toll样受体(TLR) 2和4的信号通路在身体的防御入侵的病原体在肺炎球菌脑膜炎。 而一些研究支持他们的重要性在先天免疫,从而防止主机死亡率,任何作用在保护神经功能在脑膜感染难以读懂的。 这里我们研究急性免疫反应和长期运动实验小鼠肺炎球菌脑膜炎的后果缺乏TLR2和TLR4。 没有这些通常明显受损的老鼠intracerebroventricularly注射中生存链球菌引起的肺炎。 在感染的急性期,TLR2/4-deficient老鼠interleukin-1β脑脊液浓度较低,和更高的interferon-γ,比野生型同行。 抗生素治疗后,TLR2/4双缺陷与加重小鼠的行为障碍,如昼夜hypolocomotion所示在适应阶段的Intellicage TLR-deficient小鼠与野生型同行相比。 虽然TLR2/4双缺陷并不影响小鼠的认知能力在巡逻任务,它严重损害的认知灵活性。 我们得出结论,TLR2和TLR4是中央在肺炎球菌脑膜炎调节宿主炎性反应,这可能调解多样化的补偿机制,保护主机不仅对死亡率,而且长期的神经并发症。
侵入性感染中枢神经系统(CNS)链球菌引起的肺炎经常引起化脓性炎症蛛网膜,蛛网膜下腔和软脑膜称为肺炎球菌脑膜炎。 尽管抗生素和免疫预防的感染是可以治愈的并不少见,肺炎球菌脑膜炎的病死率在发展中国家仍高得令人无法接受1。 神经和系统性并发症继发肺炎球菌脑膜炎是已知的导致死亡2。 肺炎球菌脑膜炎仍然是一个医疗紧急情况,没有准确诊断和及时的治疗,导致患者或急性死亡,幸存者,持久的神经心理后遗症,包括听力障碍、视觉上的缺陷,精神苦闷、认知障碍和癫痫发作1,3.。
无害的居住,年代。肺炎只在鼻咽出现在超过一半的人口,尤其是儿童4。 在健康的条件下,肺炎双球菌禁止进入血液循环的天然保护屏障,如呼吸道粘液、溶菌酶和肺炎球菌IgA1蛋白酶。 当无症状携带者,或人与运营商的密切联系,遭受破坏免疫力,可能发生肺炎球菌入侵进入循环系统; 如果置之不理,外围的免疫细胞,细菌可能随后穿过血脑屏障(BBB),进入脑实质和脑脊液(CSF)。 肺炎双球菌的存在在中枢神经系统认可的模式识别受体(PRRs)表达的先天免疫细胞,如小胶质细胞和星形胶质细胞。 关键PRRs包括toll样受体(TLR) 2、lipotechoic激活的酸5,6,7由pneumolysin TLR4(激活)8TLR9识别(由肺炎球菌CpG-DNA激活)9,以及nucleotide-binding oligomerisation域受体(NLRs)各种内源性和外源性刺激感10。
研究与目标删除toll样受体的小鼠显示TLR2和TLR4的重要性在推动肺炎球菌脑膜炎的发病机理,在封锁TLR2和/或TLR2/4信号导致宿主细菌清除受损,加重临床症状和严重的神经系统并发症11,12,13,14。 基因删除TLR下游效应器,骨髓分化主要响应88年MyD88蛋白,干扰白介素(IL) 1和地震信号15在免疫反应,导致严重的赤字16,17,以及听力障碍18在实验肺炎球菌脑膜炎。 这些研究表明宿主细菌清除率之间的联系和疾病严重程度由于特异表达宿主炎性反应在老鼠TLR2/4信号中断。 与此一致的是,基因的单核苷酸多态性(SNP)负责细菌传感及其相关下游信号已经涉及的预后,和容易细菌感染19,20.。 虽然TLR2 + 2477 G / A多态性与提高肺炎球菌脑膜炎的风险21与某些SNP pneumococcus-infected人TLR4增加患侵袭性疾病的风险22。 此外,儿童或患者il - 1中的某些snp receptor-associated激酶4 (IRAK4)基因、核因子k B (NF - kB)激活基因,和MYD88,与侵入性肺炎球菌疾病的易感性增加有关,经常复发23,24,25,26。 缺陷患者的白细胞IRAK4例如,已被证明在体外对脂多糖(LPS)刺激27。 尽管这些观察,toll样受体信号之间的联系和肺炎球菌脑膜炎的神经认知后遗症幸存者以前没有确定,我们在目前的研究集中在这个问题上。
通常2和4都能够弥补缺乏的其他分子的急性肺炎球菌性脑膜炎免疫和炎症反应11,28。 在目前的研究中,我们评估了急性颅内脑脊液细胞因子年代。肺炎感染小鼠缺乏TLR2和TLR4。 同时,我们测量受感染动物的神经认知活动具有相同遗传缺陷antibiotic-cured,这是一个长期的神经模型建立问题导致的肺炎球菌脑膜炎29。 我们提出,缺乏TLR2和TLR4信号通路会改变先天免疫反应在急性肺炎球菌脑膜炎,在一定程度上通过调节炎症细胞因子的产生,从而影响疾病产生的长期的神经的结果。
没有抗生素治疗,所有老鼠患上了致命的临床体征和安乐死(无花果。1)。 生存曲线的比较证明巨科动物疾病严重程度的增加(p= 0.002,Log-rank (Mantel-Cox)测试)。 累积发病率1.5天后是超过两倍的巨科相比WT老鼠(64% vs 31%)。 另一方面,WT的生存曲线和巨科老鼠没有显著不同CEFT抗生素治疗肺炎球菌脑膜炎时启动20 h p。(无花果。1 b)。
基因删除功能通常2和4明显损害老鼠集中注射的生存年代。肺炎。 WT =野生型; 巨科=基因敲除。 肺炎球菌脑膜炎疾病过程的WT(满广场)和巨科(空缺平方)小鼠监控到天9 post-inoculation (p。*5×105cfu年代。肺炎/鼠标)时(一个抗生素头孢曲松治疗时不管理或()B)治疗开始20 h p。死亡事件被记录,当老鼠患严重疾病迹象要求安乐死。 数据作为生存的比例在每个时间点,总n = 25 WT或26巨科老鼠在三个独立的实验。 * *p< 0.01,生存率较。
炎症介质的浓度化验,IFN-γ,il - 6, IL-1β,脑脊液TNF和CCL2,升高的WT和巨科感染小鼠早在20 h pi sham-treated同行相比(图。2)。 细胞因子的浓度IFN-γ、il - 6和TNF和趋化因子CCL2 WT之间没有显著差异和脑膜炎巨科动物,但显著降低IL-1β集中观察脑脊液巨科(p= 0.005)。 在44 h p。 IFN-γ的CSF水平,il - 6, CCL2仍然高企WT和巨科感染动物的基因型(无花果。2 b)。 CSF IFN-γ水平被发现明显高于WT同行相比,巨科(p= 0.020)。 这些观察是一致的部分免疫调节的作用通常2和4在肺炎球菌脑膜炎、急性期操作协同或独立。
基因缺失的功能通常2和4修改小鼠肺炎球菌脑膜炎的炎症反应。 IFN-γCSF水平的il - 6、IL-1βTNF和CCL2测量(一个)20 h p。 我和(B)24 h后第一个剂量的抗生素治疗(= 44 h p。)。 抗生素治疗开始在20 h p。 我所有的老鼠。 WT =野生型; 巨科=基因敲除。 老鼠总n = 2 - 3 / WT或巨科虚假的组或n = 6 - 8 / WT或巨科脑膜炎组。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001,计划comp埃里森sham-inoculated和脑膜炎组之间的基因型以及WT和巨科脑膜炎组之间在对数转换数据。
如我们之前所示的研究30.,C57BL / 6 j小鼠缺乏TLR2和TLR4不同于相当于WT老鼠的探索性行为和认知,IntelliCage来衡量。 占两个基因型相关的基础行为差异,基因型的多因素方差分析组效果应用或δ值的每个行为参数被抵消的基础值量化和分析sham-treated动物相关的基因型。
笼子里探索的行为、室角落搜索和饮酒的老鼠在一个角落室评估通过测量频率的角落里访问,访问nosepokes访问和水瓶舔,分别在最初的5 h (FA当老鼠第一次暴露(R1)和气鳔(R2)小说IntelliCage环境光,其次是黑暗、阶段。 这些行为也测量日适应时期。
TLR2/4不足加重post-meningitis行为异常:pneumococcus-infected幸存(“点”)WT和巨科老鼠表现出昼夜角落访问的频率显著降低,与nosepokes访问,访问和未感染的同行相比,舔在最初的5 h勘探FA范式在他们第一次接触(增刊。 表格1部分),重新接触(R2) IntelliCage(增刊。 无花果。1)。 巨科集团三角洲访问频率的分析发现一个更大的差异比WT动物R1(无花果。3:基因型效应F(29日)= 4.79,pR2 = 0.037),减少(图3)。 另一方面,巨科集团表现出较大的差异与nosepokes访问和访问与R1的舔,这些在R2(图变得更加突出。3 b:基因型x的时间,F(1.36,36.67)= 7.53,p= 0.005; 无花果。3 c:基因型效应,p= 0.009; 基因型x的时间,p= 0.001)。 这表明一个大大大日探索性行为减少幸存的巨科老鼠WT同行相比。
缺陷通常2和4月初加剧长期昼夜hypolocomotion自由适应小鼠存活由于头孢曲松治疗肺炎球菌脑膜炎(post-meningitic老鼠,点)。 自TLR2/4不足影响探索性行为未受感染的老鼠30.,相应的δ值的访问频率(一个),访问nosepokes (B)和舔的访问(C)提出了补偿控制老鼠的平均值。 总n = 12 - 14每虚假的组或n = 15 - 17日脑膜炎组。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001、混合GLM重复方差分析的措施。 注意统计分析在累积垃圾箱收集5 h段10分钟时间。 本一个更大的时间(30分钟和10分钟)用于图形清晰。 (缩写:巨科=基因敲除。 WT =野生型)。
随后的光周期,探索性行为在整个前5 h的黑暗周期进行评估。 在R1,没有显著的基因型效应当角落访问的频率在暗相比较的最初5 h点老鼠和sham-infected之间动物(增刊。 表格1b部分)。在R2, WT点老鼠被发现显示一个更高层次的corner-visiting活动比他们sham-infected控制(增刊。 无花果。2:组F(29日)= 2.17,p= 0.152,组xF(1.16,33.56)= 4.23,p= 0.042)。 相比之下,一个重要的组效果没有巨科动物。 δ访问频率的分析,然而,没有显示出显著的基因型效应(图。4)。 另一方面,夜间访问的频率与nosepokes或舔点的显著低于假老鼠的基因型在R1(增刊。 表格1b部分)(增刊。 无花果。2 b, C分别)。 明显大巨科集团组差异被发现时相比WT组三角洲访问与分析了nosepokes(无花果。4 b:基因型F(29日)= 5.44,p= 0.027),但不是δ访问时舔了(图4摄氏度)。 一个重要组或基因型影响但是没有在R2(数据没有显示)。
缺陷通常2和4中轻度改变夜间行为在早期dark-phase自由适应小鼠存活由于头孢曲松治疗肺炎球菌脑膜炎(post-meningitic老鼠,点)。 自TLR2/4不足影响探索性行为未受感染的老鼠30.R2的访问频率,相应的δ值(一个在R1),访问nosepokes (B在R1)和访问舔(C)是由各自的平均值减去虚假的团体从个人鼠标活动水平。 夜间的数据访问和nosepokes舔R2和夜间的角落里没有显示访问R1巨科集团由于缺乏WT或影响(指增刊。 无花果。2为集团影响pre-converted数据)。 总n显示在无花果。3.。 *p< 0.05,整体基因型效应分析了混合GLM重复方差分析的措施。 注意统计分析在累积垃圾箱收集5 h段10分钟时间。 本一个更大的时间(30分钟和10分钟)用于图形清晰。 (缩写:巨科=基因敲除。 WT =野生型)。
总的来说,这些结果表明,老鼠TLR2/4信号的缺失加剧了长期点效应,导致恶化周日下午巨科小鼠行为活动减退。
混合方差分析的探索性行为适应阶段表明,点老鼠WT和巨科基因型显示显著降低角落访问,访问nosepokes访问和舔sham-infected同行相比在R1(增刊。 表格1和R2(增刊,c)。 无花果。3.)。 进一步评估角δ值的访问在R1总体上显示出明显的基因型效应(无花果。5:F(27)= 20.41,p在R2 < 0.001),但不是在R1,表明一个更大的由于TLR2/4缺陷点的影响。 当访问nosepokes也获得了类似的结果(图5 b:基因型F(26)= 22.96,p< 0.001),但不能访问与舔(无花果。5度),进行分析。
Post-meningitic (PM)小鼠缺乏TLR2/4信号显示恶化昼夜hypolocomotion长期在适应阶段。 所有数据来自测试协议(R2)。 周日角落访问的频率(一个)在每一个为期两天的免费适应(FA)、nosepoke适应(NA)和喝酒适应(DSA)是总结。 自TLR2/4不足影响探索性行为未受感染的老鼠30.,相应的δ值角落互访(A)提出了基因型差异与肺炎球菌脑膜炎。 同样,与nosepokesδ值的访问(B和舔C从适应阶段绘制)。 总n如无花果所示。3.。# # #p< 0.001,整体基因型效应分析了混合GLM重复方差分析的措施。 * *p< 0.01,* * *p< 0.001,基因型的影响,分析了费舍尔的迷幻药。 WT =野生型; 巨科=基因敲除。
在适应阶段的黑暗周期R1,基因型效应显著的总体组织和访问频率的角落,访问nosepokes和访问与舔(增刊。 表格1d部分)。另一方面,分析三角洲R2值从总体上显示出明显的基因型效应在角落访问频率(图。6:F(1,25)= 4.31,p= 0.048),访问nosepokes(无花果。6B:F(1,25)= 7.56,p= 0.011)和访问舔(无花果。6摄氏度:F(26)= 6.02,p= 0.021),表明小得多的组老鼠巨科骗局和点之间的区别。
Post-meningitic (PM)小鼠缺乏TLR2/4信号显示改善夜间多动症在长期的适应阶段。 所有数据来自测试协议(R2)。 夜间角落访问的频率(一个)在每一个为期两天的免费适应(FA)、nosepoke适应(NA)和喝酒适应(DSA)是总结。 自TLR2/4不足影响探索性行为未受感染的老鼠30.,相应的访问频率(δ值的角落一个)提出了对基因型差异与肺炎球菌脑膜炎。 同样,三角洲的频率与nosepokes访问(B和舔C在每个适应阶段)绘制。 总n如无花果所示。3.。#p< 0.05,整体基因型效应分析了混合GLM重复方差分析的措施。 *p< 0.05,基因型的影响,分析了费舍尔的迷幻药。 WT =野生型; 巨科=基因敲除。
总之,周日的表现hypolocomotion CEFT治疗后康复后小鼠肺炎球菌脑膜炎加重TLR2/4不足。 相比之下,夜间多动症是改善没有TLR2/4信号在肺炎球菌脑膜炎。 对表型,TLR2/4-associated点在R2 R1效果更明显。
老鼠的反应不同的光刺激测量来评估他们的偏好或回避行为。 去角落里显示的频率光刺激是使用简单的对比分析,参考类别组在基线水平相当于访问特定百分比角落DSA的第二天。 类似的行为反应观察光刺激R1和R2,因此只在R2提出观察(增刊。 无花果。4)。 在R2中,一个重要的点影响WT和巨科老鼠被视为减少偏爱着篮板点老鼠相比sham-infected等价物(WT:F(24)= 26.59,p< 0.001; 巨科:F(22)= 7.07,p= 0.014)。 随后,点老鼠的基因型表现回避行为对一个篮板,不断照亮,没有检测到的表型sham-infected控件(WT:F(24)= 57.47,p< 0.001; 巨科:F(22)= 24.17,p< 0.001)。 多因子的方差分析基因型组的相互作用在每个类型的光刺激没有显示出显著的基因型效应,暗示类似程度的改变光反应WT点老鼠和那些缺乏TLR2/4信号,对相应的虚假的控制。 下午在一起,这些结果表明,影响短期和长期变化鼠标灵敏度TLR2/4-independent光刺激。
分析学习性能的老鼠受到R1的简单的巡逻任务多因子的方差分析显示,学习能力无显著差异WT与巨科点老鼠。 当老鼠随后受到复杂的巡逻任务,我们发现类似程度的学习缺乏WT点老鼠巨科相比,他们的等价物。
当他们被重新测试在同一任务R2, WT和巨科点老鼠表现受损表现简单的巡逻任务相比,各自sham-infected控制(增刊。 无花果。5:WT组F(21)= 13.44,p= 0.001; 巨科集团(F(18)= 43.40,p< 0.001)。 多因子的方差分析显示没有明显的基因型影响小鼠的性能水平。 此外,点老鼠的基因型没有执行的未感染的同行以及复杂的巡逻任务,通过重要的集团效应(增刊。 无花果。5 b:WT组F(19)= 74.83,p< 0.001; 巨科集团F(19)= 41.24,p< 0.001)。 所有小鼠同样减少了访问非随机分配给他们参考角落既简单又复杂的巡逻任务,不仅在第一(R1,数据未显示),但第二曝光(R2,增刊。 无花果。4 c, D)的任务。 因此,我们得出结论,老鼠学习能力在这个任务中没有明显影响TLR2/4缺乏症。
当老鼠受到空间逆转任务(R1),首次巨科点老鼠表现出显著降低性能相比于虚假的等价物,没有观察到一种现象在WT动物。 巨科sham-infected绩效水平之间的差异和点老鼠不但是造成显著的基因型效应分析的多因子的方差分析,这意味着学习障碍与TLR2/4无关。 当老鼠开始歧视逆转任务时,显示的点老鼠的基因型表现不佳而相应的未感染的同行(WT组F(22)= 4.58,p= 0.044; 巨科集团F(20)= 25.75,p< 0.001,图没有显示)。 没有观察到显著的基因型的影响。
当老鼠气鳔同一套测试范例在R2,巨科点老鼠再次显示,空间逆转学习赤字的任务(图。7一个:F(20)= 9.40,p= 0.006)。 财政赤字也表现在WT点老鼠(图。7一个:F(23)= 5.63,p= 0.026)。 多因子的方差分析显示,点老鼠的基因型经历了类似的空间逆转的损害程度的任务。 当他们气鳔歧视逆转任务,WT和巨科点老鼠表现出显著降低性能水平相比,他们虚假的控制(图。7 b:WT组F(20)= 13.66,p= 0.001); 巨科集团F(16)= 46.79,p< 0.001)。 值得注意的是,在巨科这个赤字更明显点老鼠,一个显著的基因型的集团效应是由多因子方差分析发现F(36)= 5.92,p= 0.020)。 空间和歧视逆转任务,虚假的或点老鼠的基因型是能够识别参考,演示了通过减少他们的访问概率低于25%水平R1和R2(增刊(数据未显示)。 无花果。6 a、B)。
TLR2/4信号调节post-meningitic老鼠(PM)的长期执行能力。 所有数据来自测试协议(R2)。 正确的访问量百分比测定(一个)空间和(B)歧视逆转的任务。 总n如无花果所示。3.。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001,对每个测试组影响天分析了费舍尔的迷幻药。@p< 0.05、混合GLM重复方差分析的措施。 WT =野生型; 巨科=基因敲除。
总之,长期认知损伤的老鼠在视觉歧视任务是严重缺乏TLR2/4信号在急性肺炎球菌脑膜炎。
TLR2和TLR4表达抗原递呈细胞,分别有肺炎球菌lipoteichoic酸6和pneumolysin8从而引发一系列炎症反应对肺炎球菌感染。 炎症过程导致杀菌效果被认为同时引起神经系统并发症,可以解决在复苏,如脑水肿,或与长期神经心理问题有关,如听力损失,心理压力和认知障碍31。 神经系统后遗症下午详细的病理机制仍知之甚少。 使用一个小鼠模型建立,目前研究表明部分角色TLR2和TLR4-mediated急性炎症反应在长期的神经调制的结果在小鼠生存由于CEFT治疗肺炎球菌脑膜炎。
TLR激活启动MyD88和TIR domain-containing适配器诱导IFN-β(TRIF)信号通路来驱动NF-kB和激活蛋白1 (AP1)核易位在炎症状态32,诱导促炎细胞因子的生产。 在缺乏CEFT治疗,TLR2/4不足导致免疫系统功能障碍,主要是在宿主细胞肺炎球菌微生物的识别模式11。 我们目前的研究结果是一致的与克莱因和他的同事们,他们同样报告增加IL-1β较小,但可比CCL2和il - 6的浓度,TLR2/4双巨科老鼠大脑内的肺炎球菌脑膜炎模型11。 除了通常,从白细胞释放IL-1β是依赖于另一个类似的微生物模式识别系统,nod样受体(NLR) inflammasome33。 这个因此演示了一个非排他性的角色TLR2和TLR4介导促炎细胞因子的生产,特别是IL-1β,TLR2/4函数的损失并不是完全由NLR补偿信号。
没有治疗,过度细菌生长与死亡率增加; 恶化的生存结果报告TLR2单一巨科老鼠脑池内的或鼠脑内注射年代。肺炎大脑内,伴随着增加细菌负荷和/或血液,相比WT控制12,14。 此外,TLR2/4双巨科老鼠脑池内的注射年代。肺炎显示恶化的临床结果与大脑和血液中细菌负荷增加11。 相比之下,既不受损的生存也不改变大脑和血液中细菌的滴定度已报告在TLR4单一缺乏老鼠11。 这些数据表明,TLR2通路,独立于TLR4可能调节细菌产物在脑模型的肺炎球菌感染14,34。 此外,TLR2不足导致减少促炎细胞因子,包括TNF和IL-1β,小鼠模型年代。肺炎耳炎,导致细菌产物增加,菌血症和死亡35。 同意这些研究,我们的研究结果表明,TLR2和TLR4协同调节先天在肺炎球菌脑膜炎的急性期,炎症反应失调的由于缺少TLR2/4导致TLR2/4-deficient小鼠的早期死亡率增加。 相比MyD88不足16,36深刻地抑制宿主对病原体的免疫,双重缺乏TLR2和TLR4仅略有影响免疫反应(CSF)以免疫中介水平和死亡率由于急性肺炎球菌脑膜炎,可能是因为另一个微生物模式识别系统的代偿机制。 值得注意的是死链接细菌的分子事件负担仍有待建立,和早期死亡率TLR2/4-deficient老鼠的也可能是由于神经系统并发症(s)。
在我们当前的报告中使用CEFT治疗,抗生素杀死细菌产物导致的肺炎双球菌和预防类似的存活率WT和巨科老鼠。 相比年代。肺炎WT来华的老鼠,它显示一个减毒CSF IFN-γ浓度增加单剂CEFT后,IFN-γ继续增加三倍的巨科老鼠(图。2 a, B)。 我们之前已经证明了IFN-γ和损害结果之间的因果联系的肺炎球菌脑膜炎急性死亡(不含抗生素)37和认知结果(抗生素)38。 增强CSF IFN-γ反应观察到在目前的研究中,然而,不配合巨科接受CEFT治疗小鼠受损的生存,因为他们大多是治愈。 另一方面,当抗生素干预,促炎细胞因子的浓度更高的存在IFN-γ后期的疾病进展可能参与随后的病理机制(s),导致长期的神经问题。
TLR2、TLR4和TLR9识别单核苷酸多态性与神经系统后遗症的风险增加相关,特别是听力丧失,脑膜炎球菌性脑膜炎和肺炎球菌脑膜炎39。 此外,在其他微生物模式识别受体基因多态性,比如inflammasome NLRP1基因,以及脑脊液IL-1β浓度与肺炎球菌性脑膜炎疾病预后不佳40。 我们的结果有可能,可识别的路径驱动神经的结果,至少在部分:TLR2/4调节宿主免疫,特别是,所以他们的缺乏导致加剧IFN-γCSF概要post-CEFT治疗与长期昼夜hypolocomotion和损伤的加重认知灵活性。 支持这一点,我们先前表明,这些行为和认知的改变不是在IFN-γ巨科老鼠38。 这表明TLR2/4激活可能是上游调节器IFN-γ-dependent神经病理结果的肺炎球菌脑膜炎,尽管其他因素毫无疑问贡献,如下面所讨论的。
在我们先前的研究证明38,41,夜间活跃表型没有IFN-γ和地震巨科老鼠治愈肺炎球菌脑膜炎的CEFT——这种现象也观察到在当下TLR2/4巨科点老鼠,尽管不同模式的周日运动(那么亢奋IFN-γ巨科,同样亢奋的在地震巨科更亢奋的在当前TLR2/4巨科点老鼠相比各自WT等价物)。 这些老鼠共享一个共同的细胞因子- CSF IL-1β减少。 TNF、il - 6和IL-1β是众所周知的标记在炎症疾病的行为42和他们的影响可能是长期的43,所以很可能减少由于TLR2/4 IL-1β生产缺陷在急性期与改善相关的肺炎球菌脑膜炎是极度活跃的表现型的点老鼠幸存由于CEFT治疗肺炎球菌脑膜炎。 最近的一项研究报告的保护作用IL-1β受体拮抗剂对短期(10天皮。)认知障碍(习惯化记忆,小说对象识别和厌恶内存)由于急性肺炎球菌脑膜炎44。 然而,减毒CSF IL-1β浓度增加TLR2/4巨科老鼠脑膜炎小鼠模型中没有提供保护从学习障碍小鼠受巡逻或逆转的任务。 因此,很可能CSF IL-1β浓度TLR2/4巨科老鼠在我们的研究达到一个阈值足以引起学习障碍,细胞因子配置不均衡导致恶化的后果。 另外,这些观察与cytokine-specific调制不同的认知是一致的子集。
除了TLR2/4-mediated炎性细胞因子表达,替代TLR2/4-associated机制可能扮演了一个重要的角色在推动长期神经系统后遗症的发病机理:(1)TLR2/4信号调节抗菌机制和/或白细胞增多,破坏导致细菌清除障碍,炎症细菌碎片,积累和特异表达宿主炎性反应,导致早期死亡率增加和/或长期的神经变化。 这种机制与以前的研究一致11,12,13肺炎球菌性脑膜炎的急性发病机理进行了探讨,链接CNS细菌性疾病严重程度/死亡率增加的负担在TLR2和/或TLR4-deficient老鼠。 此外,克莱恩和同事11报道TLR2/4-deficient小鼠肺炎球菌脑膜炎衰减了50%增长的脑脊液白细胞计数。 我们之前一起研究调查中性粒细胞减少的影响45和回顾人口研究病人数据,展示了一种负相关的脑脊液白细胞计数与神经系统并发症2,这些研究显示的潜在参与TLR2/4-mediated白细胞增多在推动神经问题在我们的疾病模型。 (2)通过多种机械TLR2/4通路,包括(1)或其他未被发现的神经通路,调节补偿机制,保护宿主免受脑损伤急性肺炎球菌脑膜炎。 类似于其他神经系统疾病46然而,TLR2/4活化的免疫调节作用在推动神经病理事件在肺炎球菌脑膜炎还有待阐明。
除了急性炎症,通常一直认为参与炎症活动在慢性神经退行性疾病。 TLR2和TLR4是实验性脑缺血引起的47; 老鼠缺乏要么TLR显示减少脑损伤脑局部缺血损伤47,48。 此外,TLR4-deficient老鼠显示改善中风后神经行为实验49。 另一方面,通常1 - 8在阿尔茨海默氏症患者的中枢神经系统调节50和一个haplotype-tagging SNP与增加,发展成晚发型阿尔茨海默氏症的风险51。 类似于这些疾病,我们演示了在临床前模型中一个重要的潜在的机械TLR-mediated炎症之间的联系和发展的长期的神经赤字可能相关的病人治愈肺炎球菌脑膜炎的抗生素治疗。 治疗的影响值得进一步调查。
总之,TLR2/4轴发挥了部分作用调节急性宿主炎性反应在肺炎球菌脑膜炎,可以阻止或限制,在某种程度上死亡率和神经系统并发症。 很可能通过调节炎症反应和/或其他补偿机制,期间中央主机保护TLR2/4肺炎球菌脑膜炎。
女性C57BL / 6 j小鼠双重缺乏TLR2 (B6.129 -Tlr2tm1Aki/伯灵顿)和TLR4 (B6.129 -Tlr4tm1Aki詹姆斯库克大学/伯灵顿)杂交,澳大利亚52,53和双基因敲除小鼠(巨科)随后被培育医学基金会建立动物屋,澳大利亚悉尼大学。 与野生型(WT)控制的C57BL / 6 j小鼠背景从动物资源中心购买,澳大利亚珀斯。 老鼠7到12周的年龄是包括在这项研究中,不超过4周年龄范围在每个实验。 除非另有说明,WT和巨科老鼠住在3到6组老鼠individually-vented笼子(Tecniplast、Buguggiate、意大利)随意水和食物的温度,光控条件。 实验过程都是由悉尼大学动物伦理委员会批准并坚持新南威尔士州动物研究法案(1985 -动物研究监管2010)和2004年NHMRC的澳大利亚守则的动物保健和使用科学的目的”。
符合我们的先前的研究38,41,54老鼠注射年代。肺炎3无血清型菌株(由教授j·佩顿,阿德莱德大学,澳大利亚)到第三脑室下光与吸入isofluorane麻醉。 与此同时,sham-infected控制动物收到intracerebroventricular注入杜尔贝科的磷酸盐(DPBS)。 临床症状表明成功的细菌感染,包括轻度嗜睡和弯腰驼背的姿势不动,在20 h post-inoculation明显(p),在这段时间里,抗生素治疗开始。 头孢曲松钠(CEFT)管理pneumococcus-infected和未受感染的动物如前所述38,41。 肺炎球菌脑膜炎疾病过程的监控每天长达10天或指定的采样点(如。 44 h p)。 小鼠严重疾病的不可逆转的肺炎球菌脑膜炎(嗜睡和静止,著名的步态障碍,延迟扶正反射,或配件)被安乐死。 小鼠急性肺炎球菌脑膜炎后幸存CEFT治疗受到长期使用IntelliCage神经系统评估TM自动化的认知和行为筛选系统,被指示为“post-meningitic”(PM)在整个文本。
第一个CSF集合38发生在20 h pi和第二个24 h后的第一个政府CEFT(例如44 h p。)。 总共6 - 8 pneumococcus-infected WT巨科和2 - 3 sham-inoculated WT巨科小鼠安乐死和过量的吸入剂isofluorane CSF托收。 CSF细胞因子的浓度(IFN-γ1 l-1β,il - 6和TNF)和单核细胞化学引诱物,趋化因子(碳碳主题)配体2 (CCL2),测量如前所述54使用仪珠阵列(CBA -生物科学正欲)。
由于存在各种行为和认知障碍的实验和临床病例肺炎球菌脑膜炎,本研究使用了高通量,多方面IntelliCage测试系统调查一系列潜在的神经改变点的动物。 测试组件和设置在我们之前的全面描述和插图绘画的出版物38,54。 用这个功能灵活的系统,我们之前有研究神经心理影响健康小鼠的TLR 2和4的缺陷30.。 包括4调节操作单位为一个大笼子里,大约是5倍大小的标准笼,总共16老鼠可以同时测试,不断与一系列software-programmed测试模式。 之前所述54,为期16天的测试电池用于定量分析行为和认知的改变post-meningitis缺乏功能性TLR 2和4的信号,照亮这一信号通路的作用在行为和学习调节点老鼠。 所有老鼠都接受CEFT为了控制抗生素的任何潜在影响行为或学习55。
测试电池以前详细描述54。 它开始于最初的习惯化小说IntelliCage环境(自由改编,FA),探讨角落钱伯斯(nosepoke适应,NA),和喝在指定会话(喝酒适应,DSA),每2天。 行为后的老鼠在这些适应形成的阶段,他们的光偏好/回避行为评估在未来两天:第一天,5 s闪烁红色/蓝色/绿色(篮板)光在角落发起1访问; 2天,一个常数篮板光在角落发起1在一天的开始测试。 这后,老鼠训练巡逻和逆转任务如下简要描述:
1.
巡逻任务(PT): PT前,老鼠受到DSA过程一天为了恢复他们的基线行为。 两个PT范式设计:简单和复杂。 访问水(奖励),这两种类型的PT需要老鼠巡逻到另一个角落之后,他们已经得到回报。 巡逻模式并不是固定在简单的PT,但是在复杂的PT小鼠巡逻在顺时针,逆时针方向,方向获得奖励。 简单的PT被处决前3 h的黑暗周期预设在动物的房子,和复杂的PT在过去的3 h。 在这两个点,一组3“工作”和1个“参考”角落是随机分配到老鼠。 而“参考”角落是永久关闭了奖励,老鼠巡逻中剩余的3角“工作”以指定的方式奖励。 “奖励”角落里暗示了5 s闪烁篮板光视觉刺激。
2.
逆转任务(RT):老鼠的第一天RT再次暴露在DSA范式,以恢复基线行为。 获得奖励的标准在RT是一样的简单的PT,要求老鼠随机寻求另一种“奖励”角落后他们被奖励在一个特定的角落。 在“空间RT”发起第一次喝酒,预先分配的“工作”和“参考”角落交换,这样“参考”角落现在搬到下一个顺时针的角落。 “歧视”逆转,发生在第二个喝酒,各个角落不断点燃一开始测试和“奖励”的角落里被失活表示条目的视觉刺激。 退出re-illuminated奖励角落角落里的一只老鼠。
的一部分研究针对meningitis-associated神经系统后遗症,31 WT, 29日巨科老鼠使用和分组如下:
1.
WT sham-infected控制(n = 14);
2.
WT感染小鼠(n = 16);
3.
巨科sham-infected控制(n = 12);
4.
巨科感染小鼠(n = 15)。
两个巨科老鼠和一个WT鼠标没有治愈CEFT肺炎球菌脑膜炎的治疗被安乐死,排除在进一步研究。 三到五个老鼠的不同基因型sham-infected或pneumococcus-infected集团设在IntelliCage相同。 实验在两个不同的鼠标军团和统计分析的数据总和。 老鼠受到两次为期16天的测试电池的一个月的时间间隔,所以短期和长期行为和认知的改变可以检查。 开始的第一个运动神经和认知测试周期10天皮。 称为R1, R2之后,开始一个月后R1的结束。
统计分析的数据进行了使用GraphPad Prism 5.01版本Windows (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)和IBM SPSS统计版20(美国纽约SPSS . n:行情),萨默斯)所描述38。 总之,生存分析利用生存率较,而细胞因子与计划的比较分析。 IntelliCage生成的数据,两个主题之间的比较是不同的鼠标都接受了CEFT治疗组:1。 TLR2/4+/+sham-infected与老鼠治愈的脑膜炎CEFT (post-meningitic,“点”); 2. TLR2/4−−/sham-infected下午和老鼠。 混合方差分析基于一般线性模型(GLM)是用于重复测量。 对于所有的测试,指出了统计意义p< 0.05。 数据值的范围,不属于平均值±2标准偏差被认为是异常值和被排除在分析38。
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