地验证每个细胞的表达。在补充图中描述了识别细胞类型和功能标记的分级选通策略。1B..结果输出到SPSS(IBM)和Orange(卢布尔雅那大学)进行非监督聚类分析，并生成描述细胞身份和激活状态的热图。采用PRISIS 8.0软件进行统计学分析，并按规定对每一个ROI或每个肿瘤进行分析.

恶病质与肿瘤结局分析

每天监测动物的食物摄入量和体重，用被褥筛子来解释食物溢出的原因。在5 min的记录间隔时间内，通过植入Minimitter跟踪装置测量体温和自发运动活动(MiniMitter，Bend，OR，USA)。体成分在指定时间点用EchoMRI核磁共振弛豫测量法评估。肉眼盲于治疗组进行尸检，测量肿瘤、心脏、腓肠肌和脾脏的质量。所有离散性肿瘤肿块均包括在重量测量中。立即将肿瘤、下丘脑、心脏、腓肠肌和肝脏保存在RNAlater进行基因表达分析(Ambion)。

基因表达测定

组织匀浆后，用RNeaseMini试剂盒(Chiagen)纯化RNA，然后用高容量cDNA反转录试剂盒(LifeTechnologies)进行反向转录。用Taqman试剂和补充表中列出的引物探针进行qRT-PCR。3，用ddCT方法将其归一化为18S。采用肌变和肌病RT2型剖面仪(#PAMM-099Z，Chiagen)对腓肠肌进行基因表达分析。原木2-转化表达值导入Orange，从每个转录本的平均值归一化为SDS，并进行主成分分析(PCA)和无监督聚类分析。

人胰腺肿瘤间质和上皮细胞的RNA-seq

为了比较肿瘤组织中R848反应元件在基质细胞和上皮细胞中的表达，我们使用Panin、IPMN和PDAC的人队列查询了一个RNA-seq数据集。61样本标准化为每百万份转录本进行分析，并按表达水平和转录本的总阳性率进行分层。TLR 7, TLR 8，和Unc93b1.

统计

采用棱镜8.0软件进行统计分析。在两组的横断面分析中，我们进行了T-测试，当大于两组时，用TUKEY‘s检验对所有实验组进行多次比较，或用Sidak试验将其与单个对照组进行比较。为了纵向比较恶病质的参数，将数据分为前恶病质和恶病质两种。在恶病质期，这些变量的差异仅存在于各组之间，其定义是与对照组相比，食物摄入量持续减少10%或更多。在恶病质期，我们对试验组和试验时间的主要影响、相互作用进行了双向方差分析，并对主柱效应的多重比较进行了Tukey检验。对于生存数据的解释，我们并不期望影响的大小取决于暴露的持续时间，我们也不认为差异会在相对较早的时间点出现，因此我们选择了对数秩检验来比较各组的中位生存和危险比。所有统计检验均为双尾分析。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料，可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

数据可用性

与本研究有关的所有数据均可在主要文本或补充材料中查阅。与流式细胞术、定量多重ihc、rt2轮廓器阵列数据、激光捕获微切割rna-seq和细胞系相关的扩展信息可作为源数据档案。