PS包覆NP-cGAMP的制备及表征 摘要采用油包水反相微乳液法，分两步制备了np-cgAMP脂质体。 20 ,21 ...两层脂质体膜均由负离子PS组成，其中暴露在外层的ps是APC的“吃我”信号，而内部PS与过量的阳离子Ca相互作用。 2+ 以cGAMP为核心。NP-cGAMP的平均直径为118.8 nm，负表面电荷为−40.7mV。 1B，c )。高效液相色谱分析表明，cGAMP的包封率高(71.9%)，cGAMP的有效载荷高(31.6μg/mg脂)。为研究NP-cGAMP的稳定性，采用10%胎牛血清(FBS)37°C孵育NP-cGAMP，动态光散射显示NP-cGAMP的大小在120 h内保持相对不变。 1D )。此外，为了模拟细胞外和酸性内小体环境，在pH7.4，6.5，5.0条件下，测定了NP-cGAMP在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的释药谱。 1E )。NP-cGAMP在pH7.4时释放较小，而在pH6.5时为40%，12h后pH为5.0时为80%。这些数据表明，NP-cGAMP在pH7.4时是稳定的，而cGAMP的释放是依赖于pH的。
APC对NP-cGAMP的优先摄取及Sting激活 为评价肺泡巨噬细胞(AM)、骨髓来源树突状细胞(BMDC)和骨髓源性巨噬细胞(BMDM)对PS包被NPs(PS-NPs)的摄取作用，采用dir标记的NP-dir与多种APC共同孵育。培养30 min后，三种细胞均有较强的NP-dir摄取。 2A )。相比之下，4T1-Luc乳腺癌细胞、B16F10黑色素瘤细胞或小鼠血管内皮细胞bEnd3细胞的dir信号极小(补充图1)。 1A )。为了排除APC的特异性摄取可能仅仅是由于脂质膜的负性，我们在外层用阴离子磷脂酸(PA)代替PS来改造脂质体。PA-NP(表面电荷−42 mV)与PS-NP(补充图)相比，在APC中显示出较少的DIR. 1B )。我们进一步研究了APC的特定摄取是否确实是PS依赖的.我们的数据清楚地表明，如果用抗PS抗体(Ab)预处理PS-NP以阻断表面PS(附图)，则APC对PS-NP的摄取基本被取消。 1C，d )。我们还展示了APC细胞摄取NP-dir的情况，而流式细胞仪没有显示癌细胞摄取NP-dir的情况(补充图)。 1E-H )。这些数据表明PS涂层NPs在PS介导的过程中被APC识别和摄取.
图2 APC摄取NP-cGAMP可激活刺激通路和CD8 T细胞交叉启动。 a BMDM、BMDC或AM细胞用双标PS包被NPs(红色)培养30 min，固定后与phalloidin(绿色)和DAPI(蓝色)共染色。胞内NP信号清晰。标尺=20μm。 b 用游离cGAMP(100 NM)、NP-cGAMP(100 NMcGAMP)或NP-CTR(2‘5’-GPAP)作为cGAMP的对照组，实时PCR检测BMDM、BMDC和AM炎症细胞因子基因mRNA水平的变化。 c Westernblot检测BMDM、BMDC和AM处理8h后，BMDM、BMDC和AM中针刺通路的激活。 d 流式细胞术分析共刺激分子CD 86和MHC-Ⅱ在BMDM、BMDC和AMS中的表达。 e B16-OVA细胞经单独剂量20 Gy的IR处理后，继续培养72h，与BMDC共培养18h，用流式细胞仪(FACS)分析OVA肽SIINFEKL-MHC-I分子KB复合物在BMDC表面的表达。 f ELISA法检测OT-1CD8中IFN-γ的产生 + T细胞体外培养。CD8 + 将从OT-1小鼠脾中分离的T细胞加入BMDC与IR或非IR处理的B16-OVA细胞(BMDC：t细胞=1：5)混合培养18h，ELISA法测定上清液中IFN-γ的浓度。数据显示为 n =3项独立于生物的实验。* P < 0.001 by Student’s T 测试一下。源数据作为源数据文件提供
为探讨NP-cGAMP是否能促进细胞内cGAMP的释放，激活APC中Ⅰ型干扰素的产生，将100 NM游离cGAMP或NP-cGAMP与BMDMS、BMDC和AMs共孵育4h，实时定量PCR检测Ⅰ型干扰素和其他炎症反应基因的相对表达。如图所示。 2B ，np-cgAMP诱导大幅度增加 Ifnb 1 和 IFNA 1 ，以及其他促炎基因，包括 肿瘤坏死因子 , IL1b , IL6 , IL12b ，和 Cxcl 9 ,10 ，而游离cGAMP仅略有增加(图1)。 2B )。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果与PCR结果一致，NP-cGAMP(补充图)处理的APC培养液中相应的细胞因子明显增加。 2 )。Westernblot分析显示NP-cGAMP中磷酸化的TBK 1和IRF-3水平高于游离cGAMP处理的APC(图1)。 2C )，指示针刺通路的激活。这些数据表明，NP-cGAMP能有效地使细胞内cGAMP发挥作用，激活Ⅰ型IFN和其他炎症细胞因子的产生。
np-cgAMP刺激aPC活化和交叉呈现 NP-cGAMP作用8h后，用流式细胞术(FACS)检测主要组织相容性复合体Ⅱ类(MHC-Ⅱ)和CD 86的表达。在NP-cGAMP处理的BMDM、BMDC和AM中，MHC-Ⅱ和CD 86均明显增加(右移)。 二维空间 )。这些数据，再加上先前观察到的促炎症细胞因子(见图)。 2B 和补充图。 2 )，提示NP-cGAMP能促进APC的成熟。为了研究NP-cGAMP是否能增强TA对原代T细胞的APC敏感性和交叉呈递功能，我们选择稳定表达鸡卵清蛋白(OVA)的黑色素瘤B16-OVA细胞作为模型抗原，用单一的20 Gy IR对细胞进行处理。用抗小鼠SIINFEKL-2kb抗体，检测到B16-OVA细胞抗原提呈量显著增加(附图)。 3A，b )。在游离cGAMP或nP-cGAMP存在下，B16-OVA细胞与BMDC共同孵育18h。FACS分析表明，nP-cGAMP使bdc上的OVA肽-mhc-i复合物显著增加( p < 0.05, Student’s T B16-OVA细胞孵育后，BMDC表达更高。 p < 0.001; Fig. 2E 和补充图。 3C，d )。最后，我们分离出CD8。 + 表达OVA肽SIINFEKL(OT-1)特异性T细胞受体的转基因小鼠T细胞，并放置OT-1 CD8。 + 细胞分为BMDC和B16-OVA细胞的上述混合物.ELISA结果显示，在NP-cGAMP存在下，B16-OVA辐照的BMDC在培养液中的IFN-γ水平显著升高。 2F )，指示TA特异性CD8活化。 + T细胞这些数据表明np-cgAMP能有效地促进ac的激活和TA向主要效应因子CD8的交叉表达。 + T细胞
NP-cGAMP吸入靶向给肺APC的研究 为了使NP-cGAMP通过吸入进入肺部，雾化NP-cGAMP是通过雾化系统生成的(补充图)。 4A )。这些气溶胶的平均气动力直径为1.38μm，几何标准差为1.25(附图)。 4B )，它属于深肺沉积的最佳尺寸范围。 22 ,23 ...吸入NP-dir后，在不同时间处死4T1-Luc肺转移瘤小鼠，用IVIS对大鼠主要器官进行活体解剖和成像。如图所示。 3A，b 荧光信号在48小时内仅在肺内观察到，结合IVIS数据，定量HPLC显示Rhod-b标记的NPs在肺内主要聚集，在血液和其他组织中的含量很少(见图)。 3C )。应用不同浓度或持续时间吸入NP-Rod-b，测定含转移肺NP-Rod-b浓度(附图)。 4C )，用于估算NP-cGAMP在肺内的沉积剂量。根据我们的实验方案，在pbs 5 mL中吸入np cgAMP(37 McgAMP)28 min，我们估计在动物肺中沉积的cgAMP为0.1μg cgAMP，不到用于肿瘤内注射的游离cgAMP剂量的百分之一。 8 ,10 ...基于先前公布的数学模型 22 (补充图。 4D 我们可以通过改变吸入时间或NP-cGAMP的初始浓度来控制cGAMP给肺的剂量。采用NP-cGAMP-FITC(补充图)直接测定组织中cGAMP浓度，验证吸入剂量计算的准确性。 4E ).
图3 PS-NP通过吸入靶向肺转移瘤中的肺抗原提呈细胞。 a 4T1~Luc肺转移荷瘤小鼠吸入双标PS涂层NPs后1、24和48h主要器官的代表体内荧光显像。光信号完全来自肺和 b 肺信号量化( n =3只不依赖生物的小鼠/时间；** p < 0.01, Student’s t 测试)。 c 高效液相色谱法测定吸入后4T1~Luc肺转移小鼠不同组织中罗布标记的PS包被NPs的浓度( n =3/时间)与IVIS成像数据一致。随着时间的推移，肺组织中NP含量逐渐增加。 d 吸入后24h和48h获得转移性肺组织，进行免疫荧光染色。合并后的图像清楚地表明，dir标记的nps(Red)主要与cd11c共同定位。 + 装甲运兵车(绿色)。用抗荧光素酶(紫色)共染4T1肿瘤细胞，PS-NPs在单个转移灶中分布良好，并被瘤内APCs捕获。DAPI(蓝色)，标尺20μm。e 4T1肺转移性肺巨噬细胞(AMS；CD11c)肺APC亚群的FACS特征 + F4/80 + )，间质巨噬细胞(IMS；CD11c) − F4/80 + )和发展中国家(CD11c) + F4/80 − ). f 在吸入NP-DIR后1、24、48和96h测定DIR+AMS、IMS和DC在各自亚群体中所占的百分比。 g 在吸入后不同时间测定DIR+迁移Mam、mDC 103+、mCD11b+DC在APC迁移到TDLNs中的比例。数据显示为 n =3只无生物学依赖性的小鼠。源数据作为源数据文件提供
据记载，纳米粒子在气溶胶中被输送到细支气管和肺泡后，就会暴露在肺环境中，此时它们的物理化学性质，例如尺寸和表面电荷，很可能决定了它们的命运。 23 ...我们制定了np-cgAMP，其平均直径为120 nm，因为在考虑了有效载荷和肿瘤内扩散性等多种因素后，脂质体给药系统通常在最佳的尺寸范围内接受np-cgAMP。 24 ,25 ...阴离子表面电荷也被认为更适合于脂质体的瘤内分布，同时将非细胞类型的非特异性摄取降至最低，而不是apc。 26 ,27 ...事实上，对吸入np-dir后肺组织的免疫组化研究清楚地表明dir信号主要位于cd11c内。 + APCs和抗荧光素酶共染色标记肿瘤细胞，进一步显示np-drs在单个转移瘤中分布良好，并被肿瘤内cd11c所吞噬。+ APC(图1. 三维空间 ；补充图。 5 )。定量分析显示，在APCs外仅发现一小部分NP-dir(<13%)，补充图. 5E )。我们进一步比较了转移癌和非肿瘤肺组织中APC的数量和dir信号。我们的数据显示肿瘤中的APC明显多于非肿瘤性肺组织(补充图)。 5C )，尽管在非肿瘤性肺组织中发现含有dir-NP的APC所占比例略高(在48小时时分别为67%和60%；附图)。 5F )。综上所述，这些数据表明PS-NPs穿透肿瘤组织和靶向瘤内APCs的能力。
我们还进行了流式细胞术(FACS)，以量化NP-cGAMP的摄取。如图所示。 3E ，肺母细胞分为AMs(CD11c)。 + F4/80 + )，间质巨噬细胞(IMS；CD11c) − F4/80 + )和发展中国家(CD11c) + F4/80 − )。吸入NP-dir后1h，AMS为41.7±7.0%(SD)，IMS为13.2±3.6%，DC为7.6±3.2%。 3F )。同时，TDLNs肺源性dir+MAMS和mCD 103+或mCD11b+DC随时间的延长而增加至96h。 6 ；图1. 第三代 )，表明这些Np捕获的肺APC迁移到TDLNs的能力。CD 103 + DCS在荷瘤肺中分布稀少(附图)。 7 )，但已被证明在交叉启动细胞毒性CD8中起着重要作用。 + TDLNs中的T细胞 28 ,29 ...这些数据表明，吸入可以有效地将NP-cGAMP输送到肺转移瘤内的APC.
吸入NP-cGAMP与IR对肺转移的协同作用 放射治疗是临床治疗肺癌的常用方法。在本研究中，我们研究吸入NP-cGAMP是否能增强对肺转移瘤的放射治疗。我们通过静脉注射B16-OVA细胞，建立了免疫活性小鼠黑色素瘤肺转移模型.5天后，证实双肺多灶性肺转移后，单用IR、NP-cGAMP吸入或两者兼用。分离IR(8Gy×3)传送到右肺的指定区域，同时避免纵隔和其他正常组织(附图)。 8A-d )。8Gy×3剂量方案曾被证明能诱导小鼠免疫原细胞死亡，并与乳腺癌免疫治疗协同作用。 30 ,31 ...此外，最近的一项研究还报告说，8.5Gy/次的局灶性肺辐射是安全的，不会产生不良影响。 32 ...联合治疗时，吸入NP-cGAMP后24h，分别吸入3个IR组分。第18天处死小鼠，计数肺表面转移的数量，分析治疗效果。如图所示。 4A 单用IR治疗的小鼠右肺与未照射左肺有明显区别，说明IR只影响受照肿瘤。尽管肿瘤体积减少，但与对照组相比，照射后的右肺病灶总数没有明显变化(图1)。 4B )。单吸入NP-cGAMP可导致双肺转移灶数目减少( p < 0.05, Student’s T 测试)。NP-cGAMP+IR治疗效果最高，抑制IR和非IR治疗肺转移，并导致部分小鼠肺转移完全消退( p < 0.001, Fig. 4A，b )。这些数据表明，NP-cGAMP吸入和IR诱导了较强的抗肿瘤免疫，导致辐射和非辐照肺的肺转移消退。
图4 NP-cGAMP吸入与放疗协同刺激APC介导的适应性免疫。采用静脉注射法建立B16-OVA黑色素瘤肺转移模型。注射2×10 5 B16-OVA细胞分化为C57BL/B6小鼠。第5天，在证实双肺多灶转移发生后，给予右肺分割放疗(IR，8Gy×3)，吸入NP-cGAMP(每次IR后24h，3次剂量)或同时吸入NP-cGAMP。NP-CTR(2‘5’-GPAP)作为NP-cGAMP的对照.3种NP-cGAMP吸入前6h，吸入NP-氯膦酸钠，使肺APC耗竭。耗尽CD4 + 或CD8 + 注射T细胞、抗CD4抗体或抗CD8α抗体。(400μg)分别于IR前1天和7天后重复。 a 老鼠( n 于第18天处死，并取有代表性的肺(6/组)。 n =3)各治疗组均显示。 b 在解剖显微镜下对两肺进行检查，并对每个肺的转移灶进行计数。 c , d OVA肽SIINFEKL-MHC-I分子KB在CD 103上的表达 + (CD11c) + CD 103 + CD11b − )左肺、右肺和TDLNs的DC( n 于第9天(末次吸入后24h)进行FACS分析。 e –g CD8数 + 和CD4 + 转移瘤左、右肺T细胞( n =6)是根据FACS量化的。 h , i FACS分析显示SIINFEKL四聚体的百分比 + CD8 + CD8总数中的T细胞 + 第9天获得双肺T细胞。 j 细胞内干扰素-γ百分比 + SIINFEKL四聚体 + CD8 + CD8总数中的T细胞 + 治疗组左、右肺的T细胞也按指示进行量化。数据显示为 n =6个生物独立样本。* P < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 by Student’s t 测试一下。源数据作为源数据文件提供
为了研究免疫增强的可能机制，我们首先评估NP-cGAMP吸入是否改善了TA在体内的交叉呈现。上述治疗组小鼠在最后一次吸入后24h(最后一次IR后48h)处死。对荷瘤肺和TDLN进行解剖。因为CD 103 + /CD8α + dcs被认为是交叉激活CD8的最有能力的apc。 + 小鼠T细胞 33 ,34 ,35 ，我们采用fcs门控策略来区分CD 103。 + DCS(CD 103) + CD11b − CD11c + )来自CD11b + 集散控制系统(CD11b) + CD 103 − CD11c + 进一步分析OVA肽SIINFEKL-MHC-I复合物在这两类DC上的表达情况(附图)。 7 )。与仅导致辐射肺增加的IR相比，IR加吸入可显著提高CD 103上的抗原表达。 + 双肺DCS(图1. 4C )，以及CD 103 + 在TDLNs中也检测到抗原提呈率较高的DCS(图1)。 4D )，这意味着这些APC从肿瘤部位迁移到TDLNs，在那里他们跨越了主要的T细胞。同样，在CD11b上检测到SIINFEKL-mhc-i复合物的表达。 + CD 103 − 补充图 9g )，吸入/不吸入IR治疗后也有增加。这些数据与以往的报告一致，即两类区议会均有能力在mhc-i综合大楼内摄取及处理电讯管理局局长及交叉呈现电讯管理局局长。 28 ,29 ...然而，CD 103 + 人们发现dcs在交叉激活CD8上更有效。 + T细胞，而CD11b细胞 + dcs可能参与启动CD4。 + T细胞通过MHC-Ⅱ-肽复合物 28 ,29 ,35 ...与我们之前的体外观察结果一致(图1)。 二维空间 吸入NP-cGAMP可激活双肺APC共刺激分子CD 86和MHC-Ⅱ的表达(补充图)。 9 )。接下来，我们研究NP-cGAMP吸入与不伴IR是否导致TA特异性T细胞的扩张。如图所示。 4E-g ，CD4的数量显著增加 + 和CD8 + IR、NP-cGAMP吸入后双肺均观察到T细胞，或两者兼有。然而，经SIINFEKL-mhc四聚体染色后的流式细胞仪分析表明，联合处理可使OVA特异性CD8的数量增加10倍以上，超过5倍。 + 双肺T细胞分别与对照组和单纯IR比较(图1)。 4H，i )。此外，单独吸入或联合IR可激活这些肿瘤特异性CD8。 + T细胞，其较高水平的细胞内干扰素-γ(如图所示)。 4J )。联合治疗后的TDLNs检测也显示肿瘤特异性CD8显著扩张。 + T细胞(图1. 5A，b )。为了询问联合治疗是否引起全身肿瘤特异性免疫，我们检查了治疗后小鼠的脾脏，发现四聚体阳性的CD8确实有显著增加。 + T细胞( p < 0.001, Student’s T 试验 5A，c )。我们进一步通过注射羧基荧光素琥珀酰酯(CFSE)荧光标记的OVA脾细胞进行活体生命测定(补充图)。 10 )。与非OVA标记的脾细胞的相对恒定水平相比，IR+吸入组对OVA脾细胞的杀伤率明显增加(>60%)。 p < 0.001, Student’s T 试验 5D，e )，证实诱导了全身肿瘤特异性免疫。
图5 NP-cGAMP吸入联合IR可诱导全身肿瘤特异性免疫。 a 第9天(最后一次吸入后24小时)，用流式细胞术(FACS)检测SIINFEKL四聚体的肺组织TDLNs和脾脏。 + 卵特异性CD8 T细胞。SIINFEKL四聚体的频率 + CD8 + T细胞在TDLNs( b )和脾脏( c ). d 活体生命测定。分离原代C57BL/6小鼠脾细胞，其中一半细胞用OVA脉冲处理。 257–264 在完全培养基中持续2小时。分别用高(0.5)或低(0.05)cfse标记的非脉冲和OVA脉冲细胞进行等量混合并静脉注射(i.v.)第18天(肿瘤植入后第18天)，16h后取血进行FACS分析。指出了低CFSE的代表比例。 e 联合治疗能最大限度地杀伤OVA脾细胞。数据显示为 n =6项生物独立实验。** P < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t 测试一下。源数据作为源数据文件提供
为了确定NP-cGAMP诱导的抗肿瘤免疫应答是否是APC依赖的，以及需要哪些效应T细胞来执行应答，我们在IR+NP-cGAMP小鼠中进行了耗竭研究。为了耗尽肺APC，我们使用相同的PS-NP纳米结构来包封氯膦酸盐(NP-Clod)，并在三种NP-cGAMP吸入前6h通过吸入NP-Clod传递NP-Clod。耗尽CD4 + 或CD8 + IR前1d腹腔注射T细胞、抗小鼠CD4或CD8抗体，7d后反复注射。我们发现肺APC或CD8的耗竭 + T细胞(图1. 4B )明显降低联合治疗的抗肿瘤功能，表明APC和CD8都有作用。 + 诱导的抗肿瘤免疫需要T细胞。CD4耗竭 + T细胞对治疗反应无明显影响。这些观察结果与以前的报道一致，其中单用辐射或联合使用刺痛激动剂或其他免疫调节剂可显著增强mhc-i的表达和细胞毒性CD8的启动。 + T细胞通过活化的APC 8 ,10 ,36 ,37 + 例如，T细胞通过消除Treg细胞而产生积极影响的可能性。这些数据表明np-cgAMP吸入可促进apc免疫感知和交叉激活CD8。 + T细胞，并协同放射治疗，以获得强大的抗肿瘤免疫，从而抑制照射和未照射的B16-OVA肺转移。
吸入nP-cGAMP促进炎症性TME 众所周知，TME具有极强的免疫抑制作用，这可能在很大程度上抵消了抗肿瘤免疫的作用。 3 ,38 ,39 ...为了研究NP-cGAMP吸入是否能改善免疫抑制性TME，我们分析了B16-OVA转移性肺组织。ELISA结果显示，吸入NP-cGAMP后，两肺组织中IFN-1β、肿瘤坏死因子-α、IFN-γ、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12 p40水平均显著升高(图二)。 6A )。相反，IR单独导致非辐照肺的变化不明显，尽管照射后的肺略有增加。令人感兴趣的是，CXCL 10，CXCR 3的配体，在NP-cGAMP吸入或不吸入IR后，双肺的CXCL 10显著增加(图1)。 6A )，这可能是双肺肿瘤浸润T细胞显著增加的原因之一。 34 (无花果) 4E-g ).
图6 np-cgAMP吸入可刺激促炎细胞因子，提高CD8比值。 + T/Tregs a 治疗后第9天(末次吸入后24h)，分别对小鼠左肺和右肺进行匀浆。ELISA法检测上清液中各种细胞因子的含量。数据显示为平均值±SD( n =5)。 b FoxP 3的FACS分析 + CD4 + 上述转移性肺组织中的调节性T细胞 c 定量数据显示CD8的比率显著增加。 + 单纯吸入或联合治疗组双肺T细胞/Tregs比值明显降低。数据显示为 n =6个生物独立样本。** P < 0.01; ***p < 0.001 by Student’s t 测试一下。源数据作为源数据文件提供
越来越多的证据表明，肿瘤特异性效应T细胞和Tregs的平衡控制了抗肿瘤免疫水平。 14 ,40 ...如图中所示。 4 和 5 仅IR能促进肿瘤浸润T细胞在两肺中的适度但显著增加。然而，IR也导致肿瘤浸润FoxP 3的数量增加。 + CD4 + Tregs，从而显著降低CD8的比率 + T/Tregs在照射肿瘤中的作用( p < 0.05, Student’s T 试验 6B，c )。其他人也报告了类似的意见。 10 ,41 ...然而，np-cgAMP吸入后，这种负面效应被消除，从而显著提高了CD8的比值。 + 双肺T/Treg(图1)。 6B，c )。这些发现与最近的几项研究一致，这些研究报告说，Sting通路或Ⅰ型IFNs激活可直接抑制协同刺激依赖的Treg活化和增殖。 37 ,42 ...因此，与直接瘤内注射不同的是，我们的吸入策略使NP-cGAMP能够输送到照射和非辐照肺的病变，以刺激促炎细胞因子和抑制Tregs。这些数据进一步重申了克服免疫抑制性TME的必要性，不仅在照射肿瘤中，而且在非辐照肿瘤中，以获得强有力的抗肿瘤免疫。
4T1乳腺癌肺转移的疗效证实 为了确定IR和NP-cGAMP吸入所产生的抗肿瘤免疫功能是否仅限于B16-OVA肺转移，我们将我们的研究扩展到4T1乳腺癌肺转移。为了模拟乳腺癌肺转移的临床发展，我们将4T1-Luc细胞移植到乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到~500毫米时 3 第14天，原发肿瘤被手术切除。第18天，经生物发光成像证实肺转移后(Bli；图1)。 7A )将小鼠随机分组，单用IR(右肺)、NP-cGAMP吸入，或两者兼用，剂量和时间与B16-OVA研究相同。应用BLI和MRI对治疗后肺转移瘤的生长进行监测。与对照组相比，单独使用IR或NP-cGAMP的小鼠在第32和39天的BLI信号明显降低，提示肿瘤生长延迟(图1)。 7a，b )。IR+NP-cGAMP吸入会进一步降低BLI信号，甚至在某些动物中观察到完全的信号丢失(图1)。 7A )。MRI定量评估肿瘤体积变化，测量单个肺转移，并总结得到每只动物的肿瘤总体积。联合治疗组肿瘤总体积明显小于单纯IR或单纯吸入组(图1)。7C，d )。影像资料与肺转移瘤的活体检查一致(图一)。 7E )。在长期生存研究中，如Kaplan-Meier生存曲线所示，用IR+吸入治疗的小鼠存活时间明显延长( p < 0.001, log-rank test; Fig. 7F )，其中50%( n (4)完全治愈，至少150天没有任何疾病的迹象(见图)。 7F )。类似于B16-OVA研究，我们发现NP-Clod耗尽肺APC后，存活效益被取消。 7F )，重申APCs在观察到的抗肿瘤免疫中不可或缺的作用。此外，长期存活的小鼠抵抗继发性肿瘤挑战，这表明联合治疗在此模型中触发了抗肿瘤记忆(如图所示)。 7g ).
图7 NP-cGAMP吸入联合IR对4T1乳腺癌肺转移有明显疗效。雌性BALB/c小鼠骨性植入1×10 6 4T1-Luc细胞进入第四乳脂肪垫。第14天肿瘤大小达到500毫米 3 切除原发肿瘤。第18天，在胸部显示生物发光显像(BLI)信号证实肺转移后，给予右肺分割辐射(IR，8Gy×3)，吸入NP-cGAMP，或两者兼用。每次IR后24h吸入NP-cGAMP，共吸入3次.于第18、32、39天行纵向BLI和MRI监测肺转移瘤的生长情况。 a 治疗组和治疗组3只具有代表性动物的IVIS图像 b 定量胸片的BLI光强。数据显示为平均±S.E.M。的 n =6只无生物学依赖性的小鼠。 c 各治疗组小鼠胸部MRI T2加权纵向随访 d MRI定量肿瘤体积。数据显示为平均±S.E.M。4-5只老鼠。* P < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 by Student’s T 测试一下。 e 第39天，各治疗组均显示活体肺图像。吸入NP-CTR(2‘5’-GPAP作为cGAMP的对照)3次，另加NP-cGAMP+IR组，在三种NP-cGAMP吸入前6h分别吸入NP-cGAMP和IR。 f Kaplan-Meier生存曲线o f 治疗组在肿瘤后140天内( n =8/组)，用对数秩检验进行统计分析，* p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. g 用NP-cGAMP+IR治疗小鼠，56天后用4T1-Luc细胞进行再攻击.同时挑战天真小鼠作为阳性对照。数据显示每组小鼠排斥4T1-Luc肿瘤的百分比。源数据作为源数据文件提供
与以前在b16-ova模型中的观察一致，机理研究显示吸入np-cgAMP可激活4t1-luc转移的肺中的apc，CD 103上的CD 86和mhc-ii的表达显著增加就证明了这一点。 + DCS，CD11b + DCS和AMS(附图) 11 )。吸入NP-cGAMP还导致IFN-1β和其他促炎细胞因子在两肺中急剧增加(附图)。 12 )。此外，NP-cGAMP吸入或不伴IR可增加肿瘤浸润T细胞的数量(附图)。 13 )和活化的CD8 + 双肺T细胞。 8a，b )。与b16-ova一样，IR单独诱导FoxP 3肿瘤浸润明显增加。 + CD4 + Tregs与CD8比值降低 + 照射肺中的T/Tregs(图1)。 8C，d )。然而，np-cgAMP吸入通过显著增加CD8来抵消IR的负面影响。 + T/Treg比率( p < 0.01, Student’s T 试验 8C，d )。CD8免疫组织化学染色 + T细胞与FoxP 3 + 肺转移瘤的Tregs与FACS数据一致(图1)。 8E，f )。结合以往对B16-OVA模型的研究，NP-cGAMP吸入加IR能有效控制肺转移.
图8 吸入np-cgAMP可激活CD8 T细胞，提高CD8比值。 + T/Treg在4T1肺转移瘤中的应用最后一次吸入后24小时，小鼠正在接受指示的治疗。 n 取6只不依赖生物的小鼠/组，解剖两种转移肺，进行流式细胞术和免疫组织化学研究。 a 在体外用佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯/离子霉素刺激T细胞后，有代表性的FACS点图( n =5000) + T细胞通过染色细胞内干扰素γ从左、右肺(IR)的每一个指示治疗。 b 干扰素-γ频率的定量分析 + CD8 + 左、右肺T细胞。 c 有代表性的FACS分析和 d FoxP 3的定量频率 + CD4 + Treg细胞与CD8/Treg比值。 e CD8免疫组织化学染色 + T细胞与FoxP 3 + 转移瘤肺组织中的Tregs n 3小鼠经指示治疗后，其CD8/Treg比值的平均值为±SD比值，定量数据显示肺转移瘤的CD8/Treg比值。 f NP-CTR：NP-2‘5’-GPAP作为NP-cGAMP的阴性对照；IR(L)和IR(R)：单纯IR的左(非辐照)和右(辐照)肺；NP-cGAMP+IR(L)或IR(R)也是如此。标尺=20μm.* P < 0.05; ***p < 0.001 by Student’s T 测试一下。源数据作为源数据文件提供
为进一步探讨联合治疗的疗效，我们对上述4T1肺转移方案进行了改进，保留原发肿瘤，无需手术切除。除相同的联合肺治疗外，原发肿瘤采用瘤内注射或不注射NP-cGAMP治疗。我们的数据显示，联合肺部治疗对控制原发性肿瘤的作用不大(附图)。 14A-d )。然而，联合瘤内注射NP-cGAMP(5g×2)，IR加NP-cGAMP吸入可显著延缓原发肿瘤的生长，提高生存率(附图)。 14A-d )。FACS分析显示原发肿瘤APC成熟明显增加，肿瘤浸润激活CD8。 + T细胞和CD8 + /Treg比值联合肺治疗加瘤内NP-cGAMP(补充图)。 14E-I )。相反，无瘤内np-cgAMP的肺治疗，即使提高了效应细胞CD8的活性，也基本不引起原发肿瘤的TME改变。 + T细胞明显可见于这些小鼠的脾脏(附图)。 14 e-j )。这些结果与最近的一些出版物是一致的。 43 ,44 ...Chao等人 43 报道了放射加瘤内cpG治疗原发性4t1肿瘤对肺转移的影响不大，而全身抗ctla 4抗体的加入则降低了肺转移，延长了生存期。 43 ...免疫检查点抑制剂以其激活肿瘤浸润效应T细胞的能力而闻名，这些T细胞在远距离未治疗的肿瘤的TME中被耗尽。综上所述，这些数据支持了我们的假设，即免疫抑制性TME会对抗癌免疫产生负面影响，必须加以克服，才能获得持久的抗肿瘤免疫。
吸入np-cgAMP是安全的 脂质体是生物相容性和安全的，因为大多数临床上批准的NP药物都是在脂质体中配制的。非麻醉小鼠对NP-cGAMP的吸入有较好的耐受性。为了研究NP-cGAMP吸入是否可能引起全身免疫毒性，我们通过监测体重，测定血液中细胞因子和肝酶的含量，并对健康小鼠和肺转移荷瘤小鼠的主要器官进行组织病理学检查，进行了系统的研究。在健康队列中，对照组与吸入组在治疗后第1天或第22天的体重、肝酶、谷草转氨酶、丙氨酸转氨酶或细胞因子均无显着性差异(补充图)。 15 )。同样，在携带肺转移瘤的小鼠身上也没有发现明显的变化(附图)。 16 )。第1天或第22天主要器官的苏木精和伊红(H&E)染色在健康或肺转移荷瘤小鼠中未见明显的形态学改变。 17 )。为了研究这种治疗是否会引起短期或长期的肺毒性，我们首先在治疗后的第1天和第22天对健康的小鼠进行了检查。H&E染色未见明显的形态学改变，如出血，尽管在第1天IR+吸入治疗的肺组织中细胞浸润增加，可能是白细胞，但在第22天，肺内没有炎症迹象(补充图1)。 18a，b )。然后我们研究了四只经联合治疗后治愈的小鼠。在第150天牺牲后，包括肺、肝和肾在内的主要器官的视觉检查没有发现明显的病变；组织学检查没有发现肺部的微小病变，证实没有残余转移(补充图5)。 18C )。未照射的左肺肺泡形态、肺泡壁厚度和微血管形态均与健康肺相似。虽然照射后的肺中有几个小区域可见巨噬细胞团簇和一些稍增厚的肺泡壁(附图)。 18C )无明显的病理改变，如纤维化。缺乏局部和全身毒性可能归因于NP-cGAMP的APC靶向能力和吸入所用的低剂量，这导致其他肺细胞吸收的cGAMP数量微不足道(图1)。 三维空间 ；补充图。 5 )或进入血液(如图所示。 3A-c )。然而，NP-cGAMP与IR联合吸入治疗肺转移是安全有效的.
