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单剂量ChAdOx1 MERS疫苗候选人在骆驼中的体液免疫原性和功效

发表时间:2019-11-11 15:25作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

单剂量ChAdOx1 MERS疫苗候选人在骆驼中的体液免疫原性和功效

摘要

MERS-CoV和血清反应阴性的血清反应阳性的骆驼收到一个肌内剂量的ChAdOx1事情一个replication-deficient adenoviral载体疫苗表达MERS-CoV蛋白质,与进一步组织接收控制接种疫苗。 自然感染MERS-CoV传染性的骆驼活跃,与接种疫苗的骆驼co-housed 1:2的比率(感染:接种疫苗); 鼻涕和病毒滴定度监控了14天。 总的来说,疫苗接种减少病毒和鼻涕(分别为p = 0.0059, p = 0.0274)。 抗体反应血清反应阳性的骆驼enhancedby疫苗; 这些骆驼有一个平均年龄高于血清反应阴性的。 年长的血清反应阴性的骆驼比年轻动物疫苗接种反应更强烈; 和中和抗体检测在鼻拭子。 进一步的工作需要优化疫苗方案对年轻血清反应阴性的骆驼。

介绍

中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)于2012年首次发现从肺患者随后死于沙特阿拉伯。 出现以来,病毒已经感染了超过2200个人在27个国家1。 疫情主要发生在阿拉伯半岛在大拥挤的医院有一个在韩国大暴发2。 虽然蝙蝠已经被提议作为一个可能的病毒的自然宿主3.单峰骆驼,骆驼是唯一确认动物宿主。 超过半数(54.9%)的主要人类病例报告与骆驼4和索引病人在朝鲜爆发旅行从海湾国家MERS-CoV流行在单峰骆驼骆驼和循环5。 骆驼的一些研究显示74 - 100% seroprevalence MERS-CoV在非洲和阿拉伯半岛6,7,8,9,10。 老骆驼的意思是seroprevalence高于青少年的9。 此外,单峰骆驼血清样本收集在1983年和2010年之间和不同国家的存档在非洲和阿拉伯MERS-CoV中和抗体阳性(小伙子)11,12,13,14,15,16。 此外,在沙特阿拉伯最近的一项研究显示,70% (n = 584)的单峰骆驼证实人类病例血清反应阳性的病毒RNA是孤立的从12%的单峰骆驼5,17。 重要的是,测序病毒RNA从病人和他们的骆驼证实遗传相似性在每个配对的情况5,17。 因此,显然,MERS-CoV一直循环在单峰骆驼在非洲和阿拉伯在过去的三十年,自2012年以来造成人类感染。 与阿拉伯国家不同,没有报告人间病例在非洲,这可能是由于全面性诊断或骆驼农业实践的差异。 最近一项研究表明,病毒在非洲可能是基因和表型不同的18

到目前为止,没有抗病毒药物或疫苗来治疗或防止人类MERS-CoV或骆驼。 在骆驼,MERS-CoV感染是温和、瞬态和不需要兽医护理。 因此小鼓励对MERS-CoV骆驼的主人给猪接种。 然而,有越来越多的证据表明在无症状和轻微症状人间病例中经常接触骆驼的人,暗示这些人可能传播感染社区4,19。 因此,成功的疫苗接种的骆驼会减少病毒的传播在这个动物宿主,从而减少人体接触,导致人间病例的数量的减少。 此外,开发一种疫苗接种疫苗对人类和人类面临风险,如骆驼饲养者和卫生保健工作者,将进一步控制人类感染的数量,防止病毒的传播。 同样的疫苗可能被开发用于骆驼和人类。

三聚物的峰值(S)糖蛋白是大多数实验MERS-CoV疫苗的主要目标,因为它在病毒中扮演不可或缺的角色进入,与靶细胞融合20.,21。 它由一个受体结合域(RBD)包含S1亚单位,结合dipeptidyl肽酶4 (DPP4)在目标细胞,和S2亚基包含融合肽参与病毒与靶细胞融合20.,21。 几个候选疫苗已经在多种动物模型包括开发和测试老鼠、兔子、非人类的灵长类动物和单峰骆驼(综述22,23,24)。 虽然许多这些疫苗设计基于完整的蛋白质,一些人针对S1亚单位或RBD的蛋白质免疫反应关注关键中和抗原表位诱导小伙子。 尽管如此,non-neutralising抗体(Abs)也可以帮助防止MERS-CoV通过抑制病毒复制基本步骤如virus-target细胞融合。 此外,它已被证明,小伙子就不能授予冲销免疫力但可能提供部分保护骆驼由于几个因素包括小伙子减弱和病毒家族的基因变化25,26,27,28,29。 因此,开发一个骆驼疫苗基于完整的蛋白质可能会引起更健壮的抗体和T细胞反应比短时间的目标。

我们已经开发出一种黑猩猩adenoviral基于矢量的疫苗MERS-CoV (ChAdOx1即在小鼠模型已被测试的免疫原性30.和有效性,证明单剂量后100%的功效31。 ChAdOx1即被插入生成完整的基因,从MERS-CoV隔离(加入基因库号:KJ650098.1)的基因组复制缺陷ChAdOx1向量如前所述30.,32。 的ChAdOx1病毒载体疫苗是replication-deficient,评估在不同的动物模型,包括单峰骆驼33,在人体临床试验34,35。 在这里,我们评估的免疫原性和有效性ChAdOx1即在单峰骆驼血清反应阳性的或MERS-CoV血清反应阴性的。 我们也评估了年龄影响疫苗免疫原性血清反应阴性的单峰骆驼小牛。 我们首次利用挑战的自然感染模型来评估即疫苗功效骆驼在“现实”环境中而不是单一曝光MERS-CoV在biocontainment挑战实验设施。 这也是第一个研究来评估即疫苗在单峰骆驼在流行国家。

结果

疫苗接种和单峰骆驼的挑战

二十小牛(10个血清反应阴性的和10个血清反应阳性的)分成四组(n = 5 /组)。 集团−C:接收控制注射血清反应阴性的骆驼PBS (n = 3)或ChAdOx1编码增强型绿色荧光蛋白(ChAdOx1-eGFP) (n = 2),集团−V:血清反应阴性的骆驼接收ChAdOx1即疫苗组+ C:接收控制注射血清反应阳性的骆驼PBS (n = 3)或ChAdOx1-eGFP (n = 2),和组+ V:血清反应阳性的骆驼接收ChAdOx1即疫苗(图。1和表1)。 收集血清样本在第0天pre-vaccination然后7点,14日,21日,28日,56岁,84年,112年,140年,168年,365天后免疫(结论)。 此外,在45的结论。 ,两头骆驼从团体或−−V C是得益于第二次注射ChAdOx1即或PBS,分别; 和样品收集在7、14、21、28天邮报提高(d.p.b)。如无花果所示。1。 三个月后'(即84的结论。),接种疫苗的骆驼是挑战在自然感染模型中通过引入十自然感染和病毒脱落骆驼,称为“传染性骆驼”1:2(传染性:实验)比为了评估疫苗效力(无花果。1)。 MERS-CoV测试在鼻拭子邮寄RT-qPCR 21天挑战(d.p.c)。然后在28日,56 d.p.c。骆驼都是在28岁,56 d.p.c为MERS-CoV感染阴性。 ,除了个人骆驼在28 d.p.c。(图S4).

图1
figure1

在单峰骆驼骆驼评价ChAdOx1即疫苗。 原理图代表ChAdOx1免疫原性和有效性的研究即候选疫苗在单峰骆驼骆驼。 +:血清反应阳性的; −:血清反应阴性的; C:对照组; V:接种组。 的结论。 :天免疫。 d.p.b。 :天提振。·和♦骆驼表明了PBS或疫苗,分别在45的结论。

表1骆驼主要疫苗研究中利用的信息。

血清反应阳性的单峰骆驼ChAdOx1即增强抗体反应

血清样本评估使用商业ELISA试剂盒(图S1)和一个自身的anti-S1端点滴定度ELISA(无花果。2)。 在血清反应阴性的骆驼(集团−V) anti-S1 Abs检测只在两头骆驼,提高接种(无花果。2)。 这些Ab水平相似的滴定度自然感染的骆驼; 然而,这些Ab滴定度下降了0.5日志白天84的结论。 时,即挑战(图。2)。 这表明产生可衡量的anti-spike Abs在天真的单峰骆驼通过接种疫苗是可能的; 然而,这些Abs下降超过三个月,疫苗推动策略应考虑天真的小腿。

图2
figure2

在单峰骆驼接种疫苗的抗体反应ChAdOx1即。 (一个)与控制注射血清反应阴性的小腿都接种(PBS或ChAdOx1 eGFP)−C组(开放酒吧),或与ChAdOx1即组−V(绿酒吧)。 两具尸体在−V组与第二个剂量的增加ChAdOx1即45的结论。数据在绿色的酒吧在84年之前d.p.i.两只提振了小牛; 和数据在84年之后的结论。(感染后挑战)从所有五个小牛。 (B)与控制注射血清反应阳性的骆驼都接种(PBS或ChAdOx1 eGFP) + C组(开放酒吧)或ChAdOx1即组+ V(红条)。 血清样本来自不同天(d.p.i.和d.p.b。)评估anti-S1 Ab端点滴定度。 传染性骆驼作为一个自然的挑战模式(从84年的结论)也评估(黑条)(一个,B)。 (C)组织的褶皱增加Ab滴定度+ C + V。 (D分析收集的样本中,小伙子从0,28和365的结论。(一个,B使用MERSpp NA)。 ns:无显著差异在抗体滴定度天0 V + C与+骆驼,克鲁斯卡尔-沃利斯检验和邓恩的多重比较检验。 +:血清反应阳性的; −:血清反应阴性的; C:对照组; V:接种组。 的结论。 :天免疫。 d.p.b。 :天提振。

相反,接种疫苗血清反应阳性的骆驼ChAdOx1即疫苗(集团+ V)增强S1-specific Ab滴定度由一个日志组+ C相比,在三个月后接种疫苗(无花果。2 b, C就是S1C),尽管两组有类似的Abs的基线水平(0的结论)。 挑战的时候,两组相比有更高水平的S1-specific Abs传染性骆驼。 血清反应阳性的骆驼的褶皱增加Ab端点滴定度图所示。2摄氏度

在暴露于传染性骆驼、Ab水平增加在所有组,除了+ V组,Abs pre-challenge的最高水平。 总的来说,所有组的Ab水平趋于稳定了九个月职位挑战365的结论。挑战后感染,无实质性差异血清反应阴性的骆驼群−V,收到一个或两个剂量的疫苗,所显示的小范围的Ab滴定度误差−V组挑战(数据在84年到365年的结论。 ,无花果。2).

水平的家伙被准型病毒中和试验检测(MERSpp NA) 0, 28和365的结论。如图所示。二维之前,只有组血清反应阳性的疫苗接种(+ C + V)在0天,小伙子,这两组之间没有显著差异。 疫苗接种没有增加这些滴定度28的结论。 然而接种组的滴定度(+ V)保持在同一水平天28和365年,与未接种骆驼显示减少nAb滴定度28和365的结论。

ChAdOx1即显著减少rhinorrhoea挑战单峰骆驼

十传染性骆驼(MERS-CoV自然感染和病毒脱落骆驼)证实被RT-qPCR MERS-CoV阳性Ct值低于30(图S2)与实验20小牛co-housed接种实验一笔从84年开始的结论。(无花果。1),导致共有30笔的骆驼30平方米。 作为一个任意的感染迹象,鼻排放从骆驼在所有组织进行评估和得分从0 - 3(从正常到严重; 解释的方法)根据放电丰富了14 d.p.c。图S3。 曲线下的区域(AUC)这些分数在图绘制。3.。 大多数骆驼血清反应阳性的接种疫苗(+ V)和控制(+ C)组轻度鼻排放解决5和7天的挑战,分别(图S3B,D); 只有三个骆驼在血清反应阳性的组织有严重的鼻涕,只持续了一到两天。 血清反应阴性的组(C和−−V)显示鼻涕,持续两周。 总的来说,疫苗和血清反应阳性的血清反应阴性的骆驼随时间减少了鼻涕明显比控制骆驼,p = 0.0274所分析的混合模型分析。 组中的−V,疫苗对减少鼻排放效果不是明显不同启动—提高接种骆驼(骆驼数量:−V-01和−V-05)和擎天柱只能接种骆驼(图S3C)。 曲线下的面积(AUC)鼻涕分数也绘制显示整体减少这些分数在接种疫苗的骆驼比控制骆驼,骆驼血清反应阳性的接种总体上都有明显的减少鼻涕,p= 0.01(图。3 b).

图3
figure3

严重程度和大量的鼻涕后自然感染的挑战。 二十骆驼在所有组(C−−V + C + V)与十挑战自然感染骆驼; 和鼻放电14 d.p.c丰度和严重程度进行了评估。 使用任意单位0 (N:正常),0.25 (R:恢复),1(+:轻微),2(+ +:温和),或3(+ + +:严重)。 (一个从不同的骆驼)代表照片在不同天。 (B)曲线下的区域(AUC)的鼻涕分数收集每日从1到14 d.p.c.绘制。 混合模型的分析的AUC鼻涕(d.p.c分数和固定因素。 血清阳性,疫苗和疫苗)显示,整体效果随着时间的推移显著,p = 0.0274。 也+ V统计上显著的低分数+ C相比,通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验和邓恩的多重比较检验。 的结论。 :天免疫。 +:血清反应阳性的; −:血清反应阴性的; (C)对照组; V:接种组。

ChAdOx1即有效最小化在接种病毒传染单峰骆驼

鼻拭子从所有骆驼收集每日的引入后21天传染性骆驼(挑战),然后在28岁,56个职位挑战。 有趣的是,感染和病毒的总数减少骆驼在笔增加挑战研究和不同周后挑战(图S4A)。 所有5血清反应阴性的控制(−C)骆驼以及一些骆驼来自其他集团很早就被感染和病毒脱落骆驼的数量达到顶峰到23骆驼邮寄第二天挑战,导致一个非常高的病毒暴露未感染的骆驼。 感染的骆驼的数量仍然> 18在第一周和第二周开始下降后挑战(图S4A).

病毒传染被测试评估MERS-CoV RNA病毒滴定度和评估在所有职位挑战鼻拭子使用RT-qPCR(无花果。4S4)。 在所有组,病毒RNA到检测不到的水平降低了(图14个职位挑战S4G)。 血清反应阴性的接种和控制骆驼(V和−−C)摆脱高水平的病毒从第二天开始到9 post-challenge。 相反,血清反应阳性的骆驼(+ C + V)摆脱低水平的病毒后挑战(图。4)。 值得注意的是,接种疫苗和血清反应阴性的血清反应阳性的骆驼(−V + V) ~ 2 log10更高的病毒滴定度(TCID50情商/毫升)在第二天发布挑战比控制血清反应阴性的血清反应阳性的骆驼(−C + C)。 然而,在接种病毒滴定度骆驼(−V + V组)迅速下降随着时间的推移而控制骆驼(−C + C)(无花果。4)。 传染性病毒RNA的骆驼有很高的滴定度从挑战的日子(第0天、测量之前住房研究骆驼)和随着时间的推移下降(数据S2AS4F).

图4
figure4

的功效ChAdOx1即在基于通用电气TCID单峰骆驼50/毫升。 鼻拭子样本从1到14天邮报挑战(d.p.c)绝对RT-qPCR量化评估和MERS-CoV病毒基因组TCID等效(GE)50报告/毫升。 (一个)的平均滴定度MERS-CoV通用电气(TCID50/毫升)报告从1到14天邮报挑战(d.p.c)和SEM对每组误差。 (B)曲线下的区域(AUC)意味着MERS-CoV通用电气(TCID50从1到14 d.p.c. /毫升)滴定度测量是每组的策划。 +:血清反应阳性的; −:血清反应阴性的; (C)对照组; V:接种组。 分析混合模型对数转换MERS-CoV通用电气(TCID50(d.p.c /毫升)滴定度和固定因素。 血清阳性,显示这种疫苗和疫苗)与p = 0.0059显著。

之间没有显著差异在病毒传染血清反应阴性的骆驼接收一个或两个剂量的ChAdOx1即(所看到的小范围数据的误差−V组,无花果。4)尽管骆驼接收启动—提高免疫水平显著anti-S1 Abs,这是针对促进病毒的主要抗原条目。 疫苗干预随着时间的推移(分析影响病毒的疫苗滴定度在所有天从1到14)是具有统计学意义,p = 0.0059,在所有接种骆驼(−V + V组),分析了混合模型分析和较低的病毒传染所示接种骆驼控制相比,尤其是血清反应阳性的骆驼(图。4)。 曲线下的区域(AUC)每组的平均病毒滴定度(图也报道了。4 b).

单剂ChAdOx1即诱发免疫反应在旧血清反应阴性的单峰骆驼小牛

在一个单独的试图评估年龄对疫苗免疫原性的影响在单峰骆驼小腿,九个血清反应阴性的小腿被接种疫苗(n = 3 /组)在另一项研究。 组AG01作为对照组与小腿以下一年接收PBS (n = 2)或ChAdOx1-eGFP (n = 1),集团与小牛AG02未满一年接受单剂量ChAdOx1事情和组AG03与小牛一至两岁接受单剂量ChAdOx1即。 在第0天pre-vaccination收集血清样本,7日,14日,21日,28日,56和84的结论。 、鼻拭子也收集在0和21的结论。没有感应探测anti-S1 Abs在年轻的小腿AG02集团除了一个骆驼很低水平的腹肌,而Abs检测在老小牛AG03组(无花果。5S5)。 同样,循环和地方nAb只有诱导在老响棒组AG03但不是那些组AG02(无花果。5中)。 有趣的是,准型病毒中和试验(MERSpp NA)显著相关的MERS-CoV中和试验,R2= 0.96,p< 0.0001。 (无花果。5 d),应用于相同的血清。

图5
figure5

抗体免疫反应ChAdOx1即在单峰骆驼小牛在不同的年龄。 血清反应阴性的单峰骆驼小腿,1岁以下,接种与PBS (n = 2)或ChAdOx1-eGFP AG01组(n = 1)(黑色三角形)或ChAdOx1即AG02组(n = 3; 蓝色方块)。 年长的小腿,1 - 2岁,接种了ChAdOx1即AG03组(n = 3; 红圈)。 (一个在ELISA) Anti-spike Ab滴定度进行评估; 和nAb滴定度确定MERS-CoV中和试验(B),即准型病毒中和试验(MERSpp NA) (C)。 (D)的值之间的线性回归MERS-CoV中和试验和MERSpp NA与R显示显著的关系2= 0.96,p < 0.0001。 (一个)鼻粘膜小伙子测定从0和21 d.p.c MERSpp NA样本中。

Subsequent to vaccination and initial sampling, all calves in the age group study were kept for serological follow up in their pen, which is a separate pen, 200 m away from the pen of the main study, in which we performed the natural challenge. Unexpectedly, all calves in the age group study (including the control calves) demonstrated immune responses as assessed by two ELISAs (Figure S5A,B) at 140, 168, and 196 d.p.i., which overlapped in time with the natural infection challenge of the main study. Whilst these calves were not tested for MERS-CoV RNA, this finding indicates that these calves were infected when the challenge study took place in the pen 200 m away. We strongly exclude the possibility of mechanical transfer of the virus due to the strict adherence of all staff to infection control measures, monitored by surveillance cameras, virus transmission and circulation to these calves through air could be possible. Of note, the two ELISAs were significantly correlated (Figure S5C).

Discussion

In this study, we demonstrated that boosting humoral immune responses in MERS-CoV seropositive camels requires a single intramuscular dose of ChAdOx1 MERS, whereas at least two doses of vaccine were required to induce Abs in young seronegative camels (<1 year). Interestingly, older seronegative calves (1–2 years) responded to a single dose of the vaccine and elicited systemic and local nAbs. As the history of MERS-CoV exposure in these camels is not known, it is possible that older camels found here to be seronegative may have had some natural exposure to MERS-CoV but their Abs had then declined prior to their inclusion in the study as reported previously25,27. Nonetheless, it is also possible that these seronegative calves were truly immune naive to MERS-CoV and that greater vaccine responsiveness occurs in older animals with a more mature immune system. It is very unlikely that maternal Abs play any part in the lack of vaccine responsiveness in younger calves because ChAdOx1 MERS is a viral vectored vaccine that does not express MERS S protein on the virion surface and so will not be affected by pre-existing Abs at the time of vaccination.

Vaccination resulted in a statistically significant reduction in virus shedding after co-housing with infectious camels in both seropositive and seronegative camels. Whereas virus shedding was minimal from seropositive vaccinated camels, further optimisation is required to enhance protection in seronegative camels including the number of doses and route of immunisation. Indeed, assessing the ability of an MVA-vectored MERS-CoV vaccine to protect camels against contained MERS-CoV challenge required administering multiple doses by both intramuscular and intranasal routes to significantly reduce virus shedding36. Therefore, protective effects of vaccine administered by either the intranasal or intramuscular route should be assessed. Of note, we show here that in older seronegative camels, nAbs in nasal secretions were induced after a single intramuscular vaccination of ChAdOx1 MERS, but cannot rule out the possibility that these camels had previously been exposed to MERS-CoV despite proving seronegative on entry to the study, and the effects of intramuscular boosting after initial mucosal priming may be different from intramuscular priming of truly MERS-naive camels. The mechanism of vaccine-mediated or naturally acquired protection against MERS-CoV in camels is not yet known and further work will be required to study T cell responses as well as the possible contribution of immunity to antigens other than the S protein. However, there is lack of commercially available dromedary antibodies against immune cell markers, making T cell immunity in camels difficult to assess appropriately.

The ‘natural challenge’ model employed here replicates closely the conditions found in camel herds, and results in high levels of virus exposure over many days. Infectious camels were not removed from the pen after co-housing to mimic natural conditions. Even under these stringent conditions one camel in group +V demonstrated complete absence of virus shedding, with two others (out of a total of 5) in the same group shedding extremely low levels of virus, indicating that high levels of protective immunity can be achieved. Importantly, this group had high level of nAbs that plateaued for a year, unlike the +C group that had decreasing nAb titres overtime. These results suggest that vaccinating seropositive camels with S-based vaccine could boost their pre-existing MERS-specific immunity and minimise viral shedding. Nonetheless, following single dose vaccination, virus shedding was reduced in both seropositive and seronegative camels, which would reduce the likelihood of transmission to other camels or humans.

Previous work as well as ours have shown excellent correlation between pseudotyped and live virus neutralization assays37. Thus, it is expected that most nAbs detected by MERSpp neutralization assay bind to RBD or close to the binding site in a manner that blocks binding to the DPP4 cellular receptor, although the binding sites of nAbs detected in the pseudotyped virus neutralization assay have not been determined per se。 尽管如此,non-neutralising S-specific Abs也可能干扰MERS-CoV入口和融合以类似方式stem-specific抗流感血凝素Abs38,但这对于MERS-CoV尚未评估。 同样,S1-based ELISA显示良好的相关性与活病毒中和试验虽然两家伙以及non-neutralising绑定Abs可以通过ELISA检测39,40。 在当前的研究中,我们发现诱导S1-binding non-neutralising Abs本身是不足以减少病毒传染,只有家伙的存在可以减少病毒排泄。 然而,以往的研究表明,只有高水平的nAb滴定度甚至可能在单峰骆驼提供冲销免疫血清反应阳性的骆驼可以重新感染的家伙减弱25,26,27,28。 显然我们的研究也证实,MERS-CoV再次感染发生在单峰骆驼。

值得注意的是,感染后鼻涕只是观察到在实验设置,而不是在市场上的传染性骆驼被购买,所以可能不是用作感染的可靠指标,也由以前的研究的支持36,41。 病毒持续了14天,这表明平均时间即感染过程中pen-housed骆驼。 值得注意的是,尽管年轻小牛血清反应阴性的回应与高水平的Abs启动—提高后,正如上面提到的,他们没有表现出明显的不同在鼻涕还是在病毒滴定度,而擎天柱只能血清反应阴性的年轻的小牛(−组V)。 这表明,诱导保护性免疫原性血清反应阴性的小牛需要严格的和最佳的接种方案。

Long-range airborne transmission of virus (to camels housed separately and managed under strict infection control measures) was also demonstrated, as was the case in the Korean hospital outbreak42. Accordingly, prevention of transmission between camels whenever large groups of animals are present, such as a market, large herd, or festival, cannot be prevented by hygiene measures only; and vaccination of camels should be introduced to minimise transmission between camels, and to humans. This study also presents a significant correlation between in-house ELISA and commercially available ELISA kits although low level of antibodies in some samples were detected only by in-house ELISA, previous reports showed that commercial ELISA kits may have low sensitivity40.

Methods

Pens, camels, personnel, and infection control

A camel research farm was set up 100 km from Riyadh city, remote from urban areas, with double fences and a secured gate. Inside this farm, three metal pens were set up with 30 m2 in size. Each pen is 150 cm height and has an infection control entry and exit points 10 m away from each other and from the pen. Two surveillance cameras were installed for each pen. Food and water troughs were placed inside each pen, where they can be filled from outside without entering the pens, supplementary file shows the farm layout. Nineteen seronegative camel calves (negative by ELISA), were sourced and purchased from Jouf province, north of Saudi Arabia, and transported for more than a 1000 km, using disinfected lorries, to the research farm. Additional ten seropositive and MERS-CoV RT-PCR negative camel calves were purchased from a camel market in Riyadh. Ten seronegative and seropositive calves were used in the main study whereas the remaining nine seronegative calves were used in a small follow up study to determine the age effect. Additional ten actively MERS-CoV shedding/infected camels (positive by RT-PCR; Ct value below 30) were purchased from local markets and co-housed with the experimental calves in one pen to serve as a natural infection model of challenge. Overall, a separate pen was used for each of the two studies and the third pen was only briefly used to gather infectious viral shedding camels one day before the challenge. All camels were labelled with paint as well as digital microchips; these two labels were used for the samples to ensure accuracy.

Pen keepers, veterinarians, and drivers were trained for infection control practices including fit-test for N95 masks. Each worker used their own specific N95 mask, overall white gown, goggles, head cover, shoe cover, all of which disposable and used once only. The team adhered to utilising the entry and exit point of each pen to ensure infection control; each pen, donning, and doffing area has biohazard waste container, sharp biohazard containers, 70% Ethanol spray and virucidal ANIOSpray (Laboratoires Anios, France) used by the workers. All staff involved in the study were also screened and confirmed MERS-CoV negative by ELISA and PCR prior to, during, and at the end of the study. Biowaste was collected daily and sent for incineration by the Saudi Gulf Environmental Protection Company (SEPCO). Clean sand from a nearby dunes area was used as pen floors, and new sand were added every 3 months. Pesticide was sprayed over the pen floors before starting the study or when new sand is added. The research farm and pens were monitored by surveillance camera to ensure strict adherence to infection control measures and to ensure camels are not exposed to any stray animals (e.g. fox, dogs). Some photographs of this study are included in the supplementary file.

Vaccine, vaccination and sample collection

The ChAdOx1 MERS vaccine candidate and ChAdOx1-eGFP vector control were produced by the Jenner Institute at the University of Oxford, UK as previously described30. The vaccine and the vector control were transferred in a cold-chain delivery to KAIMRC, Riyadh, Saudi Arabia. They were thawed on ice once for dose preparation and a second time for a few minutes just before injections. Single doses of 1 × 109 Infectious Unit (IU) of either the vaccine or the vector control in 1 ml PBS per camel were given intramuscularly into the thigh muscle. In the camel control groups of our studies (groups −C, +C, and AG01), camels were either immunised with ChAdOx1-eGFP (vector control) or PBS (placebo control). Blood samples were collected at different d.p.i. and transferred to the lab in portable refrigerators. For serum, 10 ml blood from each camel was collected at each time point. Blood was left to clot for 1 hr at 4 °C then spun at 15,000 rpm for 5 min and serum was collected, aliquoted and stored at −80 °C until testing. Nasal swabs from camels were collected in virus transport media (VTM) and stored at −80 °C until testing.

ELISA

Serum samples were screened by ELISA using camel MERS-CoV EUROIMMUN ELISA kit (EUROIMMUN, Germany) according to the manufacturer’s instructions. Readouts were reported as the ratio of sample optometric density (OD) over the OD of an internal calibrator. Ratios of ≥1.1 and 0.8–1.1 were assigned as positive and borderline, respectively. Positive and negative controls provided with the kit were always included in each run. Endpoint titres of serum Abs were also determined using an in-house indirect ELISA as previously described43,44。 短暂,96 - Nunc ELISA板(热科学、美国)涂上50μl / 1μg /毫升的重组S1蛋白(新,首尔,韩国)一夜之间,被清洗和阻塞1 h。 50μl /从每个血清样本添加重复的三倍连续稀释从1:10 0开始。 1 h孵化后,碱性phosphatase-conjugated兔子anti-llama免疫球蛋白(美国Agrisera)被添加在1:3000稀释。 最后,对硝基苯磷酸盐基质(pNPP)(西格玛奥德里奇,德国)是用于显色和OD以405海里。 端点滴定度确定了每个测试血清血清稀释的倒数值与OD值收敛截止确定的平均OD血清反应阴性的骆驼血清+ 3 SD如前所述。 褶皱增加Ab滴定度计算除以滴定度从每个时间点的滴定度相同的骆驼在0天,pre-vaccination滴定度(0的结论)。

即准型病毒颗粒(MERSpp)中和试验

即准型病毒颗粒(MERSpp)生产和滴定用Huh7.5细胞如前所述45。 Heat-inactivated骆驼血清样本和鼻拭子VTM准备在三倍连续稀释法从1:20,和测试复制如前所述的家伙45。 标准浓度MERSpp(相当于200000 RLU)和Huh7.5细胞细胞(10000)被添加到每个。 细胞,细胞与MERSpp只包括一式四份(无血清)控制中和活动确定100%和0%,分别。 48小时孵化后,细胞细胞溶解和试验开发使用Bright-Glo™荧光素酶检测系统(美国Promega)和荧光素酶活性测定用光度计。 集成电路50中和滴定度(Log10)计算每个血清样本使用GraphPad棱镜。 独立实验进行了两次。 的背景信号值在血清非特异性neutralisiation血清反应阴性的骆驼,pre-vaccination(样本组- C在0的结论),从所有的值减去所有样品(集团- V + C + V以及- C)。

病毒中和试验(VNA)

执行病毒中和试验(如前所述)和病毒诱导的家伙被确认根据以前公布的协议30.,46。 短暂,heat-inactivated骆驼血清样本检测他们的能力抵消MERS-CoV (EMC / 2012隔离)感染在体外与nAb滴定度确定的倒数的最高稀释完全保护Huh-7细胞在所有测试井(MNOne hundred.).

鼻涕得分

作为一个任意的措施来评估骆驼即感染,鼻排放从骆驼在所有组每天观测,给出了放电数量和严重程度得分; 得分为0(正常和健康的骆驼),0.25(如果骆驼从鼻涕中恢复过来,但却保持干燥放电),1(轻度鼻分泌物),2(温和的鼻腔分泌物),3(严重的鼻分泌)。 两个老兵被分配到文档的分数,也利用骆驼鼻照片在前三天的挑战。

为病毒RNA RT-qPCR

从鼻拭子中提取病毒RNA使用麦格纳纯96 DNA和病毒NA体积小工具(美国罗氏诊断)。 提取RNA样本测试使用rt - pcr一步针对MERS-CoV和ORF1a基因如前所述47在480年LightCycler二世(美国罗氏诊断)。 样品被认为是积极的只有两个和ORF1a扩增子检测Ct值≤37。 UpE基因被报道的Ct值。

由RT-qPCR病毒滴定

基因组的等效(GE)组织培养的滴定度50%感染剂量每毫升(MERS-CoV通用电气(TCID50胡/毫升),MERS-CoV / /塔伊夫/ SA / 2015维罗细胞分离培养和滴定; 和1.5×107TCID50/ ml被用来提取病毒RNA。 病毒RNA在1:10稀释系数连续稀释那么每个稀释被用来合成互补。 骆驼鼻拭子在VTM也用于提取总RNA和合成的互补。 互补脱氧核糖核酸样本用于ORF1a引物和探针(先前描述48),设定一个标准曲线使用TaqMan掌握混合和ABi 7500快速实时PCR系统(美国应用生物系统公司)。 这个试验确定的截止之前的最后一个稀释高原的基础上培养的病毒RNA的标准曲线。 健康的人类和健康的骆驼-鼻拭子样本被用来确认这个截止如图开通

统计分析

统计分析进行分析病毒滴定度的变化,以及鼻腔分泌物感染后的成绩随着时间的挑战。 首先,重复测量设计的混合模型的对数转换MERS-CoV通用电气(TCID50/毫升)值来考虑协方差之间重复措施和评估病毒滴定度随时间的变化。 病毒滴定度在所有动物(科目)测量每日(等距的时间点),重复措施之间的受试协会为模板通过假设一个一阶自回归相关结构矩阵。 相同的分析模型也被应用于收集的鼻涕分数随时间(从1到14天邮报挑战)。 接下来,曲线下的区域(AUC)的对数转换MERS-CoV通用电气(TCID50/毫升)值和鼻涕分数从1到14 d.p.c.收集两个实验组,每组(接种疫苗和控制)血清阳性地位的两个条件(血清反应阳性的和血清反应阴性的)。 进行这种分析显示是否有病毒滴定度差异鼻涕团体之间的分数; 它还包括科恩的f2测试,这是一个标准化的衡量效果,确保我们的研究样本大小是否适合我们进行的统计测试,看到补充统计文件。 进行了统计检验和分析使用SAS 9.4 (SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)和GraphPad棱镜软件。

伦理批准

研究机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)阿卜杜拉国王国际医学研究中心(KAIMRC)在沙特国民警卫队-卫生部事务(MNG-HA)。 动物研究是沙特的监督下进行环境、水、和农业(MEWA),按照规定的法律伦理的研究生物,设置和监控由沙特国家生物伦理学委员会。


文章分类: 生物摘要
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