异常的组蛋白乙酰化作用有助于年龄相关性认知下降和神经退行性疾病。 我们分析的功能赖氨酸乙酰转移酶TIP60 / KAT5海马神经元的使用诱导小鼠模型。 TIP60-deficiency成人前脑在几天内导致广泛的转录功能障碍的特点是存在在CA1 neurodegeneration-related签名。 细胞周期和immunity-related基因调节在学习和神经plasticity-related基因表达下调。 特异表达的基因特征明显看到在TIP60-deficiency重叠与CK-p25神经退化模型。 我们发现H4K12 hypoacetylated在转录起始位点的基因的表达抑制TIP60-deficient老鼠。 转录失调后的周β-actin激活半胱天冬酶3和碎片在CA1神经突,最终导致严重的神经损失。 TIP60-deficient老鼠也会开发轻度记忆障碍。 这些表型的核心作用TIP60转录网络中神经元生存能力的关键。
赖氨酸乙酰化是一个转译后的修改,负责监管不同蛋白质的特征,包括稳定性、亚细胞定位、催化活性和蛋白质相互作用。 乙酰化作用是由赖氨酸乙酰转移酶(kat)和抵消赖氨酸去乙酰酶抑制剂(KDACs)。 组蛋白的乙酰化与转录呈正相关1,2,3.,4和参与新记忆的编码神经元5,6,7,8。 组蛋白乙酰化的放松管制,例如hypoacetylated组蛋白H4赖氨酸12 (H4K12ac),已经涉及到受损的突触可塑性、痴呆、神经退行性疾病4,9,10,11,12。 kat分组成蚊,p300 / CBP和神秘岛的家庭13。 我们最近比较所有kat的表达在成年小鼠海马CA1区14,发现Kat2a/Gcn5和Kat5/Tip60作为两个最强烈表达kat的大脑区域。 GCN5损失从成人前脑神经元导致老鼠和特殊记忆障碍也与监管中的刺激神经组织的信号相关基因表达程序14。 第二个最强烈表达了凯特,Tip60,被发现T在- - - - - -我互动protein60kDa (TIP60),是一个神秘岛的家庭成员,以300氨基酸神秘岛域包含一个乙酰辅酶a绑定催化域和锌手指15。 TIP60的催化亚基的进化NuA4复杂16。 这个复杂的涉及多种细胞过程,包括DNA损伤修复、细胞凋亡、有丝分裂和癌症17,18,19,20.。 组蛋白H4是主要的TIP60衬底17。 除了组蛋白,TIP60乙醯化转录因子也作为共激活剂或辅阻遏物(在裁判了。21)。 这多方面的作用方式指定TIP60作为基因表达调控的中心。
尽管大量的生化数据,对哺乳动物的生理功能TIP60在成年人的大脑因为TIP60-deficient小鼠早期胚胎杀伤力的22。 来洞察TIP60在哺乳动物大脑的功能,我们已经生成的一个条件Tip60基因敲除鼠线和诱导TIP60-deficiency postmitotic兴奋性神经元的成年前脑使用tamoxifen-inducible司机线23。 后10天内Tip60删除,我们发现大量的基因表达失调海马CA1区,并发的显著减少H4K12乙酰化表达下调基因的转录起始地点Tip60有条件的KO小鼠。 已经3周后Tip60删除我们观察到稀缺的神经退行性过程,最终导致进步在CA1神经损失。
研究TIP60在成年小鼠海马的功能,我们走过老鼠携带液氧Tip60基因(图。1)tamoxifen-inducibleCaMKCreERT2司机行24。 这个驱动程序指导基因删除postmitotic前脑包括海马的兴奋性神经元。 在8到10周的年龄CaMKCreERT2 Tip60/ f(Tip60cKO)和Tip60/ f(控制)老鼠反复注射它莫西芬(无花果。1 b)。 我们定义它莫西芬的最后一天日0时注射。
删除Tip60在成年老鼠兴奋前脑神经元。 (一个)Tip60为野生型等位基因,液氧,淘汰赛。 蛋白质编码外显子黑所示。 LoxP网站显示黑色的三角形。 引物pcr I, II和III是用箭头指示。 (B)当实验和主要观察时间点。 它莫西芬注射是指一天的最后一天0。 (C无处不在的核TIP60信号控制老鼠的海马在去年它莫西芬注射后的第十天。 (D)Tip60cKO的大部分TIP60信号在主细胞层缺席最后它莫西芬注射后第十天。 (E)TIP60信号核。 TIP60和DAPI染色单显示海马核。 (F)标记区域(D)显示TIP60-positive核subgranular区(箭头),一个地区缺乏CRE活动。 (G游离钙)删除效率的量化CA1, CA3, DGTip60cKO老鼠在它莫西芬注射后第十天,规范化的总数DAPI积极核(n = 4, 4节/动物)。 误差线代表SEM。 (H,我)TIP60三重标签的照片,GFAP和IBA1地层lacunosum moleculare的CA1区Tip60cKO鼠标。 (H)显示TIP60和GFAP, (我)TIP60和IBA1。 酒吧规模:250µm (C, D), 10µm (E), 100年µm (F), 50µm (H I)。 缩写:CA1,海马分区CA1; 游离钙,海马分区CA2; CA3、海马分区CA3; DG,齿状回; 包含IHC,免疫组织化学; CC3,裂解半胱天冬酶3。
在第十天,我们与一个定制的TIP60-specific抗体进行免疫组织化学(TIP60P4)和检测到核TIP60蛋白质的表达的主要细胞层控制(图中的所有海马亚区。1 c, E)。 海马的Tip60cKO老鼠强TIP60表达细胞的数量减少白天在CA和齿状回地区10最后它莫西芬注射后(图。1 d, F)。 TIP60删除效率> 90%,海马体的主要层除了CA2区(图1克)展示有效的基因缺失。 因为CaMKCreERT2司机不是表达在神经祖细胞和神经胶质细胞,TIP60仍subgranular神经元(图中发现。1 f箭头)和GFAP——或者IBA1-expressing胶质细胞(图。1 h,我)。
神经核NeuN标志的表达模式,突触前标记Synaptophysin 1 (SYP),树突microtubule-associated标志蛋白2 (MAP2)和胶质标记GFAP没有改变分析时它莫西芬注射(补充图后第十天S1)表明Tip60删除没有立即对总值海马形态学的影响。
当监控的大脑老化Tip60cKO动物组织学检查,我们注意到很大年龄相关性海马神经元丢失,暗示神经退行性表型。 我们分析凋亡标记的激活半胱天冬酶3 (CC3)及其特定的乳沟产品Fractin(肌动蛋白的片段,ref。25)在三个不同的时间点(无花果。1 b)。 第十天,CA1区Tip60cKO和控制老鼠无法区分。 相比之下,3周后删除Tip60CC3 Fractin在场,但只在最低级别,只在最内侧CA1(补充图的一部分S2)。 相比之下,在3个月,广泛CC3和Fractin信号检测在CA1区Tip60cko(无花果。2 b, D在控制(图),但缺席。2,C)。 CC3和Fractin信号是非常具体的CA1和主要位于地层方位和地层radiatum(无花果。2 b′D′)。 CC3中也观察到单个原子核的CA1锥体细胞层Tip60cKO但不是控制老鼠(无花果。2′,B′)。 同样的观察Fractin(无花果。2 c′D′),我们也经常发现单一神经元完全注满Fractin信号(补充图S3)。 让人想起本周3时间点,但是更明显,有梯度下降的信号在内侧,外侧方向5个月(补充图S3)。
3个月后神经退行性表型在TIP60-deficient老鼠Tip60删除。 (一个在控制缺乏CA1裂解半胱天冬酶3 (CC3)信号。 (B)在CA1 CC3信号强Tip60cKO的动物。 (C)没有在CA1 Fractin信号控制。 (D)在CA1 Fractin信号Tip60cKO老鼠。 部分显示了CC3 Fractin邻边。 (一个′- - - - - -D′)扩大的区域表示(模拟)。 在Tip60cKO老鼠CC3和Fractin信号主要是位于地层方位和地层radiatum与单一阳性细胞核地层pyramidale。 酒吧规模:100µm(模拟),50µm (′- d′)。 缩写:CC3,裂解半胱天冬酶3,s.o。,地层方位; 焦燕雄。、地层pyramidale; s.r。地层radiatum。
神经退化过程揭示了CC3 Fractin信号是伴随着大量和进步的CA1区细胞损失在9个月后变得尤为明显Tip60删除(图。3)。 我们量化的平均厚度地层方位,地层pyramidale和地层radiatum在3周,3个月,9个月后Tip60删除(图。1 b)。 而在3周没有变化,我们观察到显著减少的厚度地层方位和地层radiatum14%和20%,分别为3个月。 在9个月的平均厚度地层方位,地层pyramidale和地层radiatum已经下降了47%,分别为36%和43%(图3,p < 0.0001)。
的损失Tip60导致神经退化和炎症在CA1区。 (一个CA1层的平均厚度地层方位(s.o。)地层pyramidale(焦燕雄。),地层radiatum(s.r)在控制和量化Tip60cKO小鼠3周,3个月,9个月后Tip60删除。 层的边界用虚线表示。 n = 2 - 4 /基因型,4节/动物。 双尾学生的学习任务,* * * p < 0.0001。 误差线代表SEM。 (B,C)代表IBA1和GFAP的图像信号的控制(B)和海马体Tip60cKO老鼠它莫西芬(C) 9个月后注射。(D- - - - - -F)的插图(B)在较高放大显示DAPI (D), GFAP (E)和IBA1 (F)。G- - - - - -我)的插图(C)在较高放大显示DAPI (G), GFAP (H)和IBA1(我)。J,K)量化GFAP的数量和IBA1-positive CA1区细胞的控制Tip60cKO的动物。 n = 3 - 5 /基因型,4节/动物。 3盒(B, C)所示的尺寸计算每一节。 双尾学生的学习任务,* * * * * p < 0.01, p < 0.001。 误差线代表SEM。 酒吧规模:100µm (a - c), 50µm (d - i)。
因为神经退化往往伴随着炎症过程,我们使用小胶质进行免疫组织化学标记IBA1和GFAP astrocyte-specific标记基因缺失小鼠在9个月后(图3 b, C)。 这两个标记在CA1区强烈的调节Tip60cKO老鼠(图。3 h,我(图)相比,控制。3 e, F)由于显著的神经炎症Tip60从成人大脑的兴奋性神经元缺失。 量化的数量为GFAP阳性细胞显示upregulation约三倍(无花果。3 j),几乎一倍IBA1(无花果。3 k)。
这些数据表明,Tip60删除逐渐导致神经退化伴随着神经炎症。
因为CA1神经退行性表型是非常具体的我们我们的后续工作主要集中在这个地区。 我们量化的乙酰化组蛋白H4的水平,这是一个主要TIP60衬底17。 双标记实验显示,无处不在的TIP60 H4ac和H4K12ac核信号在CA1主要细胞层(图10天控制动物。4左面板)。 相比之下,Tip60cKO的老鼠表现出预期的减少TIP60-positive神经元的数量而H4ac和H4K12ac信号强度显著降低在许多核(图4,对面板)。 重要的是,核和减少H4ac H4K12ac信号是那些TIP60-deficient。 免疫荧光信号的量化表明H4和H4K12乙酰化作用明显TIP60-deficient细胞中表达下调了29%和58%,分别(无花果。4 b,p < 0.0001)。 H4K12ac是减少到42%赖氨酸表示,这是一个主要的目标TIP60也在大脑中,这是与以前的工作在其他细胞类型一致26,27。 剩余乙酰化在Tip60cKO老鼠可能是由其他乙酰转移酶表达的海马体(引用文献综述。28)。 总之,有一种强烈的分子表型hypoacetylation,特别是H4K12,在CA1神经细胞,后10天Tip60删除。
TIP60-deficiency原因减少H4和H4K12 CA1转录组的乙酰化作用和广泛的失调。 (一个)双标签TIP60和H4ac以及TIP60 H4K12ac CA1地区的控制Tip60cKO老鼠。 部分应用了抗体H4ac和H4K12ac(绿色)和TIP60(红色)(上部面板:anti-TIP60P4; 较低的面板:anti-TIP60即)。 注意单细胞TIP60和乙酰化作用强度之间的相关性。 Anti-TIP60也即彩色血管基因型(星号标记Tip60cKO)。 (BH4)量化结果和H4K12乙酰化信号强度TIP60-positive CA1区和缺乏核Tip60cKO老鼠(n = 4, 4节/动物,> 100原子核,双尾学生的学习任务,* * * p < 0.0001)。 美大 =任意单位。 误差线代表SEM。 酒吧规模:250µm (A), 50µm (B)。C基因差异表达)的热图描绘在CA1后10天Tip60删除(n = 6 /基因型,调整p值< 0.05和| |褶皱变化> 1.2)。 (D)主成分分析的基因表达谱CA1区和控制Tip60cKO的老鼠显示清晰的分离的两个基因型。 (E)基因表达下调TIP60-deficient CA1区包含学习、神经元突触可塑性和投影发展功能类别,而调节的包括DNA复制、有丝分裂和免疫与响应相关的功能类别。
因为组蛋白乙酰化的体内平衡是至关重要的转录调控RNA-Seq使用CA1组织执行它莫西芬注射后第十天。 应用一个调整p值< 0.05和| |褶皱变化> 1.2我们发现3502个基因,2953个基因表达下调(无花果。4摄氏度和补充表S1)。 更严格的截止(调整假定值< 0.05和|褶皱变化| > 2)仍然产生了许多特异表达基因(642——168年下调,补充表S1)。 主成分分析(PCA)表明,转录组的Tip60cKO和控制老鼠显然是由第一个组件(图。4 d),强调两者之间的转录组基因型的主要区别。 RNA-Seq数据被qPCR验证和选择的差异表达记录进行了分析原位杂交(ISH)揭示空间表达的差异。 qPCR和RNA-Seq日志之间的相关性2FC值强劲(补充图S4)和伊什结果完全与其他两种方法的结果一致。 在大多数情况下,在CA1(例如基因差异表达Lin7b)扩展到CA2、CA3和总干事(补充图S4)。
接下来,我们评估功能基因本体论(去)类别丰富中特异表达的基因Tip60cko。 学习表达下调基因聚合,神经元突触可塑性和投影发展类别(图。4 e左)。 类别确定去调节基因的DNA修复和复制,有丝分裂和immune-response-related功能(无花果。4 e右)。 TIP60曾参与DNA修复17,29,30.和有丝分裂19,20.。 值得注意的是,免疫与响应相关的基因的upregulation最有可能是次要的神经胶质细胞对神经元损伤的影响。
因为TIP60是一个已知的辅助因子不同的转录因子(TFs)我们也分析TF浓缩的RNA-Seq数据Tip60cko。 均表达下调基因丰富的知名TIP60伙伴E2F1互动的目标31(核反应能量< 0.05 Benjamini &业务调整,见补充表S2)。 TF浓缩在调节基因是几乎完全限于E2F1或相关蛋白表达下调的基因明显丰富许多TFs包括Myc的目标,另一个——建立TIP60互动合作伙伴32。 值得注意的是,E2f1表达显著调节逾两倍Tip60cKO小鼠(p值< 0.0001),这样就可以调整参与upregulation基因Tip60删除。
全球H4K12乙酰化作用大大降低TIP60-deficient核(无花果。4 a、B)。 为了确定在哪些基因H4K12 hypoacetylated海马神经元按流式细胞仪并受染色质免疫沉淀反应深度测序(ChIP-Seq)紧随其后。 主成分分析显示一个清晰的分离的基因型(无花果。5)。 明显的热图的无花果。5 b启动子区域的大多数显著改变H4K12ac绑定(调整p值< 0.05和| |褶皱变化> 1.2)减少H4K12ac水平Tip60cko。 我们进行分析与这些H4K12 hypoacetylated基因,发现许多相同的类别,先前被确定为基因表达下调成绩单(无花果5度和4 e)。
减少H4K12ac绑定主要影响表达下调基因的启动子区域Tip60cKO老鼠。 (一个)ChIP-Seq数据的主成分分析显示明显的基因型之间的分离。 (B)启动子区域的热图显著改变H4K12ac绑定(调整p值< 0.05和| |褶皱变化> 1.2)。 (C)类别分析基因与降低H4K12ac在启动子(同样的基因(B))。 (D,E)平均水平的H4K12ac发起人(D)和基因体(E)的每一个基因表达下调RNA-Seq分析(调整p值< 0.05和| |褶皱变化> 2)。 (F)H4K12乙酰化作用(H4K12ac)水平以及基因表达下调(左)和调节(右)Tip60cKO老鼠。 (G)基因表达下调Tip60cKO老鼠水平显著降低H4K12ac TSS周围(+ /−2000个基点),而调节的不。 此外,表达下调的基因有更高的基础水平相比H4K12ac调节的。 (控制、双向方差分析:基因型的影响Tip60cKO): p < 0.0001; 方向效应(表达下调与调节):p < 0.0001; 互动:p = 0.0041。 事后多重比较H4K12ac水平(Sidak的多重比较检验):表达下调的基因:调整p值< 0.0001 (* * * *); 调节基因:调整假定值= 0.5431。 (H)H4K12ac水平以及学习相关的基因表达下调(左)和DNA replication-related基因(右)调节Tip60cKO老鼠。 (我)学习相关的基因表达下调Tip60cKO老鼠水平显著降低H4K12ac TSS周围(+ /−2000个基点),而DNA replication-related基因调节Tip60cKO老鼠不。 此外,这些学习相关的基因有更高的基底H4K12ac水平相比,与DNA复制的。 (控制、双向方差分析:基因型的影响Tip60cKO): p < 0.0001; 类型的影响(学习相关vs DNA Replication-Related): p < 0.0001; 互动:p = 0.0018。 事后多重比较H4K12ac水平(Sidak的多重比较检验):学习相关基因:调整p值< 0.0001 (* * * *); DNA Replication-Related基因:调整假定值= 0.3293。
相比我们接下来H4K12ac绑定的启动子表达下调的基因被RNA-Seq(补充表S3)。 无花果的热图。5 d清楚地表明,控制和之间的区别Tip60cKO关于H4K12ac面前表达下调的基因的启动子是高度一致的。 没有找到这种一致性H4K12ac绑定在基因体(无花果。5 e)。 概要图显示显著减少H4K12ac绑定在表达下调基因,尤其是在TSS地区都使用更严格(无花果。5 f, G)和更宽松的截止(补充图S5)。 H4K12ac水平调节基因没有任何明显的变化Tip60cKO。 此外,基底H4K12ac更高的水平基因表达下调Tip60cKO比在调节(无花果。5 f, G和补充图S5)。 符合这个观察,我们还观察到一个更实质性的减少H4K12ac在学习相关的基因表达下调Tip60cKO比DNA replication-related基因调节这些老鼠(无花果。5 h,我)。 同样,基底H4K12ac学习相关基因水平高于replication-related的DNA。
总之,表达下调基因是特别受H4K12ac约束力下降,特别是在他们的TSS,而调节基因不受影响。 此外,表达下调的基因表现出更高的基底H4K12ac水平比调节的,支持直接参与H4K12乙酰化的表达下调基因表达的控制。 这是符合认为H4K12乙酰化与活跃转录33。
我们表明,损失Tip60基因缺失与后10天已经减少神经元H4K12ac的差别,对这些学习相关的基因。 最终,这些转录组的变化是紧随其后的是神经元细胞损失。 这促使我们比较转录中观察到的变化Tip60cKO老鼠与CK-p25神经退化的小鼠模型34。 表达p25 (p35区域的蛋白水解片段)的控制下CaMK2发起人hyperactivates Cdk5兴奋性神经元。 这导致大量的神经元和突触丢失已经在第6周后归纳35。 这些神经退行性过程都伴随着神经炎症,导致海马萎缩,一样Tip60cKO海马。 转录组后10天Tip60删除和2和6周后CK-p25转基因感应(ref。36地理:GSE65159)进行了比较。 首先,我们重叠和调节基因在转基因模型(调整p值< 0.05和| |褶皱变化> 1.2,补充表S4)。 表达下调的基因有一个相当大的两个时间点(补充图重叠S5)。 对调节基因重叠(补充图并不明显S5)。 接下来,我们应用rank-rank超几何重叠(RRHO)分析来识别潜在的失调在这两个模型之间的一致性。 这种方法允许一个阈值免费鉴定重叠紧随其后的是量化的意义使用多个测试校正和排列测试37。 我们发现了一个明显的重叠和调节基因Tip60cKO和CK-p25转基因小鼠2周(图。6 a、B补充表S5和S6)和6周(补充图S5补充表S7和S8)。 RRHO地图在无花果。6和补充图S5证明这个重叠更突出表达下调的基因调节的。 当我们执行常见的特异表达基因的功能注释分析两个模型,我们发现许多相同的官能团,我们已经看到在删除Tip60在CA1(无花果。4 e)。 这包括学习和突触plasticity-related函数(下调)和DNA复制和免疫与响应相关的功能(调节)(补充图S6)。
明显的重叠基因特异表达和类别在CK-p25 TIP60-deficient老鼠。 (一个)Rank-rank超几何重叠分析基因特异表达之间使用Tip60cKO和CK-p25诱发小鼠2周(ref。36; GSE65159)。 每个像素代表了一个基因的比较不同颜色的意义(max日志10(假定值)= 2035)。 最表达下调的基因是在左下角和右上角的最调节的热图。 (B)维恩图代表明显重叠,调节基因Tip60感应cKO和CK-p25老鼠(2周)(ref。36; GSE65159)。 在每种情况下,整体的意义是由重叠排列测试1000排列进行产生一个高度重要的排列假定值< 0.0001。 (C)H4K12乙酰化水平Tip60cko和控制基因表达下调(左)和调节(右)在CK-p25老鼠。 基因表达下调CK-p25老鼠水平显著降低H4K12ac TSS周围(+ /−2000个基点)Tip60cKO,而调节的。 此外,表达下调的基因有更高的基础水平相比H4K12ac调节的。 (D)量化的概要文件(C)的阴谋。在两周诱导基因表达下调CK-p25老鼠(ref。36; GSE65159)水平显著降低H4K12ac周围TSS(+ /−2000个基点)Tip60cKO,而调节的。 此外,表达下调的基因有更高的基础水平相比H4K12ac调节的。 双向方差分析:基因型效应(控制vs CK-p25): p < 0.0001; 方向效应(表达下调与调节):p < 0.0001; 互动:p = 0.0085。 事后多重比较H4K12ac水平(Sidak的多重比较检验):表达下调的基因:调整p值< 0.0001 (* * * *); 调节基因:调整假定值= 0.3955。
接下来,那些明显CK-p25小鼠特异表达基因分析的H4K12乙酰化状态Tip60cKO海马。 表达下调的基因明显下降H4K12ac绑定在TSS调节的并不影响在2周(图。6 c, D)和6周(补充图S6诱导后)。 TIP60-deficient之间的显著的重叠和CK-p25 overexpressing鼠标线证实我们TIP60转录组数据以及我们的组织学证据TIP60在退化。
符合kat的结果是参与学习和记忆,我们试图评估记忆功能Tip60cKO老鼠使用行为分析。 我们注意到Tip60cKO老鼠“神经兮兮”,有时显示肢体抱茎(图S7)和零星的发作。 这些异常以及衰老的重要神经损失我们观察到Tip60cKO小鼠预防可靠行为测试超出两个月后Tip60删除。 因此,我们进行我们的行为实验后3到6周之间Tip60删除。Tip60cKO老鼠表现明显比对照组差的短期和长期的测试对象识别内存(图。7一个; p < 0.05)。 当莫里斯空间记忆的测试水迷宫,之间没有显著差异的基因型逃脱延迟10天的培训(无花果。7 b; p = 0.4771)。Tip60cKO的老鼠显示趋势增加逃脱延迟期间学习试验和减少时间在目标象限(图。7 c; 控制p = 0.0021, p = 0.0374Tip60cko)。 然而,这些趋势并未达到意义。 游泳速度相当之间的控制和TIP60-deficient动物(图S7)。 没有明显的变化被发现在上下文恐惧条件反射可比冻结基因型(图之间的水平S7; p = 0.4186)。 开放的现场试验Tip60cko和控制花了相当的时间在竞技场的中心(图S7; p = 0.5292)。 路程(p = 0.1093)和速度(p = 0.1085)基因型(图之间的可比性S7)。 测试时升高加上迷宫Tip60cKO老鼠花了更多时间在张开双臂,指示一个TIP60-deficiency的抗焦虑效果(图S7,p < 0.01)。
TIP60-deficient老鼠显示适度的记忆障碍。 (一个对象识别)小说。Tip60cKO老鼠明显比对照组少偏爱小说对象当测试5分钟(短期记忆测试,STM)和24小时(长期记忆测试,LTM)训练后(p < 0.05)。 水平虚线描绘的机会。 n = 9 - 11。 (B莫里斯水迷宫。 逃避延迟找到隐藏的平台整个培训天之间没有明显不同Tip60cKO老鼠和控制(n = 9 - 11; 重复测量的方差分析,F(18)= 0.5274,p = 0.4771)基因型的影响。 (C)在探测试验,控制和TIP60-deficient老鼠花了更多时间在目标象限(Q目标相比),另3象限(Q其他)(* * p < 0.01, p < 0.05)。 误差线代表SEM。
kat的抵消活动和KDACs确定组蛋白的乙酰化状态和non-histone蛋白质。 化锌体内平衡紊乱会导致转录功能障碍,涉及与年龄有关的学习障碍和神经退行性疾病4,12,38。Tip60和Gcn5是两个最高度表达在CA1 kat吗14。 对TIP60在哺乳动物大脑的生理功能。 我们生成一个条件等位基因删除Tip60在postmitotic兴奋性神经元的成人前脑。 可行的突变老鼠成为可能,首次研究在活的有机体内在哺乳动物的海马TIP60的函数。 在目前的研究中我们尤其关注CA1,其生化、分子和细胞状态后检查在定义的时间点Tip60删除。 在10天内,没有TIP60蛋白质突变细胞中发现,乙酰化作用Tip60目标在这些细胞组蛋白H4K12降低了60%。 ChIP-Seq结果表明,这种减少是最突出的TSS基因表达下调Tip60cKO。 突变小鼠的CA1转录组显示了巨大的变化,表明主要的转录功能障碍。 基因表达的misregulation的大小Tip60cKO老鼠超过迄今为止所有先前研究KAT损失函数小鼠模型。 例如,删除Gcn5导致更少的特异表达基因代表通路不同于那些见过的Tip60cko14。 淘汰赛中其他kat,如p300和CBP,还显示相对适度调整转录39,40,41,42。
分析表明,基因表达下调Tip60cko调节突触可塑性和学习和调节基因驱动细胞周期重新和神经炎症。 一些研究显示,这种组合的类别是一种神经退化的标志11,43,44。 一个模型已经广泛的特点在这个上下文CK-p25鼠标34,35,36。 6周后p25感应这些老鼠显示进步的海马神经元死亡,伴随着astrogliosis34,35。 他们也显示减少H4K12乙酰化作用在神经可塑性的基因12。 当我们比较的差异表达基因Tip60cKO CK-p25模型的模型与神经退行性病变,我们发现了一个明显的重叠,和表达下调的基因。 当这些重叠的基因进行分类,我们发现许多相同的类别,从监管差异基因的分析Tip60cKO模型。 这些横向比较支持neurodegeneration-related签名的存在Tip60cko,已经后不久Tip60删除,之前任何细胞形态学变化。 我们可以进一步表明,对于重复表达下调基因promoter-associated H4K12几乎完全hypoacetylated,暗示的直接参与组蛋白标记观察到的基因表达的签名。 值得注意的是,Hdac2,也就是抵消TIP60-mediated乙酰化组蛋白H4,调节CK-p25老鼠12但没有改变Tip60cko neuroplasticity-related基因的差别,导致了对这些基因通过表观遗传的几组蛋白的乙酰化作用包括H4K12ac封锁12。 这些数据连同TIP60数据这里介绍,强烈支持的想法之间的平衡HDAC2 TIP60活动介导H4K12ac-dependent神经元plasticity-related基因的表达。 转移HDAC2和TIP60活动之间的平衡,发生在TIP60 cko,似乎妥协乙酰化体内平衡从而危及长期神经元生存。
事实上,在Tip60cKO老鼠的转录功能障碍预示着神经退化表现型。 在3周后开始Tip60删除、裂解半胱天冬酶3在CA1和Fractin信号出现在内侧部分,特别是在地层radiatum和地层方位。 到3个月,半胱天冬酶3和Fractin信号已经大量在内侧横向传播。 其他的研究曾表明,半胱天冬酶3活动存在于突触和树突退化的过程25,45,46。 在9个月的厚度Tip60cKO CA1 stratae一半,在控制和有大量神经炎症。 没有其他KAT-deficiency小鼠模型显示这种神经退行性表型。
Tip60cKO老鼠展出,通过基因缺失3 - 6周后,和任何实质性的神经元损失之前,物体识别记忆的重要障碍。 其他形式的记忆没有显著影响。 有趣的是,老鼠模型与条件等kat CBP的损失也表现出物体识别记忆受损,而据报道,莫里斯水迷宫空间学习只能在某些受损但不是所有这些老鼠的研究8,39,47。 GCN5损失导致一个非常健壮的障碍在空间学习小说对象识别相当轻微受损14。
目前的研究主要集中在基因类的表达与TIP60-mediated H4K12乙酰化作用。 然而,TIP60也有non-histone目标和可以作为转录体若(审查裁判。21)。 其广泛影响转录调控研究其他生物模型突出显示。 在酵母TIP60是唯一重要的帽子48,49并形成一个高度相互关联的转录调控的中心50,51。 此外,雷纳等。50确认Tip60六个基因之一秀丽隐杆线虫高度保守的和调节不同的信号通路。 全基因组绑定研究进行的乌鸦等。52表明TIP60复杂的功能作为一个全球转录co-activator大多数活跃的Pol II推动者也作用于增强剂在ES细胞的一个子集。 总之,这些数据以及我们自己的研究强调TIP60广泛控制许多细胞过程和通过影响转录。 失去在大脑的兴奋性神经元唤起乙酰化作用的干扰体内平衡,相伴的差别,对这些神经元plasticity-related基因,最终导致大量海马的神经退化。
一个条件Tip60等位基因生成使用标准recombineering方法导致目标等位基因图所示。1。 简而言之,一个15.7 kb的片段Tip60基因组DNA从BAC克隆克隆(bmq - 331 n14桑格研究所)到一个目标向量携带Pol2-DTA盒式消极的选择。 第一个loxP网站插入637个基点的上游Tip60ATG。 第二个loxP网站一起FRT-flanked PGK-neo磁带插入3065个基点ATG的下游。 5′末端的同源臂定位向量是4.5 kb和同源臂的3′末端是7.6 kb。 ES细胞定位和一代的Tip60fl / +创始人老鼠委托多基因基因转移(瑞士)。 老鼠的FRT-flanked PGK-neo选择磁带被跨越Flippase表达删除器线53。 了pcr引物5′-TCAGAAGATGCACCTTCTGCTGG-3′(我),5′-GGAAGGTTCAAAATTCCAGTAGGC-3′(II)和5′-TGCTTCCGCTTCCTGAATGCTG-3′(III)和产品尺寸是野生型的331个基点,液氧的429个基点和487个基点KO等位基因。 的tamoxifen-inducibleCaMKCreERT2鼠标线(Tg (Camk2a-Cre / ERT2) 2 / Gsc, EM: 02125; ref。24)是作为一个司机。 老鼠半合的CaMKCreERT2转基因(C57BL / 6 N背景下)了Tip60/ f在C57BL / 6小鼠获得N背景Tip60cKO实验动物和控制。 老鼠被安置在标准条件下提供食物和水随意。 同窝出生窝藏液氧Tip60等位基因但负面CRE-driver担任控制。 这两个Tip60cKO和控制动物的性别tamoxifen-injected 8到10周的年龄。 它莫西芬(T5648σ)溶解在玉米油(C8267σ)在一个旋转的轮子在37°C 6小时。 股票是20毫克/毫升浓度和老鼠收到100µl通过ip注射连续5天每天两次。 下萨克森州政府批准的所有实验都是消费者保护和食品安全办公室(洗涤)和执行按照德国法律的动物福利。
生成一个自定义TIP60-specific抗体(TIP60P4)使用的最后15个氨基酸组成的肽TIP60糖基(Immunoglobe Antikorpertechnik GmbH, Himmelstadt,德国)。 采用串联净化策略,其中包括第一次净化使用免疫肽,CLHFTPKDWSKRGKW,在c端酰胺化结束。 第一净化的主要材料是然后使用较短的版本的免疫纯化肽,SKRGKW。 tandem-purified抗体是具体的和足够敏感检测内源性TIP60 cryosections老鼠的大脑。
老鼠牺牲颈椎错位和新鲜解剖大脑被冻结在10月和cryosectionedµm 10点矢状。 部分被转移到Superfrost幻灯片和储存在−20°C到进一步使用。 部分是在室温下解冻10分钟(RT),然后固定在4% PFA 20分钟。 接下来,他们洗3次1 x PBS,孵化Triton 0.25% 1 x PBS 15分钟然后在阻断剂(5% BSA, 1%正常山羊血清1 x PBS) 1小时在RT,紧随其后的是一个在1 x PBS洗了10分钟。 主要抗体孵化是在阻止试剂在一夜之间在4°C。 抗体是Synaptophysin(101004年,1:50 0),IBA1(234003年,1:1000)MAP2(188004年,1:50 0),从突触系统,NeuN (MAB377 1:10 0), Fractin (AB3150 1:50 0), Acetyl-Histone H4K12(17 - 10121, 1:1000)从微孔,GFAP(4674年,1:50 0)从abcam, H4ac(39967年,1:1000)活动主题,裂解半胱天冬酶3(9661年,1:6)从细胞信号,TIP60P4(定制,1:25,见上图)和TIP60即圣克鲁兹(sc - 166323, 1:10 0)。 第二天,部分洗3次1 x PBS 10分钟和孵化Alexa-conjugated二级抗体(表达载体)稀释1:50 0在rt,部分阻塞试剂1小时又洗了3次1 x PBS 10分钟和盖玻片Vectashield不变色安装介质与DAPI(向量)或延长黄金不变色与DAPI Mountant(表达载体)。 图片是使用倒置显微镜捕捉到一个(徕卡DMI6000B)。 删除效率分析,海马体的合成图像Tip60cKO老鼠使用。 细胞的总数在各个区域的主要细胞层是由量化使用细胞分析器DAPI-stained核的数量54。 游离钙地区手动DAPI-stained核的数量计算。 残余TIP60野生型细胞被发现使用TIP60P4抗体,手动量化和归一化总细胞数在每个主要的细胞层。
细胞分析器54或定制的软件(可以在GitHub:https://github.com/epicodic/cell_label_tool)被用来量化的平均灰度值。 像素强度在整个图像中值为减去为了正确的背景。
只有雄性老鼠用于行为测试。 开放领域和莫里斯水迷宫测试它莫西芬注射后3 - 4周内完成。 小说完成了4 - 5个星期和上下文对象识别恐惧条件反射以及高架+迷宫在注射后5 - 6周。
灰色塑料盒作为测试领域的开放领域和小说对象识别测试。 开放的现场试验的相对时间在测试领域的中心是量化。 对于新奇物体的识别,老鼠暴露在测试领域第一天5分钟。 第二天他们习惯两个白框5分钟。 短期记忆(STM)测试发生在第三天。 老鼠被首次引入两个黑色方块,他们离开去探索5分钟。 以下5分钟他们花在家里的笼子里,然后重新测试领域中,其中一个黑色立方体现在换成一块石头。 长期记忆(LTM)测试,老鼠被引入一个黑色立方体和蓝色螺钉帽24小时后。 作为记忆的读出性能相对探索小说的时间对象,即。 、石头(STM)或蓝色螺钉帽(LTM),是使用。
测试联想学习老鼠放在一个盒子里。 3分钟的探索后,电子脚冲击(0.7 mA, 2 s)是通过网格地板后,老鼠从盒子中删除另一个30多岁。 24小时后,老鼠重新放回盒子和冻结测量3分钟。
老鼠放入+迷宫的中心,由墙的两臂(“关闭”)和两臂没有任何界限(“开放”),并允许勘探5分钟。 张开双臂的相对时间量化。
一个平台被隐藏在一个圆形池满了不透明的水。 测试执行4组成的连续10天训练。 在每个会话,老鼠引入池和60年代留给搜索平台。 如果不成功的期限内,轻轻地引导到这个平台上。 探针测试(没有平台)后24小时内进行最后一次训练。
背CA1区显微解剖(从参考修改。55)是在冰冷的双目下1 x PBS(莱卡)。 样本两个半球集中和转移到RNALater (Ambion)。 RNA隔离和深度测序进行转录组分析实验室(TAL,哥廷根,德国)。 总RNA分离使用试剂盒(表达载体)和核酸数量、质量和纯度测定使用NanoDrop分光光度计和2100生物分析仪。 图书馆准备(从1μg总RNA),序列和原始数据分析如前所述56。 读是老鼠基因组对齐亩骶使用FeaturesCount mm10和统计(http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/)如前所述57。 PCA的阴谋被创建和微分表达式,包括假定值的调整,使用DESeq执行。 2包Bioconductor58。 原始数据(fastq文件)的基因表达从GSE65159 CK-p25老鼠了36和受到相同的程序。
转录因子浓缩使用ToppGene分析(https://toppgene.cchmc.org/enrichment.jsp)。 从输出11节”。 转录因子结合位点”被选中。
伊什如前所述59。 调查列出了用于补充方法。
RNA是反向转录使用Quantitect逆转录工具包(试剂盒)。 qPCR使用SYBR绿色(Biorad) 41执行周期(10 s在95°C, 25 s 60°C, 20年代在72°C)使用CFX96实时PCR检测系统(Biorad)。 每个样本都在复制和使用Gapdh拍摄的正常化60。 引物中列出补充方法。
ChIP-Sequencing从神经核按流式细胞仪进行如前所述61与一些细微的修改。 整个海马组织使用。 输入染色质(50 ng)为每个样本孤立,后来汇集。 图书馆准备进行使用NEBNext超DNA库准备包Illumina公司(内)。 图书馆是用量子位,安捷伦2100生物分析仪。
基本要求,fastq转换和质量控制进行了如前所述57,61,62。 读取被映射到鼠标参考基因组(亩骶mm10)星对准器v2.3.010。 PCR副本从每个BAM文件使用rmdup samtools的函数63。 复制从同一组使用merge合并成一个单一的BAM文件samtools的函数63。 创建概要文件块H4K12ac使用从免疫沉淀物样本和合并后的BAM文件输入与NGSPlot非默认参数64。 微分约束分析我们第一次执行峰打电话用MACS213 q < 0.1。 然后BAM的微分约束分析文件和峰值为每个示例使用的Bioconductor内置DESEQ DiffBind包。 2个选项65。
浓缩的功能类别进行使用topGO Bioconductor包,使用加权分析选项,以避免记录广泛和冗余类别(Alexa Rahnenfuhrer, 2016)。 与加权分类假定值低于0.001被认为是重要的。
Bioconductor RRHO包是用来检测重叠失调的程度和意义Tip60 cKO和CK-p25老鼠37。 片面的铀浓缩试验是实现默认步长和假定值修正为多个测试使用Benjamini-Yekutieli方法。 此外,重叠的意义是另外测试1000年排列。
学生的t测试除非另有指示。 误差线的图形代表SEM。
生成的数据集和分析在当前的研究可从NCBI基因表达综合(GEO)存储库:GSE139298 (RNA-Seq)和GSE138830 (ChIP-Seq)。 可用性的自定义多克隆抗体TIP60P4限制是由于数量有限。
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