您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!
本企业通过iso9001质量体系认证

微阵列嵌入/分离用于3D细胞球体的并行分析

发表时间:2019-11-11 15:24作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

微阵列嵌入/分离用于3D细胞球体的并行分析

摘要

三维细胞球体模型可用于预测药物和疗法的效果和组织发展模式和再生。 这些模型的效用是增强高吞吐量3 d球体文化技术让研究人员有效地文化在不同实验条件下大量的球状体。 详细分析高吞吐量的球体文化是更有效和一般局限于狭窄的输出,如代谢能力。 我们描述一个微阵列的方法,使传统组织学嵌入/切片染色可行的大型3 d细胞球体样本集。 应用这种技术提供的详细方法。 分析方法验证潜在的高效并行组织学分析96球状体。 通过集成高吞吐量3 d球体文化技术和免疫组化技术先进,这种方法将允许研究人员有效地探测多个生物标志物的表达与空间定位在3 d结构。 定量的比较染色改善了国米和intra-experimental再现性作为集体处理多个样本,染色,成像一个幻灯片。

介绍

生物系统极其复杂,不是由传统的二维细胞单层培养模型。 在单层细胞培养采用平/传播形态的大多数细胞附件分平面基板在基底表面的每一个细胞。 在这个配置中,营养和药物的扩散是不受限制的在顶端表面和有限基底表面。 信息坚持路口发生只在形态学的周长扁平细胞。 这些条件远非代表一个细胞是正常的在活的有机体内微环境,一个三维的安排允许大量细胞接触与血管结构和细胞外基质,促进氧的扩散,营养,代谢产物、激素、生长因子和细胞因子的细胞组成的固体组织之间和肿瘤(无花果。1 a, B)。 另外,细胞可能在三维培养总量使用方法如悬滴细胞球体文化模仿的生理学在活的有机体内系统在微尺度水平上1,2。 细胞在三维配置采用适当的形状,经验和信息联系和营养扩散在所有的方向,和更密切的代表的自然微环境组织和肿瘤。 营养交换发生在所有飞机通过相邻的细胞层。 结果差异由于细胞培养条件可以通过测量证实药物响应特性相同的细胞培养在2 d和3 d的文化系统3.,4,5。 因此,三维细胞培养模型是重要的(1)精确建模机制的正常生理过程,肿瘤生物学和组织再生,(2)筛查和评估新的治疗方法6,7

图1
figure1

图表显示(一个)周边信息接触,单在2 d表面扩散。 (B)全球信息接触和全球扩散通过周围的细胞在3 d。 (C)总值的3 d细胞球体(活细胞染色calcein-AM)是相似的形状和大小(D)结构构成一个在活的有机体内乳腺癌肿瘤生长在一只老鼠23。 (E)传统组织微阵列(TMA)使用一个数组取心器切除和安排组织核心从石蜡包埋组织标本石蜡块。 (F)球面阵列排列在琼脂糖水条件和稳定。 整个微阵列和安装盒与石蜡渗透使切片。

3 d的潜在文化一直在研究社会公认的患病率增加期刊出版物和许多产品的发展,促进高吞吐量3 d球体文化8,9,10。 然而,这些文化系统的多功能性是有限的由于缺乏高吞吐量的免疫组织化学生物标志物分析的方法11。 组织学和免疫组织化学染色法识别和量化生物标志物表达在细胞研究和很容易集成到二维数组96样品和更大的文化。 然而,这种分析3 d的文化需要深共焦成像或切片和染色的个体样本12。 这两种方法都产生有价值的生物信息,包括空间位置在三维球状体,但效率低下和研究成本可能非常高。 高吞吐量3 d在体外模型必须符合高效的组织学和免疫组织化学分析来实现他们的潜力。

这手稿描述了一个简单的、低成本的微阵列技术,提高了分割效率/染色分析三维球状体。 以前,这种方法是有效地用于分析脂肪衍生干细胞(ASC)对脱细胞组织粒子13。 这个手稿的目标基准性能的技术,优化的方法,认真详细地描述方法,使复制和在其他实验室进一步细化。 固定三维球状体排列在同一个平面上使用微阵列的油井稳定的琼脂糖凝胶矩阵石蜡包埋和切片(无花果。1 f)。 原则上,描述的方法与组织微阵列共享许多相似之处(TMA)取心方法目前用于组织活检样本转化为数组进行分析。 TMA取芯方法革新了病理学领域通过增加效率和吞吐量14。 传统微阵列程序使用岩心钻机带圆柱芯直径小至600μm,和几毫米长,从石蜡包埋组织样本。 样品是手工转移到一个微阵列的一块石蜡收件人安排(无花果。1 e)。 尽管这种方法在技术层面上是不可能在体外三维球状体,小尺寸使得它很难安排他们在同一剖切面进行平行分析。 此外,传统TMA需要专门的设备和训练有素的操作员取心。 描述的方法在利用简单的设备允许球体含水条件下微阵列排列。 96是球状体精确地排列在一个芯片在同一剖切面进行高效的处理和分析。

方法

微阵列-模具制造

凹模是捏造的限制在球状体微阵列模式。 这些消极的模具可以渗透与琼脂糖sectionable球体微阵列石蜡块。 凹模可以由塑料或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。 制造PDMS阴模,有图案的积极的数组,我们将称之为“pre-mold”是需要生成最终的PDMS -模具。 “pre-mold”测试的两种方法:(1)铝pre-mold:加工一块坚硬的铝使用电脑数控机床(数控)和(2)琼脂糖pre-mold:琼脂糖溶液是尼龙模板。 尼龙模板加工使用车床,钻床。

铝pre-mold方法(PDMS)

积极、铝模具设计在SolidWorks™(文件,补充方法S.15使用5°)和加工,1/32“锥形立铣刀(福特)通过一个电脑数值控制(CNC)的过程(无花果。2)。 5°的端铣刀蜡烛被选中在脱模提供救济。 文章是尽可能在加工范围之内。 例如,典型铝模具的最终尺寸是直径1.5毫米×1.5毫米高的职位之间的中心距为2.39毫米的帖子在数组中。 随着使用的铝是Slygard®184硅酮弹性体工具包(base-to-curing代理比7:1)创建一个PDMS -模具。 铝硅混合物倒在积极塑造成一个125毫米培养皿,允许治疗在65°C真空下一段24小时来创建最终的PDMS -模具。 采用这一方法被用于生成微阵列分析提出了手稿。

图2
figure2

凹模制造三个替代方法:(1)铝pre-mold加工一块坚硬的铝和沉浸在PDMS培养皿内然后删除留下PDMS -模具。 (2)琼脂糖pre-mold投在一个塑料模板,模板在哪里加工从杆使用车床,钻床。 塑料模板是治愈充满琼脂糖溶液形成的水凝胶和沉浸在PDMS在培养皿中删除。 PDMS治愈后的琼脂糖凝胶被留下PDMS -模具。 (3)可以直接使用塑料模具的凹模时通过PDMS膜孔密封按模具的底部和保护用胶带(补充视频2).

琼脂糖pre-mold方法(PDMS)

琼脂糖pre-mold方法涉及加工尼龙(或其他塑料)模板,用于祭祀琼脂糖pre-mold(图。2)。 消极的模板加工塑料杆使用车床,钻床。 例如,尼龙圆柱杆的直径50毫米被切割的高度~ 7毫米,创建一个短,宽圆筒(磁盘)。 单个孔车床30毫米直径的5毫米的深度同中心地平尼龙缸的边缘,因此创建一个尼龙杯。 通过与直径1.5毫米的孔钻在一个微阵列模式的基地内凹的表面使用钻床。 创建数组之间的间距为1.75毫米阵列中的每个孔的中心; 洞深处2毫米。 这种方法允许closer-packing孔的微阵列相比,铝pre-mold方法。 PDMS薄膜被按下底部的模板和录音水封的小孔。 然后它充满了3% wt / v创建一个琼脂糖pre-mold琼脂糖的解决方案。 pre-mold是捏造使用微型喷气发动机协议详细描述图3.以确保消除气泡。 必须注意确保琼脂糖的基础pre-mold完全平行,脸微阵列的支柱。 在室温下固化后,积极的琼脂糖pre-mold培养皿放置在一个125毫米,覆盖着PDMS (Slygard, 7:1 base-to-curing代理),并允许治疗真空60°C下了2天。 积极的琼脂糖pre-mold分解,从PDMS与小工具和模具压力水留下了PDMS -模具包含一个微阵列的油井。

密封塑料模具的方法

第三种方法可以用来进行琼脂糖球体微阵列使用塑料模板作为凹模(补充视频2)。 通过孔的塑料模具,制作和密封如上所述,可以直接作为凹模根据图中描述的方法3.

球体芯片制造和加工

消极的微阵列模充满了去离子水(无花果。3 a, B)。 微气泡被用1毫升吸管和以下微型喷气发动机技术(图。3)。 吸管很沮丧之前提示被淹没进microwells上面的水。 按钮被释放,并多次发布的抑郁和通过小弧线运动的发送微型喷气发动机的水(~ 100µL)水下微气泡被困在数组导致泡沫喷射。 删除所有成功的芯片制造微气泡势在必行。 另外,微型气泡可以通过离心5分钟的水填满模具在1500 rpm高度的有效性。

图3
figure3

琼脂糖芯片制造(球状体)。 (一个)微型喷气发动机的泡沫去除技术。 (B)球体重力转移技术。 (C)水去除。 (D)琼脂糖渗透/混合。 (E)最后一盒在PDMS凹模上的立场。 (F)96在12×8琼脂糖微阵列连接到嵌入式球状体切片盒从侧视图。 球状体似乎在同一切片平面平行(白色虚线)和盒式基地。 作为参照系,黄色虚线显示球体抵消在z方向会发生2°错位的琼脂糖微阵列剖切面。 (G)的图像一个块的顺序过程从球体微阵列流泻在水中(步骤开始B上图)通过石蜡切片染色(大型组织碎片放在两个井的球状体而不是容易识别芯片取向)。 视频可以在补充视频1

细胞球状体(培养中所描述的补充方法S.1 & S.2)分别被放置到microwells使用1毫升吸管和重力转移技术。 第一个吸管提示是削减在45°角约2 - 3毫米的远端,以便通过~ 500µm球状体。 用移液器吸取了球状体从96年GravityTRAP™板,然后上面的吸管小费就淹没在PDMS -微阵列所需的好,固定在垂直方向,而令人沮丧的柱塞。 这允许球体的修改后的吸管陷入适当的微阵列单独使用重力(无花果。3 b)。 数组的24 -(4×6)和96(8×12)创建使用球状体96 - PDMS模具。 24-spheroids数组创建使用中央井96 -模具。 球体放置使用执行目视检查和验证使用倒置光学显微镜(卡尔蔡司Axio Vert.A1)。

上面的删除多余的水后的顶级井(图。3 c),验证数组与琼脂糖渗透(图。3 d)。 超纯™琼脂糖(表达载体,16500500)加入去离子水为3% (wt / v)和煮直到均匀。 琼脂糖浓度选择基于实验中所描述的补充方法S.4。 琼脂糖溶液冷却到80°C和用于渗透组装微阵列的移液的速度大约0.1毫升/秒到模具的角落(无花果。3 d)。 琼脂糖添加到轻微的半月板成立开模具的高度之上。 纸巾盒(同向转移)然后安装图所示。3 e和额外的琼脂糖盒的顶部,添加了琼脂糖将包围盒在基底和顶端表面,修复盒式琼脂糖微阵列坚定。 渗透模具和磁带被放置在烤箱在65°C 5分钟减少冷却/固化,同时促进琼脂糖的混合成的底部每个。 微阵列组装然后删除,在室温下冷却了45分钟。 完成微阵列被剥皮小心翼翼地从模具中删除,把磁带,这是严格遵守之前的琼脂糖微阵列(视频过程中可用补充视频1)。 琼脂糖微阵列是脱水和渗透机械振动,中速,在37°C使用以下一系列100毫升溶液洗(#洗X持续时间)在尿液标本容器(Starplex Leakbuster, 120毫升):50%乙醇(1×3人力资源),70%乙醇(1×3人力资源),85%乙醇(1×3小时)。 95%的乙醇(1×3人力资源),100%乙醇(3×3人力资源。 + 1晚),HistoClear II(国家诊断,3×3人力资源),熔融石蜡(Fisher Histoplast LP, 5×3人力资源。 60°C)。 流体混合可以观察到外围芯片的光和摇晃的标本缸。 不完全混合解决方案可以通过光的折射可视化micropillars附近流体边界层干扰。 此类解决方案彻底动摇了的手,然后被允许一个额外的小时的混合瓶在先进的下洗。 一系列的图像后一个球体微阵列通过包埋和切片程序图所示。3 g。 从这个微阵列(图分析的部分。3 g)被用来有效地研究脱细胞细胞外基质颗粒对脂肪的影响衍生干细胞分化在80年的一项研究球体样本13

切片机校准与组织学处理

石蜡渗透琼脂糖球体微阵列安装在一个切片机有三个轴的自由。 为了获得部分含有球状体的最大数量最优切削平面平行于球体的常见的平面微阵列。 一个程序中描述的补充方法S.5(补充视频3.)是用于对齐截平面的顶面石蜡块。 剖切面之间的角度偏差和球体的常见的平面阵列称为倾斜(θt在无花果。4)。 所有的球状体的临界倾角在微阵列不能获得在同一幻灯片估计使用几何计算描述的补充方法S.6- - - - - -8。 实验在实践中倾斜,与描述相关联的程序是由观察琼脂糖柱的外观从微阵列的不同地区连续部分(补充方法S.9)。 所有标本被在20µm或7.5µm部分,使用常规染色)和加蓝的代理商(VWR发蓝处理代理RTU),和安装使用Fluoro-Gel te缓冲(电子显微镜科学)。 处理对球体大小的影响由于膨胀和收缩是量化描述的补充方法S.10

图4
figure4

倾斜在解剖和组织学上球体区域部分的关系和倾斜角度。 (一个)图解模型显示预测截平面通过一行12球状体的三种不同角度的倾斜& # x03F4;t= 0,0.5 & 1°。 视图是在xz平面轴穿过行中的每个球体的中心。 (B)估计的横截面视图的行(从球状体一个),他们会出现在组织切片。 颜色的虚线对应于一个“理想”截面通过每个球体的中心。 图表所示6×4、8×6 & 12×8阵列的角度& # x03F4;t= 0,0.5 & 1°。 (C)几何计算预测临界角时,最远的球体在完全缺席的中心部分。 (D)的坐标系统和角度倾斜在xz (& # x03F4;tx)和y (& # x03F4;)飞机显示针对一个琼脂糖微阵列。 (慧拓)五个连续的部分(的示意图安妮)从一个琼脂糖微阵列石蜡包埋块从xz平面。 (E-bottom)相应的排柱子出现连续5日组织部分用于计算实验倾斜的琼脂糖微阵列系统。

量化系统的功效

四个独立的微阵列块(n = 4)每个包含24-spheroids分析来确定质量、数量和再现性的球体转移组织学幻灯片和处理的影响。 数组中的球状体的数量被成功转移到组织学部分量化使用25%的最大可能球体横截面积阈值(补充方法S.11).

结果

理论分析倾斜

数字4显示了一个视觉估计的球状体将截面根据数组的中心距离和倾斜的角度。 这个示意图分析假设所有球状体微阵列在同一个平面上每个~ 500之间间距为2.39毫米µm直径的球体。 图中所示的虚拟解剖平面。4从xz平面的角度(定义在无花果吗3 g4 d)。 三个虚拟角度倾斜(Θtx= 0,0.5 & 1°)和三个不同大小的球体微阵列(6×4、8×6和12×8)中包括示意图。 估计球体截面上合组织切片图可视化。4 b用虚线表示球体截面理想0°倾角。 这种分析清楚地显示了重要的逆倾斜角度和球体横截面积之间的关系在组织切片和数组大小和横截面积之间的反向关系最外层球体在数组中。 临界倾角最外层球体完全错过了在一系列完美的50 - 1000µm直径用无花果球状体。4摄氏度(补充所示示例计算方法S.7)。 三个不同大小的数组(12×8、8×6 & 6×4)和两种不同的球状体之间的间距(2.39毫米和1.75毫米)绘制。 更大的间距与铝pre-mold关联方法和小间距与琼脂糖pre-mold方法相关联。 临界倾斜角度变化从1000年6.51°µm球状体在一个紧凑的数组为50 0.109°µm更广泛的球状体。 保持外球体区域部分横截面积的比例> 90%的最大可能,无花果的临界角。4摄氏度~ 25%的球体直径的球体感兴趣的可以作为一个粗略的估计。 例如,125年的临界角µm球体在一系列12×8 2.39 mm间距是0.272°。 125µm一样大小的球体直径为25% 500µm直径可以估计12×8的外球面阵列500嗯球状体和2.39 mm间距> 90%的最大横截面积集中组织切片的倾角为0.272°(示例中所示计算补充方法S.8).

倾斜试验分析

数字4 d, E实验表明倾斜值与琼脂糖柱的数量连续发生在部分。 在无花果。4 e,A, B, C, D和E代表一行琼脂糖柱连续出现在组织学部分。 作为后续部分,琼脂糖柱部分变化的数量由于削减的深度和角度倾斜。 琼脂糖柱连续部分被数的数量来确定实验倾斜与方法(补充方法S.9沿着轴(θ)平均倾斜tx)被确定为0.115°,关联预测< 2%横截面积失去最外层球体在12×8 500年微阵列µm球状体。 沿着轴倾斜(θ)略大的0.154°相应预测< 1%区域失去最外层球体在12×8 500年微阵列µm球状体。 这些结果表明,球体芯片制造、装配和切片方法允许非常准确对齐的琼脂糖微阵列的平面分割平面(xy)。

处理效果

球状体脱水和处理过程中温度升高。 膨胀或收缩的球状体在处理过程中可能会影响后续的解剖和分析这些影响是量化的。 40球体样本集,预处理球体最大横截面积,以PBS多聚甲醛固定后,1.728×105µm2(σ= 2.270×104,n = 40)和后处理最大横截面积,以清白的组织学部分,是1.312×105µm2(σ= 7.021×103.,n = 37)。 这表明平均球体横截面积减少24.1%,减少13.0%的球体直径与脱水和包埋处理效果。 学生的t检验表明,这一结果具有统计学意义(p = 1.594×109< 0.001)。

球面阵列组织学处理的效率

球体微阵列组织学将最强大的球状体的最大数量出现在一个单一的部分并行分析,当这些理想的部分可以被捕获的最大数量为不同的染色标记在多个幻灯片。 因此,与解剖相关的两个重要指标进行了分析:(1)的组织学部分总数内每个球体出现在一系列连续的部分和(2)许多不同的球状体出现在一个单一的部分并行分析。

单个球体系列

一个球体的图像显示在PBS多聚甲醛固定后,但在琼脂糖和石蜡处理和嵌入(无花果。5~ 250µm直径)切片后,但之前补液和染色(图。5 b)。 理论的部分,可以从这个球体和横截面积出现在每一个部分都可以估计使用球体直径和截面厚度(无花果。5度)。 这一个球体的截面在一系列连续十一个部分在图所示。5 d(选择放大图片所示的补充方法S.12)。 每个部分的厚度是20μm。 因此,连续11个部分代表总深度~ 220μm系列的部分图所示。5 d。 这个同意球体的大小测量处理后(图。5 b)。 串行部分如无花果所示。5 d是重要的分析特定区域的球体或创建3 d重建。

图5
figure5

球体(htb - 126)处理效果和分节(一个在PBS) Brightfield图像的球体固定(B)相同的球体后加工和嵌入在石蜡切片的微阵列。 (C从单个球体)连续部分的示意图使用图中的坐标系统。3 g。 (D)一个球体的横截面(彩色))出现在连续十一20µm部分数字缝合在一起在一个单一的形象和连续的标签。

微阵列部分

能够获取一定比例的球状体嵌入在一个幻灯片使用琼脂糖微阵列的方法定量分析了6×4球体数组,数组和定性12×8。 定量分析四6×4微阵列包含~ 500µm直径(htb - 126)分段和球状体的总数及其位置的数组被数球状体。 数字6显示八20µm)染色部分取自一个6×4数组在零放大(注意,两个球状体被故意放在C4作为参考点东方部分)。 定性,它可能指出,22日24球状体数组中出现在至少四个部分,有些更突出的球状体系列的开始,而另一些则更加突出。 球状体的平均百分比出现在每个连续的五个最好的部分(选择和计算中描述的补充方法S.11)的四个街区(n = 4)为79.2,80.8,86.7和90.0%,总的结果平均回收率20.2/24 + /−1.2每节球状体或84.2%(404 480:4块* 24球状体块* 5部分/块= 480)。 数字6 b是一个热图代表球体复苏基于微阵列的初始位置。 这些数字在无花果。6 b代表总数的球状体恢复从一个单独的位置在微阵列最好的五个部分的四个6×4球体块分析(最大可能得分= 20,四块逐块* 5个部分)。 球状体的总体数量在每一行,列,和个人的数组是编译是否球体损失更有可能在周长等领域或微阵列的角落。 方差分析统计分析比较夺回利率之间的行,列和个别井没有确定任何系统的损失与不同地区或井相关球状体。 没有单一的行(p = 0.48),列(p = 0.25)或(p = 0.28)被发现夺回速度比其他任何不同。 作为一个概念证明与更大的数组,使用这种方法的图像部分从12×8微阵列包含不同类型的球状体和球体复苏的指标是编制图所示。6 c, D和描述的补充方法S.13。 一个数组是由乳腺癌细胞(htb - 126) ~ 500µm球状体直径。 另外两个数组是由细胞(C2C12成肌细胞直径圆盘形状~ 500µm球状体和~ 200µm高度。 出现球状体的平均数量(最小横截面积> 25%的中心削减)5最佳幻灯片上每一块从86.3%至62.9不等。

图6
figure6

微阵列部分和分析。 (一个)八20µm串行部分来自6×4球面阵列(订购10、9、8、7、5、3、2、1; 从左上角到右下角; 部分4 & 6期间损坏或折叠24-spheroid微阵列处理和不可用)。 (B)热点图包含的次数一个球体夺回从各自在5最好的四个不同部分24-spheroid微阵列(max = 20)。 (C)从三个不同的部分96 -球体数组分别显示(左上角到右下角):htb - 126沾着他走时,C2C12(块1)清白的部分与琼脂糖柱可见,C2C12(块1)沾他走时,C2C12(块2)染色)。 (D)表描述了每个三个96球面阵列(12×8)分段块和随后的幻灯片。 回收率是球状体的数量出现在一个幻灯片。

讨论

建立了三维球体模型作为一种高级生物的代表在活的有机体内肿瘤相比,传统的二维方法。 因此,肿瘤球体模型成为一个有价值的工具,用于研究癌症生物学和筛选药物。 这些发展导致增加研究成果以及几家公司的形成,市场对高吞吐量3 d实验室产品文化。 然而,这些系统通常只应评税比色输出可行性/扩散和没有提供详细的球状体生物标志物染色方法在高吞吐量。 这种限制变得越来越重要,因为更复杂的抗癌药物开发目标特定通路(除了细胞死亡)控制肿瘤进展和转移15,16,17,18。 琼脂糖球体微阵列方法使肿瘤切片/染色程序访问3 d模型通过增加吞吐量~ 96倍。 之前的研究表明,琼脂糖嵌入不破坏生物染色19,20.,21,22。 这种效率的增加直接导致劳动力和试剂的主要减少时间和成本的研究。 因此,这个工具的帮助下,研究人员可以进行之前不合理的3 d肿瘤模型研究与多组,时间点,治疗组,复制或扩展个性化医疗的技术方法。 此外,染色比较样本在同一芯片幻灯片将更加一致,因为所有的样品处理,染色,并行成像。 研究人员也能够检索空间定位的生物标志物分布调查与药物和营养相关的区域影响扩散和缺氧的影响。

球面阵列嵌入/解剖包括的好处

  • 增加吞吐量96在一块球状体

  • 更一致的染色对比样品在同一幻灯片

  • 生物标志物分布的空间定位

这个手稿的目的是传播这个工具,世界各地的研究人员鼓励他们进行高通量实验3 d肿瘤模型的层次,目前是不可能实现的。 我们预计方法相当可转让的,因为有限的几个运营商组织学经验是训练技术,通常可以用有限的重复执行。 三种方法制造的负面描述模具适应特定的实验室资源,方法和目标。 微阵列的制造模具使用铝制积极pre-mold优势包括一个单步过程模具,和有限的PDMS模具之间的差异; 然而,这个方法涉及一个更昂贵的/困难的加工过程并提出了限制数组也不管他打到第几洞间距由于所需工具制造的积极铝pre-mold。 制造使用塑料凹模或琼脂糖pre-mold过程更容易,需要较少的技能和编程制造,允许很多不同的几何图案更迅速地进行测试。 这种方法还允许接近孔位置,因为它缺乏需要考虑模具间隙。 琼脂糖pre-mold方法是以潜在的代价的PDMS模具之间的可变性,以及额外的琼脂糖步骤可能会引入水准问题随着材料容易膨胀和收缩取决于环境条件。 最重要的一个方面的琼脂糖微阵列嵌入方法与其他方法相比19,20.直接是数组的固定盒基本在同一个平面上为基础(无花果。3 e, F补充视频1)。 这允许数组很容易对齐的分割平面调整刀片的安装的切片机。 另一个优势是球状体嵌入琼脂糖柱子的顶端。 很容易想象琼脂糖柱刚割下的部分(图。6摄氏度),因此很容易确定当琼脂糖柱第一次进入分割平面。 通过扩展,操作员可以很容易地确定当他们第一次到达的球体微阵列定位在琼脂糖柱子的顶端。 这种方法导致非凡的重复性当考虑小的容许误差幅度microarray-to-cutting平面对齐(无花果。4).

给出的结果证明方法的实用程序通过展示多个(5)组织学幻灯片包含超过85%的最初嵌入式球状体在一个幻灯片,包括96年一个大球体数组。 其他尝试部分少96球状体数组包含嵌入的球状体在一个幻灯片(64%),可能是因为这些球状体的高度较小的或者因为htb - 126和C2C12球面阵列分析实验是由不同的人员在不同的时间段。 即使多个部分必须染色和成像来捕获所有96个球体组成一个数组,仍有大量的时间储蓄相比,单球体嵌入/切片。 进一步,因为如此多的样品可以同时处理,一些完整的样品损失可以通过添加额外的复制。 然而,我们所做的预测过程可以进一步优化方法100%球体复苏连续几个幻灯片。 为优化设计考虑将包括pre-mold制造、琼脂糖类型、浓度和温度; 柱高度、直径和形状; 脱水和石蜡渗透过程; 切片和安装技术; 和额外的方法注意事项(详细描述补充方法S.14)。 这项技术也可以大大提高效率的方法直接从文化位置自动球体放置到合适的井的微阵列。

促进并行描述球体微阵列技术分析96从单个球状体石蜡块。 技术与工具最简单实现实验室。 平行分析将使其更可行的研究人员使用球体模型进行详细的实验,需要生物标记染色输出。 与生物标记染色,研究人员就可以进行更全面的3 d在体外球体的研究。 这些研究将需要更少的成本、时间和试剂,使其可以运行更多的细胞实验条件,治疗类型、剂量、时间点,和复制。 重要的是,免疫组织化学染色可以产生大量的生物标志物进行输出与空间定位和双染色能力。 此外,定量比较样本之间的染色强度在微阵列将更可靠,因为所有的样品处理,染色,并行成像。 这些功能和降低成本将有助于研究人员推进我们对肿瘤生物学的理解和促进先进的肿瘤反应筛选新的实验性治疗或个性化医疗方法。 球体微阵列方法将会是很有价值的应用程序包括发育生物学、药物中毒、组织工程和器官在芯片上。


文章分类: 生物摘要
分享到:
武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司电话咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297
本公司提供的试剂为实验研究试剂,仅供科研使用!不得用于临床诊断!
鄂ICP备18027482号  ©2019 武汉新启迪生物科技有限公司 版权所有