EZH2的CDK2介导的位点特异性磷酸化驱动并维持三阴性乳腺癌
三阴乳腺癌(TNBC)缺乏雌激素受体α(ERα)、孕激素受体,和人类表皮生长因子受体2 (HER2)表达式,官腔乳腺癌密切相关。 以前,我们和其他报告,细胞周期素E /细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)磷酸化增强剂zeste同族体2 (EZH2) T416 (pT416-EZH2)。 在这里,我们表明,转基因的表达phospho-mimicking EZH2变异EZH2T416D在乳腺肿瘤导致TNBC表型。 Coexpression EZH2的T416DHER2 / Neu转基因老鼠在乳腺上皮细胞重组HER2-driven官腔肿瘤腔内肿瘤。 药物抑制CDK2或EZH2允许ERα表达和转换TNBC腔的ERα-positive,呈现TNBC细胞通道,它莫西芬。 此外,CDK2或EZH2的组合抑制剂与三苯氧胺有效抑制肿瘤的生长,显著提高小鼠的生存轴承TNBC肿瘤,这表明系统联合治疗可能是一个治疗TNBC的替代方法。
三阴乳腺癌(TNBC)是高度异构和侵略性的疾病,可分为六个亚型1。 其中,官腔乳腺癌(BLBC)亚型代表TNBC的多数。 基因表达分析表明,70 - 80%的TNBC属于BLBC,一个高度侵略性的亚型,最初对化疗,但最终产生耐药性,转移,术后发生2。 使用术语TNBC或BLBC取决于上下文。 因为TNBC可怜的结果和一个10.2个月的中位总存活数与当前疗法3.,发展更好的策略来改善临床结果对TNBC患者未满足的需求是至关重要的。
EZH2在多种实体肿瘤中,特别是在TNBC4,5,6,7。 癌症基因组图谱的分析(TCGA) RNAseq数据集8揭示EZH2基因超表达基底/ TNBC的94.5%和81.9%的Her2-enriched亚型(表1)。 编码细胞周期素E基因的过度表达,CCNE1,CCNE2也发生在高百分比为96.7%和89.0%,分别在官腔亚型(表2)。 此外,92.3%和85.7%的BLBC co-overexpressed EZH2和细胞周期蛋白E1或细胞周期蛋白E2,分别(表3.)。 我们和其他人之前报道,EZH2的磷酸化是细胞周期调节器CDK2 T4167,9,10。 在绑定到细胞周期素E CDK2就被激活了11。 细胞周期素E和EZH2密切中的TNBC患者(表3.),和高水平的细胞周期素E BRCA1-related BLBCs与不良预后相关11。 免疫组织化学染色(包含IHC)的肿瘤标本显示,> 80% TNBC样品展览pT416-EZH2水平高,这与贫穷的生存7。 有趣的是,目标表达野生型EZH2 (EZH2WT)单独导致乳腺增生不发展肿瘤动物实验12,13,而转基因老鼠窝藏乳腺gland-specific表达持续活跃CDK2开发乳腺肿瘤包含官腔组件14。 这些发现提出一个有趣的可能性,过度的EZH2并不足以推动乳腺肿瘤发生和持续激活细胞周期素E / CDK2-dependent EZH2的磷酸化可能是肿瘤发展的先决条件。 我们假设CDK2-mediated位点的磷酸化EZH2驱动肿瘤发生和导致TNBC表型,并抑制CDK2 / EZH2轴由特定抑制剂可能扭转表型,从而呈现TNBC通道目前乳腺癌治疗。 CDK2 / EZH2轴封锁与特定抑制剂在临床试验中可能对TNBC提供新的治疗方法。 目前,两个有效和选择性小分子抑制剂的EZH2, GSK343,和加工区- 6438,在I和II期临床试验评估15与报告,后者显示出可喜的成果16。 出口加工区- 6438有选择性地抑制细胞内赖氨酸27组蛋白H3 (H3K27)甲基化的EZH2野生型和突变体淋巴瘤细胞15。 GSK343 EZH2的高选择性超过其他甲基转移酶17。 CDK2抑制剂dinaciclib目前在三期试验和选择性地抑制CDKs,包括CDK1 CDK2、CDK5 CDK9,不同的IC5018。 在白血病和几种类型的实体肿瘤,dinaciclib展品抗肿瘤活性作为一个单一的代理和患者的安全性19,20.。 因此,实际的测试我们的系统策略与这些现成的抑制剂在临床前小鼠模型。 在这里,我们表明,药物抑制CDK2 / EZH2轴CDK2和EZH2抑制剂复活ERα表达式,呈现TNBC敏感它莫西芬体外和体内。
在乳腺检查是否表达CDK2-activated EZH2导致官腔乳腺肿瘤发展,我们建立了一个转基因小鼠模型表达phospho-mimicking EZH2T416D突变体(Tg-EZH2T416D)或野生型EZH2 (Tg-EZH2WT)由鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子。 转基因小鼠的基因由两对引物PCR(补充图。1)。 评估是否转基因表达和功能,乳腺上皮细胞分离后代F1的转基因小鼠和同窝出生仔畜。 免疫印迹显示EZH2转基因乳腺上皮细胞的蛋白质含量高于同窝出生仔畜; 一致,更高水平的H3K27 trimethylation (H3K27Me3)催化EZH2的产物,观察,表明EZH2表示T416D(补充图很活跃。1 b)。 组织学和乳腺整体分析显示,未生育过的女性转基因老鼠在年轻的年龄(< 12个月)显示增生(补充图。1 c, d),同样观察到Tg-EZH2WT老鼠在早先的研究中12。 然而,不同于Tg-EZH2WT雌性老鼠,没有出现肿瘤,Tg-EZH2T416D转基因小鼠发达乳腺肿瘤长延迟(> 1年; 无花果。1)。 乳腺肿瘤发生率为46%(20/43)的女性。 此外,乳腺肿瘤肺转移的发生率高(65%,13/20)。 使用这两种官腔(CK14)和鲁米那(CK18)标记,我们检查了肿瘤组织Tg-EZH2T416D老鼠由包含IHC和观察CK14-positive CK18-negative染色(图1 b(左),类似于p53−/ +乳腺癌易感基因1;−−/肿瘤,官腔肿瘤(图的代表。1 b,对吧)。 正如所料,腔内肿瘤组织Tg-HER2/Neu(Tg-Neu由MMTV发起人)小鼠显示典型的阳性染色为CK14 CK18和消极(无花果。1 b中心)。 这些结果表明,EZH2的磷酸化在T416 CDK2足以推动乳腺肿瘤发生与高频官腔肿瘤肺转移,表明EZH2T416D转基因小鼠与既定的活动分享一些表型CDK2转基因老鼠14。
EZH2的表达T416D突变体在乳腺肿瘤发展官腔。一个照片的主要代表和肺转移性肿瘤(左面板)和图像)肿瘤组织的染色。b,c代表性的图片包含IHC染色的主要肿瘤的肿瘤GEMMs的不同基因型。 抗体CK18和CK14腔的官腔谱系标记,用于染色,肿瘤的幻灯片Tg-Neu, p53f /−;Braca1/ f,LGB-Cre和Tg-C3老鼠用于腔的官腔积极控制,分别。dkaplan meier整体的生存曲线Tg-EZH2WT,Tg-Neu,Tg-EZH2T416D,双转基因Tg-EZH2WT神经膜;和Tg-EZH2T416D神经膜;老鼠。 *不显著; * * *p< 0.001; * * * *p< 0.0001,Long-rank测试。e,fEZH2的表达T416D突变体在乳腺上皮细胞会使腔的但上调官腔标记蛋白质的主要肿瘤。 GATA3和ERα原发肿瘤细胞培养e和钙粘蛋白(E-Cad)、EpCAM SMAαf不同基因型的全细胞溶解产物的GEMMs和表示特定的抗体免疫印迹;g,h条件删除一个等位基因在乳腺EZH2部分逆转官腔表型的肿瘤组织。g代表图像谱系标记包含IHC染色的主要肿瘤组织部分乳腺肿瘤组织的p53+ / f乳腺癌易感基因1;/ f; LGB-Cre无民事行为能力人或者一个等位基因EZH2的损耗;h全细胞溶解产物于原发性肿瘤的基因型p53+ /−乳腺癌易感基因1;——/−; 和p53+ /−;EZH2+ /−与特定的抗体免疫印迹。 规模的酒吧,20μm。 源数据作为源数据文件提供
因为肿瘤发展并没有观察到Tg-EZH2WT老鼠12,我们穿过Tg - EZH2T416D或Tg-EZH2WT老鼠Tg-Neu老鼠,发展与腔的乳腺肿瘤特性(GATA3-positive、CK18-positive和CK14-negative),确定磷酸化的EZH2 T416 CDK2的主导作用在肿瘤的官腔血统的承诺。 引人注目的是,双转基因(Tg-Neu; EZH2T416D)乳腺肿瘤组织仍然CK14-positive, CK18-negative(无花果。1 c的表型,第三板),类似于官腔乳腺肿瘤组织Tg-C3T21控制老鼠(无花果。1 c底部面板)。 肿瘤从Tg-Neu和Tg-Neu; EZH2WT老鼠luminal-like CK18-positve和CK14-negative染色(图所示。1 c上和第二面板)。 我们进一步研究了九个肿瘤不同Tg-Neu; EZH2T416D老鼠通过包含IHC染色结果表明78%的肿瘤是强烈CK14积极和CK18负的,只有22%是CK18积极(其中一个肿瘤显示bi-lineage: CK18 / CK14双阳性)。 在一起,> 88%的肿瘤Tg-Neu; EZH2T416D老鼠CK14积极。 这些发现表明EZH2的表情T416D但不是EZH2WT促进改变家族的命运由HER2 / Neu腔的-在乳腺肿瘤发生官腔。 此外,相比之下,Tg-Neu; EZH2WT和Tg-Neu老鼠,Tg-Neu; EZH2T416D老鼠开发多个乳腺肿瘤发生的延迟和生存(图要短得多。1 d紫色的线),尽管转基因表达水平是相似的(补充图。1 e).
腔的标记,GATA3功能角色在成人乳腺luminal-fate规范22,23。 乳腺肿瘤的免疫印迹的主要文化溶菌产物Tg-Neu鼠标显示GATA3(图的高表达。1 e巷1)。值得注意的是,相比之下Tg-EZH2T416D和其他控制肿瘤的主要文化,非常低的ERα蛋白质溶解产物的检测Tg-Neu肿瘤主要文化在长时间曝光时,这可能是由于肿瘤细胞的主要文化。 然而,像官腔肿瘤Tg-C3T和p53+ /−乳腺癌易感基因1;−−/老鼠,GATA3和ERα几乎没有检测到肿瘤的主要文化中Tg-EZH2T416D和Tg-Neu; EZH2T416D老鼠即使长时间曝光(图。1 e通道2 - 3)。 钙粘蛋白和EpCAM高度分化的细胞腔的表达但低官腔类型的肿瘤24,也显著降低肿瘤组织Tg-EZH2T416D与相比老鼠Tg-Neu老鼠(图。1 f)。 相比之下,官腔SMA-α标记的肿瘤Tg-EZH2T416D老鼠与相比明显增加Tg-Neu老鼠(图。1 f)。 这些结果表明腔的标记Tg-EZH2T416D派生的乳腺肿瘤细胞明显表达下调和官腔标记与此同时增加,表明EZH2T416D有一个主要角色在推动官腔乳腺肿瘤。
上述研究结果提出了有趣的问题是否消耗减少EZH2的官腔表型逆转乳腺肿瘤。 为了解决这个问题,我们穿过EZH2/ f条件性基因敲除小鼠与Trp53f / +乳腺癌易感基因1;/ f;LGB-Cre鼠标25生成p53+ /−乳腺癌易感基因1;−−/;EZH2+ /−鼠标线。 相比p53+ /−乳腺癌易感基因1;−−/老鼠的肿瘤显示官腔特点,肿瘤的p53+ /−乳腺癌易感基因1;−−/;EZH2+ /−老鼠表现出CK14-positive和CK18-positive bi-lineage特征(图。1克,对面板)。 此外,ERα蛋白质水平的肿瘤细胞p53+ /−乳腺癌易感基因1;−−/;EZH2+ /−老鼠显著增加与减少EZH2蛋白(无花果。1 h与相比,莱茵2)p53+ /−乳腺癌易感基因1;−−/老鼠。 这些结果表明,删除一个EZH2等位基因,这部分减少EZH2表达水平的官腔乳腺肿瘤,可以诱导ERα表达和开关家族承诺的肿瘤细胞。
是否激活EZH2的表情T416D能够逆转乳腺癌的腔的表型细胞在体外和体内,我们稳定表达EZH2WT,EZH2T416D,或者phosphorylation-deficient EZH2T416A突变体的腔的乳腺癌细胞系T47D。 EZH2的异位表达T416D但不是EZH2WT或EZH2T416A极大地增加H3K27Me3,降低ERα蛋白质含量(补充图。2)。 腔的乳腺癌细胞系T47D, CDK2 /细胞周期素E比TNBC低non-TNBCs肿瘤7(表3.)。 这些结果表明,在腔的乳腺癌细胞,CDK2活动较低,因此,EZH2的磷酸化水平WT在T416也低,导致大量的H3K27Me3少。 在这样的条件下,突变的刺416到阿拉巴马州可能不会明显改变全球H3K27me3水平。 相比之下,EZH2T416D突变模仿T416磷酸化,表现出最高的EZH2活动和H3K27me3水平。 重要的是,T47D表达EZH2异种移植T416D但不是EZH2WT或EZH2T416A促进肿瘤形成独立于外源性雌激素管理局(补充图。2 b)。 观察到的表型符合他们EZH2甲基转移酶活性,表明只有EZH2T416D突变但不是WT或T416A突变导致肿瘤发生。 接下来,我们问及肿瘤组织来自T47D-EZH2T416D官腔表型的稳定细胞系留住。 T47D-vector控制细胞相比,EZH2T416D表达的肿瘤异种移植小鼠模型,连同EZH2T416D稳定表达细胞系和EZH2T416Dtumor-derived细胞系(p6和p8)显示官腔表型的减少ERα,CK18和GATA3增加CK14(补充图。2摄氏度)。 这些数据表明,持续激活EZH2能够维持TNBC的表型在体外和体内。 接下来,我们使用一个Matrigel-based 3 d文化系统,它可以提供更好的微环境的功能分析,为进一步研究肿瘤细胞是否表达EZH2T416D接受basal-to-luminal表型变化当EZH2活动受阻。 事实上,治疗的肿瘤细胞与EZH2特定抑制剂加工区- 6438水平更重要的是增加了腔的标记ERαGATA3,比2 d和3 d CK18文化文化(补充图。二维)。 这些发现表明,持续激活EZH2的促进肿瘤发生和维护需要官腔表型表达的癌细胞和既定的活动EZH2 (EZH2T416D)不仅促进肿瘤发生重组承诺腔的乳腺癌细胞进入官腔亚型。
上述结果提示我们是否抑制EZH2或者CDK2可以扭转TNBC表型,de-repress ERα基因表达,从而使肿瘤细胞对激素治疗敏感,如三苯氧胺。 为了测试这个潜在的重要的临床问题,我们首先研究EZH2抑制剂的影响归纳ERαTNBC的小鼠模型。 在一个同源的官腔4 t1小鼠模型,GSK343治疗显著地抑制4 t1肿瘤生长(图。2)。 有趣的是,与体外实验结果一致(补充图。二维),GATA3表达式的表达,增加ERα4 t1 GSK343治疗后肿瘤组织(图9天。2 b)。 接下来,我们被问及这种表型可以复制人类TNBC细胞系。 mda - mb - 231细胞TNBC对待EZH2i(出口加工区- 6438)诱导ERα剂量依赖性的方式表达(无花果。2摄氏度)。 类似的结果也观察到在不同TNBC细胞系对待GSK343(补充图。3 a, b)。 在一起,显著抑制EZH2的活动依靠ERαTNBC细胞株表达不同。 作为我们的观察体外和体内清楚地表明,CDK2-mediated磷酸化的EZH2 T416是至关重要的驾驶和维护TNBC的表型(无花果。1),持续活跃CDK2转基因小鼠乳腺肿瘤发生发展与官腔表现型14,我们进一步问阻塞EZH2的上游激活CDK2抑制剂(CDK2i)也可以上调ERα。 mda - mb - 231细胞治疗CDK2i dinaciclib重新ERα和与此同时抑制EZH2磷酸化T416 (pT416-EZH2)和H3K27Me3剂量依赖性的方式(图二维)。 TNBC细胞治疗CDK2i表现出减少phospho-CDK2 (T160)表明CDK2失活,与此同时增加裂解PARP (cPARP) CDK2i-induced凋亡(图的证据支持。2 e)。 TNBC细胞系BT549 Hs578T(补充图。3 a, b),和- 149乳腺癌细胞治疗dinaciclib也表现出upregulation ERα表达式和减少phospho-CDK2 pT416-EZH2(无花果。2 f和补充图。3 c)。 此外,复活ERα表达TNBC CDK2i和EZH2i发生在时间的方式,和ERα表达达到相当水平治疗后72小时(补充图。3 d)。 接下来,我们进一步测试不同EZH2i - 6438和GSK343(出口加工区)和CDK2i (dinaciclib和SNS032)目前用于临床试验,并显示所有的抑制剂能够重新激活ERα表达在不同TNBC细胞系(无花果。2 g)。 应该注意的是,免疫印迹显示基底水平低TNBC ERα蛋白的细胞株以及Tg-Neu原发肿瘤的一小部分,当我们使用了从Abcam兔单克隆抗体(ab108398)(图。2 c g和补充图。3 e)。 我们评估了ERα抗体特异性通过sgRNA-mediated ERα-knockout方法和治疗ERα-positive T47D细胞ER下降fulvestrant(富尔语)。 敲除和药物引起的损耗ERα废除了特定的蛋白带(补充图。3 f, g),支持ERα抗体的特异性。 因此,少量的ERα蛋白质可能由于TNBC的异质性26,ERα蛋白质的低水平Tg-Neu肿瘤,定义为ERα-negative,可能起源于良性肿瘤或癌变前的细胞27,28(补充图。3 e).
药理的封锁CDK2-EZH2轴开关肿瘤细胞谱系。一个小鼠官腔细胞系4 t1细胞orthotopically移植雌性Balb / c小鼠,然后处理车辆或GSK343在100毫克公斤−1口服每日9天。 肿瘤体积测量。 代表肿瘤样本显示。 点代表的意思是±SEM。 数据被双尾学生的分析t测试:* *p< 0.05。b整个组织溶解产物从不同的肿瘤治疗与车辆(Veh1和Veh2)或GSK343 (GSK3 GSK1、GSK2)进行免疫印迹分析。 细胞溶解产物从腔的T47D细胞和T47D-expressing EZH2T416D细胞(basal-T416D)被添加为积极的和消极的控制,分别GATA3和ERα。 图像的定量分析的实验由使用ImageQuant TL工具箱v8.1和规范化的加载控制肌动蛋白。 结果提出了酒吧图表所示。c3 d-matrigel文化条件下,mda - mb - 231细胞与不同浓度的EZH2抑制剂治疗,出口加工区- 6438 (EPZi)表示。 全细胞溶解产物受到免疫印迹检测ERαH3K27me3。d,emda - mb - 231细胞在基底膜基质3 d文化对待dinaciclib(蒂娜)不同浓度为3天。 全细胞溶解产物的细胞治疗与特定的抗体免疫印迹。 pT416-EZH2 (p-EZH2)探测使用特定的单克隆抗体d。 与抗体激活CDK2检测pCDK2 (T160)e。f不同TNBC细胞系在3 d文化与蒂娜治疗50 nM 48小时和全细胞溶解产物被用于免疫印迹显示抗体。gmda - mb - 231和549年英国电信3 d-matrigel文化对待不同CDK2i SNS032 (SNS)和蒂娜在100 nM, EZH2i,出口加工区- 6438(出口加工区)和GSK343 (GSK)在25μM 5μM,分别。 全细胞溶解产物TNBCs都与特定的抗体免疫印迹。 所有数字在车道表示的相对数量与肌动蛋白图像归一化。h异位表达CDK2-phospho-mimetric EZH2突变破坏CDK2i-induced ERα表达式。 的myc-EZH2T416D表达和矢量控制BT549细胞治疗50 nM蒂娜72小时。 全细胞溶解产物与特定的抗体免疫印迹。 T47D细胞溶解产物用于ERα控制。 源数据作为源数据文件提供
进一步验证EZH2磷酸化在T416 CDK2在其他TNBC细胞系,我们进行免疫沉淀反应分析与具体EZH2和pT416-EZH2抗体。 所有TNBC细胞系pT416-EZH2检查呈阳性,其水平降低dinaciclib治疗,表明CDK2负责特定站点的磷酸化EZH2和CDK2 / EZH2-signaling轴在这些细胞被激活(补充图。3 c)。 EZH2的进一步验证T416磷酸化负责抑制ERαTNBCs表达式,我们稳定表达phospho-mimic EZH2 (myc-EZH2T416D549年英国电信通过慢病毒感染细胞。 的myc-EZH2T416D稳定的细胞系是对待CDK2i如上所述。 执行EZH2的表达T416D549年BT细胞废除CDK2i-induced ERα表达式(无花果。2 h)。 这些结果表明位点磷酸化的EZH2 CDK2有助于TNBCs ERα表达式的镇压。
接下来,我们研究的分子机制EZH2i——CDK2i-induced ERαTNBC的表达。 EZH2功能如转录抑制因子通过H3K27Me3目标基因的启动子区域,我们被问及CDK2i EZH2i减少EZH2绑定到ERα启动子区域和de-repress ERαmRNA的表达。 事实上,CDK2i和EZH2i增强ERαmRNA的表达在mda - mb - 231细胞(图3)。 此外,TNBC细胞接受CDK2i或EZH2i展出调节ERα目标基因的mRNA表达,例如,PgR TFF1,原癌基因(无花果。3罪犯),这表明CDK2i——EZH2i-induced ERα表达在细胞治疗功能,因此通道。 然后我们调查了当地染色质浓缩ERαEZH2的启动子和CDK2i和EZH2i表观遗传调控的影响通过染色质免疫沉淀反应(芯片)的测定。 结果显示减少EZH2招聘ERα启动子在CDK2i或EZH2i(无花果。3 e)。 我们还观察到相应减少H3K27Me3 ERα启动子与CDK2i治疗后或EZH2i(无花果。3 f)。 这些结果表明,抑制CDK2 ERα发起人或EZH2块EZH2绑定,减少H3K27 trimethylation,和复活ERα表达,导致upregulation目标基因的表达。
EZH2直接目标ERα基因的启动子(ESR1).一个三维培养条件下,mda - mb - 231细胞治疗DMSO, dinaciclib(蒂娜)或出口加工区- 6438(出口加工区)3天。 收集细胞提取RNA。 ERα表达式是由实时rt - pcr。 数据被表示为均值±SEM (n= 6)。b- - - - - -dERα目标基因表达式实时rt - pcr测定RNA从图3一个。 数据代表的意思是±SEM (n= 3)。e染色质免疫沉淀反应(芯片)测定使用anti-EZH2抗体检测绑定ERαEZH2的启动子区域。 免疫沉淀反应的三维培养的细胞治疗DMSO隔绝,Dinaciclib或出口加工区- 6438。 数据绑定ER发起人代表相对于输入控件(±SEM,n= 3)。f芯片分析使用anti-H3K27me3抗体检测绑定H3K27me3 ER的启动子区域。 免疫沉淀反应的三维培养的细胞治疗DMSO隔绝,Dinaciclib或出口加工区- 6438。 数据绑定到ER子相对于输入控件(±SEM,n= 3)。 * *p< 0.05; * * *p< 0.01; * * * *p< 0.001,学生的t测试。 源数据作为源数据文件提供
激素疗法,如三苯氧胺,已被广泛用于治疗ERα-positive乳腺癌29。 然而,TNBC并不对激素治疗由于缺乏ERα表达式。 上述结果表明,基因和药物抑制CDK2-EZH2轴de-represses ERαTNBC的表情,初加工与CDK2i肿瘤或EZH2i可能使敏感TNBC激素治疗。 探索这种可能性,mda - mb - 231细胞首先对待EZH2i或CDK2i不同时期。 EZH2i和CDK2i-induced ERα表达,达到显著水平72 h后处理(补充图。3 d)。 因此,mda - mb - 231细胞也使用CDK2i EZH2i 72小时它莫西芬紧随其后。 预处理CDK2i或EZH2i确实呈现TNBC细胞敏感的他莫昔芬和显著降低球数量和规模(无花果。4)。 CDK2i或EZH2i加上它莫西芬诱导细胞凋亡的增加裂解PARP蛋白(cPARP; 补充图。4)。 重要的是,在体外实验中显示联合治疗的协同效应EZH2i (CI = 0.38)或CDK2i与三苯氧胺(图(CI = 0.33)。4 b)。 进一步评估是否CDK2i / EZH2i-induced ERα蛋白质功能和呈现ERα-dependent TNBC细胞,我们还测试了CDK2i和EZH2i ER拮抗剂,fulvestrant ERα结合,加速ERα退化。 事实上,EZH2i或CDK2i结合fulvestrant诱导强烈的协同anti-proliferative对TNBC细胞(图的影响。4摄氏度。 CIEZH2i +富尔语= 0.20; CICDK2i +富尔语= 0.24)和显著减少可行的细胞的数量与每个单独抑制剂(补充图。4 b)。 正如预期的那样,独自fulvestrant并不影响TNBC细胞增殖(补充图。4 b)。 一致,预处理的mda - mb - 231 EZH2i或独自CDK2i诱导ERα表达式,但是添加fulvestrant ERα减少蛋白质通过促进其降解(补充图。4摄氏度)。 这些结果表明,药物抑制CDK2-EZH2轴复活ERα表达式,inhibitor-induced ERα蛋白质功能目标,呈现对他莫昔芬和fulvestrant TNBC细胞敏感。
CDK2 / EZH2封锁创建与他莫昔芬对TNBC组合方案。一个在3 d文化有效抑制TBNCs CDK2 / EZH2抑制剂联合治疗(出口加工区,葛兰素史克公司; SNS和蒂娜)和TAM由3 d-matrigel球体形成化验。 代表图像(上半部分)和条形图球数(下半部分)。 μm酒吧,规模200人。b,c协同效应的联合治疗TNBCs体外CDK2 / EZH2抑制剂和TAMb或fulvestrant,富尔语c。d,e抑制作用的联合治疗CDK2 EZH2抑制剂和三苯氧胺(TAM)同基因的老鼠模型中肿瘤的生长。 4 t1细胞orthotopically雌性Balb / C小鼠移植。 带有老鼠第一次使用EZH2i(出口加工区- 6438; 出口加工区)34毫克公斤−1或CDK2i (dinaciclib) 8毫克公斤−1每天3天,其次是结合4毫克公斤−1TAM超过2周。 肿瘤负担与数字卡尺测量(n= 10)。 *不显著,* *p< 0.05,* * *p< 0.01,* * * *p< 0.001,学生的t测试。f,gEZH2的影响(f)或CDK2 (g)抑制剂单独或结合TAM TNBC异种移植小鼠模型中肿瘤的生长。 TNBC总和- 149细胞orthotopically裸体小鼠接种。 治疗肿瘤的老鼠和监控如上所述d,e。 EZH2i (GSK343)和CDK2i (dinaciclib)管理的剂量100毫克公斤1和8毫克公斤−1分别为(n= 10)。 *不显著; * * *p< 0.01; * * * *p< 0.001,学生的t测试。h生存曲线肿瘤小鼠接受CDK2i, TAM,或它们的组合(n= 10)。 *不显著,* *p< 0.05,* * * *p< 0.001,生存率较。 源数据作为源数据文件提供
确定CDK2i或EZH2i它莫西芬的联合治疗是有效的体内,我们建立了两个同源的裸鼠模型。 在一个试点实验中,我们首先确定的有效剂量诱导ERα表达式。 小鼠官腔4 t1细胞接种到雌性Balb / c小鼠,orthotopically和EZP6438或dinaciclib不同剂量治疗,疗程3天。 使用肿瘤接受了免疫印迹,这显示表达,ERα即使在低剂量(加工区- 6438,17毫克公斤−1和dinaciclib 2毫克公斤−1分别; 补充图。3 h)。 接下来,我们测试了CDK2i或者EZH2i +它莫西芬的同系的小鼠模型。 4 t1肿瘤小鼠接受要么EZP6438(34毫克公斤−1; 相当于102.3毫克≤2在人类)或dinaciclib(8毫克公斤−1; 相当于24毫克m≤2在人类)。 EZH2i和CDK2i选择的剂量远低于推荐的第二阶段(RP2D:出口加工区- 6438、800毫克剂量m≤2; dinaciclib, 50毫克≤2)30.,31。 结合药物治疗小鼠服用它莫西芬3天后CDKi或EZH2i单药治疗。 EZH2i或CDK2i(无花果。4 d, e)单药治疗导致显著抑制肿瘤生长的影响与他莫昔芬相比,单独或车辆控制。 EZH2i的结合或与他莫昔芬CDK2i诱导显著的肿瘤生长抑制(图。4 d, e)。 同样,在异种移植和- 149小鼠模型,EZH2i和CDK2i单方表现显著抑制肿瘤生长的影响,以及它莫西芬诱导增加了抑制效果(图。4 f, g)。 此外,CDK2i单一疗法导致温和有益影响生存率TNBC肿瘤的老鼠(图。4 h,红色虚线,p< 0.05),显著改善生存,加上它莫西芬(无花果。4 h,红色实线,p< 0.001)。 监控mono的毒性和联合疗法在肿瘤小鼠(无花果。4 d, e),我们检查主要器官的功能生化指标和体重15天治疗后的日程安排。 结果表明,血清AST、ALT、面包和肌酸都在正常范围内(补充图。5)与体重没有明显变化(补充图。5 b).
有趣的是,封锁CDK2 / EZH2轴CDK2i或遥远EZH2i显著降低肺转移模型(表4 t1同源的老鼠4)。 这个观察是一致的,在最近的研究在黑色素瘤小鼠模型32,33。 与单一治疗CDK2i或EZH2i相比,它莫西芬的适度增强TNBCs抑制对肺转移的影响(表4)。 减少远处转移的封锁CDK2-EZH2轴部分可能导致更好的生存的肿瘤的老鼠(图。4 h)。 然而,是否结合EZH2i或与他莫昔芬CDK2i协同增强对TNBC anti-metastatic影响仍由一个更系统化的方法和更多的老鼠。
Dinaciclib表明抗癌活性在白血病和其他类型的实体肿瘤作为一个单一的代理与患者的安全性19,20.。 第一阶段临床试验报告表明,患者在高剂量dinaciclib(> 29.6毫克≤2,相当于> 9.84毫克公斤−1在老鼠身上)经验的负面影响存在剂量依赖的相关性30.,31。 排除可能的毒性dinaciclib(8毫克公斤−1)结合它莫西芬(4毫克公斤−1)在小鼠体内长时间治疗计划(21天在无花果。4 f, g),我们也测量指标的值的肝脏,肾脏,心脏功能,小鼠体重的组合方案。 没有明显的毒性观察动物的组合处理8毫克公斤−1CDK2i和4毫克公斤−1它莫西芬21天(补充图。5 c, d).
最小化潜在的长期负面影响,我们接下来研究了低剂量的治疗效果dinaciclib联合治疗的最恶性TNBC的异种移植小鼠模型。 轻微的观察肿瘤生长抑制mda - mb - 231肿瘤小鼠接受dinaciclib(2毫克公斤−1,相当于6毫克m≤2在人类; 补充图。6蓝线)。 相比之下,添加三苯氧胺增强抑制性dinaciclib对肿瘤生长的影响(p< 0.01,补充图。6红线)。 如前所述,第一dose-limiting毒性(DLT) dinaciclib发生在29.6毫克≤2(相当于9.84毫克公斤−1在第一阶段临床试验老鼠)30.。 我们的数据表明,从小鼠肿瘤治疗与dinaciclib剂量(2毫克公斤−1)低于DLT展出的复活ERα表达式(补充图。3 h右面板)。 我们还观察到温和但显著影响肿瘤生长dinaciclib-tamoxifen组合(补充图。6红线,p< 0.01)。 此外,与车辆控制相比,低剂量的组合dinaciclib(2毫克公斤−1)和三苯氧胺(4毫克公斤−1)增加了60%的肿瘤小鼠的存活率(补充图。6 b红线,p< 0.05),表明这个最小剂量组合方案是充分的抑制肿瘤的生长,显著改善生存。 在一起,这些结果表明EZH2i或CDK2i加上他莫昔芬对TNBC可能是一个有效的治疗策略。
遗传学证据表明,CDK2是必不可少的大多数细胞的增殖和生存34。 具体Myc的磷酸化CDK2最近报道需要促进Myc-driven肿瘤发生和进展通过抑制衰老途径35,36。 在这里,我们首先证明了EZH2的位点磷酸化CDK2在肿瘤发生肿瘤细胞谱系需要承诺。 驱动肿瘤发生和确定血统类型、细胞应该伴随着后生改造,导致基因表达谱的交替变化。 因此,我们试图确定整个外显的变化处理的具体CDK2i / EZH2i除了谱系标记和ERα上面提到的。 为此,我们执行RNAseq分析来确定全球转录组变化- 149和异种移植肿瘤治疗CDK2i或EZH2i。 微分表达式对这些肿瘤的分析显示,超过801和741个基因受到CDK2i EZH2i治疗,分别。 其中,一般我们确定了前109调节和表达下调基因集inhibitor-treated肿瘤(图。5 a、b; GSE132194 RNAseq地理库中的数据)。 富集分析表明,调节基因主要参与(1)趋化因子/细胞因子通路,(2)生长因子通路,和(3)和信息/矩阵相互作用,在(1)和表达下调基因RNA绑定,(2)主要组织相容性复合体(MHC)途径,和(3)脂质代谢(无花果。5度)。 重要的是,在这些通常改变基因,至少有三个ERα-regulated基因的表达,SPRR2D,SPRR2G,和LCE3D显著增加(图。5 b; 补充数据集,GSE132194)。 值得注意的是,RPL39基因编码核糖体蛋白L39 CDK2i中表达下调,EZH2i-treated肿瘤(图。5 b).RPL39与治疗相关阻力、转移和癌症干细胞自我更新TNBCs吗37,38。 总共RNAseq结果提供了额外的证据支持我们的假设,表观遗传调节EZH2是CDK2的关键目标之一,而激活的EZH2 CDK2-mediated磷酸化导致全球转录组变化除了ERα和标记的鲁米那和官腔血统(补充图的说明。6摄氏度).
转录组概要文件在TNBC受CDK2 / EZH2轴。 和- 149细胞的异种移植肿瘤治疗与车辆,分别CDK2i和EZH2i。 总rna被使用的孤立肿瘤RNeasy迷你包(试剂盒)。 微分表达式分析这些肿瘤进行利用智人(GRCH37 / hg19)作为参考基因组和基因组注释和设置折叠2和变化p< 0.05截止使用Limma的包时称呼差异基因。一个维恩图的微分,一般基因受CDK2和EZH2共享。b代表热图top-regulated基因的封锁CDK2 / EZH2信号轴。c代表top-shared upregulation和表达下调基因及其相关通路。 浓缩进行了分析描述58。 源数据作为源数据文件提供
EZH2突变或过度频繁发生在淋巴瘤,白血病,和一些实体瘤类型,如乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑素瘤39。 因此,EZH2被认为是肿瘤的司机。 然而,转基因的表达野生型EZH2乳腺和前列腺腺体不会导致肿瘤的发展12,13。 我们提出了遗传证据表明CDK2-mediated磷酸化T416 EZH2的至关重要的作用作为一个肿瘤司机和血统的指标。 值得注意的是,EZH2i单独或结合他莫昔芬在肿瘤生长抑制效果低于CDK2i小鼠模型。 一致,ERα-induction肿瘤治疗EZH2i目前剂量不是CDK2i一样有效,表明目标抑制pT416-EZH2-containing复杂比无偏更有效抑制所有类型的EZH2-containing复合物de-repress ERα启动子活动。 另外,EZH2i用于我们的实验的剂量可能是太低了。 相比之下,在第一阶段的临床试验,RP2D m - 6438是800毫克剂量的出口加工区≤2,相当于259.46毫克公斤−1在老鼠身上16。 第一阶段研究出口加工区- 6438显示EZH2i有效,同时在病人16。 因此,需要进一步研究来确定一个最佳剂量的对TNBC EZH2i和它莫西芬的组合。
重要的是,我们的研究结果表明,药物抑制CDK2-EZH2轴EZH2i和CDK2i剂量低于RP2D承诺TNBC细胞诱导ERα表达式,渲染通道通过激素治疗。 有趣的是,最近的一项研究表明,EZH2抑制剂调节雄激素受体表达和敏化长达治疗前列腺癌40。 此外,EZH2活动涉及chemo-resistance小细胞肺癌,和chemo-resistance表观遗传变化是可逆EZH2i治疗41。 在一起,我们当前的研究表明CDK2-EZH2轴是一个可行的目标在不同类型的实体肿瘤,CDK2i或EZH2i结合化疗或激素治疗可能是一种很有潜力的治疗策略有效地治疗TNBC和其他实体肿瘤与EZH2过度,pT416-EZH2高。 一个阶段我研究表明dinaciclib和化疗药物盐酸表柔比星转移TNBC患者没有提供额外的好处至少部分由于大量的毒性42。 值得注意的是,在更低剂量的CDK2i比临床试验中使用当前的研究30.,42,我们没有观察到任何重大急性毒性效应,但肿瘤小鼠的生存是显著改善(无花果。4 h和补充图。5)。 三苯氧胺是广泛和有效地用于治疗乳腺癌ERα-positive可容忍的毒性29它莫西芬,没有急性毒性为单一疗法或结合EZH2i CDK2i观察使用剂量我们选择。
之前的研究表明,DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)重新激活ERαTNBC的表达式43,44,45,二期临床试验DNMTi (5-azacytidine)和HDACi (entinostat)提出了先进的hormone-resistant TNBC的它莫西芬。 然而,初步结果表明,没有一个13 TNBC患者显示部分反应治疗46。 进一步分析显示,DNMTi + HDACi TNBC患者的治疗没有诱导ERα表达式46。 细胞周期素E / CDK2 EZH2和过表达TNBC pT416-EZH2蛋白质水平高,> 80% TNBC患者样本7,11,这表明DNMT1的失活可能不足以de-repress ERα基因表达,因为磷酸化EZH2 CDK2潜在的结合和沉默ERα基因启动子在大多数TNBC患者。 HDAC抑制不诱导人类TNBC ERα细胞系或PDX小鼠模型47。 鉴于EZH2的存在是必要的绑定DNMT EZH2-target推动者而不是反之亦然48,持续激活TNBC CDK2-EZH2轴在大多数的细胞可能至少部分减弱ERα表达,诱导DNMT或HDAC抑制,目标终端中介EZH2 ERα基因表达可能重新激活ERα表达TNBC的先决条件。 哈克等。49最近报道,血小板源生长factor-CC中断信号癌细胞和微环境基质之间BLBC转换成ERα积极,从而增强对激素治疗的敏感性。 他们的研究结果提供了额外的证据支持我们的假设,将TNBC转化为ERα-positive乳腺癌是一种对TNBC患者在治疗上可操作的方法。
RNAseq分析表明,CDK2i——EZH2i-upregulated基因在趋化因子/细胞因子途径,丰富TNFA, CXCL2,CCL20,影响肿瘤微环境50。 值得注意的是,细胞因子IL-36γ被CDK2i / EZH2i调节,和肿瘤细胞分泌IL-36γ展品深刻的抗肿瘤作用和肿瘤微环境转化为一个支持根除肿瘤51。RPL39表达下调的基因通过CDK2i / EZH2i,与转移和TNBC患者的生存37,38。 因此,CDK2i EZH2i-attenuated肺转移(表4)可以部分由于镇压RPL39基因的表达。 然而,通常的目标基因的生物功能CDK2 EZH2仍有待进一步调查。
出口加工区- 6438和Dinaciclib取自Selleck化学品(休斯顿,德克萨斯州)。 从Calbiochem SNS032购买。 从AdooQ GSK343购买。 pT416-EZH2单克隆抗体免疫接种的老鼠提出了phospho-peptides (ANSRCQ-pT416-PIKMKPNIE)。 EZH2生成EZH2的定点诱变T416A和EZH2T416D突变体进行根据制造商的协议(Clontech; 帕洛阿尔托,CA)如前所述7。 从热费希尔sgRNA反对ERα得到。 详细信息在实验中使用的抗体可以补充表中找到1。
细胞系都从写明ATCC获得(马纳萨斯,弗吉尼亚州)和独立验证了STR在MD安德森DNA指纹图谱,并测试了支原体污染负的。 这些细胞在DMEM / F12或用10%胎牛血清的DMEM培养基补充,青霉素和链霉素。
MMTV-EZH2T416D (Tg-EZH2T416D)转基因小鼠被克隆生成的cDNA窝藏T416D变异的生态RI /欣质粒MMTV-SV40-BSSK dIII。 人类EZH2的互补dna测序前消化Spe我和萨尔即包含表达式的纯化DNA片段盒带EZH2突变被注入一个细胞受精卵FVB / N小鼠转基因小鼠中执行核心设施,MD安德森癌症中心。MMTV-EZH2WT (Tg-EZH2WT)老鼠12生成同样如上所述。 创始人转基因小鼠经pcr基因分型和免疫印迹分析乳腺上皮细胞与EZH2和H3K27Me3抗体。 的pcr EZH2T416D转基因是由与两对引物PCR (5´3´):
对1转发:GGAACCTTACTTCTGTGGTGT
相反,GCA TTCCACCACTGCTCCCATTC
一对2转发:CTGATCTGAGCTCTGAGT
相反:GACAAACAATTCCAACAGTC
PCR反应:95˚C, 30年代; 58˚C, 30岁,72˚C, 1分钟,30个周期。
3 d文化如前所述52。 总之,prechilled文化菜被涂上一层薄薄的冷增长因素都可以降低Engelbreth-Holm-Swarm细胞外基质提取(基底膜基质,BD生物科学,圣何塞,CA)。 菜被孵化为30分钟37°C允许EHS凝胶。 培养TNBC细胞使胰蛋白酶化和resuspended EHS在中含有2.5%。 细胞的混合物在EHS介质用移液器吸取到凝胶表面,在37°C和孵化3天。 药物被添加到prechilled EHS和细胞中含有2.5% 3 d-matrigel文化。 细胞提取从3 d-matrigel文化是由PBS-EDTA。
从治疗细胞总RNA提取3 d-matrigel文化与试剂盒(表达载体)。 定量rt - PCR(存在)是使用SYBR绿色染料Bio-Rad PCR机器上执行53。 总之,1μg总RNA的使用上标反转录成cDNA III(表达载体)的随机五个一。 所有PCR反应进行了一式三份SYBR绿色主人混合(应用生物系统公司)在1μM的正向和反向引物根据制造商的推荐热循环条件,然后进行melt-curve分析。 每个样本的目标基因的数量除以GAPDH获得的平均样本数量的相对水平基因表达。 引物序列(5´3´)记录分析如下:
ESR1转发:CTCTCCCACATCAGGCACA
ESR1相反:CTTTGGTCCGTCTCCTCCA
PGR转发:CTTAATCAACTAGGCGAGAG
PGR相反:AAGCTCATCCAAGAATACTG
TFF1转发:GTCCCCTGGTGCTTCTATCC
TFF1相反:GAGTAGTCAAAGTCAGAGCAGTCAATCT
原癌基因转发:TTCGGGTAGTGGAAAACCAG
原癌基因相反:CAGCAGCTCGAATTTCTTCC
PCR反应进行如上所述。
芯片进行了初步试验与EZ-ChIP工具包(微孔)如前所述53与抗体EZH2和trimethyl-H3K27。 总之,mda - mb - 231细胞3 d-matrigel文化对待CDK2 EZH2抑制剂72 h。 细胞然后通过添加甲醛交联10分钟最终浓度为1%。 交联反应是停止了增加1/20体积为2.5米甘氨酸其次是细胞溶菌作用和声波降解法。 一夜之间,溶解产物被孵化与特定的抗体在4°C。 交联的逆转是3小时在65°C。 qPCR纯化的DNA进行了分析。 引物序列(5´3´)ERα推动者如下:
ERα转发:TCTGCCCTATCTCGGTTACA
ERα相反:TAAAGGTGGCCCAGGGAAGA
PCR反应:95˚C, 30年代; 55˚C, 30岁,72˚C, 1分钟,30个周期。
免疫组织化学进行了如前所述54。 总之,肿瘤样本deparaffinized和水化。 抗原检索是由加热在0.01米柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)。 内源性过氧化物酶活动被1%过氧化氢。 为了防止非特异性染色,使用10%正常血清。 样本与孵化主要抗体在一夜之间在4°C。 生物素化的二次抗体和avidin-biotin过氧化物酶复杂的解决方案是在室温下培养1 h。 颜色与3-amino-9-ethylcarbazole开发解决方案。 使用迈耶的苏木精复染色进行了。 细胞系和肿瘤组织的全细胞溶解产物被用于化学发光免疫印迹试验(ECL装备,猫# 32209,热费希尔)ImageQuant LAS 40000 (GE健康生物科学AB)。 溶菌产物蛋白质被SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离,其次是与特定的抗体免疫印迹。 定量分析的图像是由使用ImageQuant TL工具箱v8.1和规范化与加载控制肌动蛋白和微管蛋白。
GEMMs原发肿瘤不同基因型的机械切成小块小(< 1毫米3.)使用手术刀,然后用胶原酶分离和氢化酶。 肿瘤的合成瀑样收集和培养我(EMD微孔)的胶原蛋白涂层six-well盘子。 主要的肿瘤细胞在DMEM / F12火腿的培养介质补充5%马血清(技术),10μg毫升−1ng胰岛素(表达载体),20毫升−1EGF(σ),100 ng毫升−1霍乱毒素(EMD微孔),0.5毫克毫升−1氢化可的松(σ),antibiotic-antimycotic鸡尾酒(Gibco)。
总rna - 149和移植肿瘤组织中分离的处理车辆,EZH2i或使用RNeasy CDK2i迷你包(试剂盒)。 RNAseq是由NOVOGENE(加州大学戴维斯分校)智人(GRCH37 / hg19)被用来作为参考基因组注释。 前109名一般调节和表达下调的基因补充数据集所示。 RNAseq数据向公众开放(GSE132194; NCBI跟踪系统# 20042815)。
识别TCGA乳房肿瘤EZH2和细胞周期素E基因超表达,我们使用TCGA的正常乳腺组织数据和设置一个截止两个标准差(SD)高于中位数EZH2的正常表达。 RNAseq数据集包括一个总乳腺癌样本和正常乳腺组织。 定义的乳腺癌亚型是PAM50基因签名。 TCGA RNAseq数据下载Broad研究所消防带网站(https://gdac.broadinstitute.org; BRCA队列)。 共有515名乳腺癌样本与肿瘤亚型和102正常乳腺组织的信息8被用于我们的分析。 打电话给基因超表达在乳腺肿瘤中,我们使用一个任意截断阈值以上两个标准偏差值正常基因的表达(log2 RSEM 8.259, 5.736和6.925 EZH2, CCNE1, CCNE2,分别)。 肿瘤与表达水平高于截止被认为是过度。
肿瘤发生化验进行原位乳腺癌小鼠模型。 T47D细胞(1×106)与lentiviral-stable EZH2的表情WT,EZH2T416A,或者EZH2T416D被注入女性NOD / SCID小鼠的乳腺脂肪垫每组(6)。 对mda - mb - 231和- 149和原位异种移植小鼠模型,1×106细胞与基底膜基质在1:1的比例混合,注入的乳腺脂肪垫ν/ν雌性老鼠。 4 t1同系的小鼠模型,1×105细胞与基底膜基质混合用于原位注射。 肿瘤大小与数字卡尺测量每3天,和肿瘤体积确定使用公式:l×W2/ 2,l最长的直径和吗W是最短的直径。 肿瘤小鼠使用出口加工区- 6438(出口加工区)口服每日或dinaciclib每天腹腔注射3天之后出口加工区或dinaciclib和它莫西芬的联合治疗。 MMTV -EZH2T416D转基因小鼠克隆生成的EZH2 cDNA窝藏T416D突变生态RI /欣质粒MMTV-SV40-BSSK dIII网站。 互补脱氧核糖核酸测序前消化了Spe我和萨尔即包含表达式的纯化DNA片段的盒式EZH2突变microinjected成一个细胞受精卵FVB / N小鼠转基因小鼠中执行核心设施MD安德森癌症中心。 MMTV -EZH2WT老鼠产生如前所述12。 创始人转基因小鼠经pcr基因分型和免疫印迹分析。EZH2液氧/液氧老鼠是亚历山大博士提供的请在洛克菲勒大学(MMRRC Tarakhovsky-015499 - unc)。 的p53LoxP鼠标线慷慨地提供了安东Berns博士(NKI-AVL)。Trp53tm1Brd乳腺癌易感基因1;tm1Ash,Tg(激光)cre) 74 acl / J,Tg (MMTV-Cre)4老妈/ J和FVB / N -Tg (MMTV-Neu)202 mul / J小鼠线路从杰克逊实验室获得(巴尔港,我)。 FVB -Tg (C3-1-Tag)cJeg鼠标和原发肿瘤文化博士提供的慷慨Khandan Keyomarsi。 小鼠乳腺组织和肿瘤组织学分析中性缓冲福尔马林固定在10% (Sigma-Aldrich),通过醇处理和二甲苯,嵌在石蜡中。 组织幻灯片被苏木精和伊红染色,表明抗体。
所有实验过程涉及综述了动物在这个研究和批准的德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构动物保健和使用委员会(IACUC; 协议编号00001245 - rn01和00001245 - rn01)。 本研究不涉及任何人类组织样本。
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