PM2.5暴露对健康的危害之一是引起肺部炎症反应。在我们以前的研究中，我们证明了永生化和原代人支气管上皮细胞均暴露于PM2.5会导致VEGF产生显着上调，这是触发慢性气道炎症的典型信号事件。进一步的研究表明，PM2.5暴露强烈诱导ATR / CHK1 / p53级联激活，从而通过激活Src / STAT3途径诱导DRAM1依赖性自噬介导VEGF表达。在当前的研究中，我们进一步发现TIGAR是p53的另一个转录靶标，可在PM2.5暴露后触发Beas-2B细胞中的自噬和VEGF上调。此外，LKB1，而不是ATR和CHK1，通过连接至Src / STAT3信号级联，在介导p53 / TIGAR /自噬/ VEGF途径激活中也发挥了关键作用。因此，结合以前的报告，我们已经确定了ATR / CHK1 / p53 / DRAM1-和LKB1 / p53 / TIGAR依赖性自噬在PM2.5暴露下介导支气管上皮细胞中VEGF的产生。而且，体内研究进一步证实，在气道中诱导VEGF可能导致PM2.5治疗的大鼠肺血管内皮的炎症反应。因此，阻断VEGF表达或自噬诱导可能是缓解PM2.5诱导的呼吸道损伤的有价值的策略。

微粒物质（PM）2.5被视为空气污染的主要成分，可导致主要在呼吸和心血管系统的病理应答1，2。吸入后，PM2.5可以进入呼吸道和肺部，沉积在呼吸道的深处并引起肺部炎症反应，这通过气道中几种促炎性细胞因子和粘附分子的上调来证明，例如如白介素（IL）-1β，IL-6，IL-8，肿瘤坏死因子（TNF）α，细胞间粘附分子（ICAM1）1等3。更长的曝光到PM2.5可以进一步诱导上述促炎因子的移动进入全身循环，然后引起在心血管系统中的若干不良反应4，5。因此，揭示参与气道炎症反应的机制可能有助于制定有效的策略来减轻由PM2.5引起的心肺疾病。

自噬是两个稳定状态和应激条件下的降解蛋白质和细胞质成分的进化上保守的分解代谢过程6。自噬与各种呼吸道疾病（例如哮喘，呼吸道感染，慢性阻塞性肺疾病等）的密切相关已在众多研究中得到充分描述。根据这些发现，肺自噬有助于异常升高很大程度上至气道粘液过度分泌，气道上皮纤维化，呼吸抗病毒反应，以及气道重塑受损7，8，9，10。因此，针对导致自噬途径激活的上游信号传递事件的治疗方法的开发被认为是治疗肺部疾病的有用方法。

p53是自噬的主要调节剂之一，它通过转录依赖方式在细胞核内发挥作用，或者通过转录依赖方式在细胞质内发挥作用11。在我们之前的研究中，我们证明了永生化和原代人支气管上皮细胞暴露于PM2.5会诱导p53反式激活和自噬，从而导致VEGF产生显着上调，这是介导慢性炎症和血管内皮功能异常的典型信号事件。肺。进一步的研究表明，溶酶体蛋白DRAM1充当p53的下游靶点，以协调自噬的诱导，因此扩展了p53 / DRAM1依赖性自噬在调节细胞凋亡中的前一机制，以响应遗传毒性应激对气道炎症反应的响应。 PM2.5。此外，我们还证明了ATR和CHK1作为上游蛋白激酶，可诱导p53级联激活，12。因此，我们已经阐明了p53依赖自噬介导PM2.5暴露后气道炎症反应的新机制。

在当前的研究中，我们进一步调查了信号事件导致p53依赖性自噬和随后的VEGF产生，以及它们在PM2.5暴露下对肺部炎症的贡献。并且我们发现LKB1通过促进另一个p53转录靶TIGAR的表达在诱导p53依赖性自噬中起关键作用。因此，结合以前的报告，我们已经确定了依赖ATR / CHK1 / p53 / DRAM1-和LKB1 / p53 / TIGAR的自噬介导了支气管上皮细胞中VEGF的产生及其对PM2诱导的肺炎性反应的贡献.5。

PM2.5暴露诱导p53自噬相关转录靶标

在我们之前的研究中，我们证明了PM2.5暴露可强烈诱导Beas-2B人支气管上皮细胞中VEGF的表达，但其他促炎细胞因子（IL-1β，IL-6，IL-8，TNFα）的水平却在体内。暴露于PM2.5前后，细胞培养基无明显差异。在试图公开了VEGF诱导涉及机制，我们观察到PM2.5曝光诱导ATR / CHK1 / p53的级联活化，导致DRAM1依赖性自噬介导VEGF的转录和分泌的诱导通过激活的Src / STAT3通路12。在当前的研究中，我们进一步研究了在PM2.5处理的Beas-2B细胞中导致p53依赖的自噬和VEGF产生的信号事件。

首先，我们试图找出更多的p53转录靶标，这些靶标可能与PM2.5暴露介导Beas-2B细胞中自噬依赖性VEGF的诱导有关。在这里，我们发现，TIGAR，Sestrin2和DAPK1，自噬相关p53的转录靶的表达水平13，14，15，分别在显著BEAS-2B细胞在12小时不同剂量PM2.5暴露后上调的（图   1A）或在不同时间段内单剂量暴露于PM2.5（100μg/ mL）下（图   1B）。即使暴露于10倍于PM2.5（1000μg/ mL）的浓度下，细胞活力也不会受到影响（图   1C，D）。此外，降低p53的水平完全阻断了PM2.5触发的这些信号分子的转录诱导和蛋白质合成（图   1E，F）。这些结果表明，在经PM2.5处理的Beas-2B细胞中，TIGAR，Sestrin2和DAPK1充当p53的下游转录靶标。

暴露于PM2.5后诱导p53的自噬相关转录靶标。（A）用不同剂量的PM2.5处理Beas-2B细胞12小时，然后检测TIGAR，Sestrin2和DAPK1的表达水平。（B）将Beas-2B细胞用PM2.5（100μg/ mL）处理指定的时间，然后检测TIGAR，Sestrin2和DAPK1的表达水平。（C，D）用不同剂量的PM2.5处理Beas-2B细胞，然后通过PI / Annexin V染色法（C）和使用细胞计数试剂盒（CCK-8）（D）在24 ℃测定细胞活力。暴露于PM2.5后h。（E）用p53 siRNA或对照siRNA转染Beas-2B细胞，然后用PM2.5（100μg/ mL）处理。PM2.5暴露后12 h检测到p53，TIGAR，Sestrin2和DAPK1的表达水平。（F）如（E）中所述转染并处理Beas-2B细胞。然后检测了TIGAR，Sestrin2和DAPK1的转录。

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TIGAR在PM2.5暴露后参与自噬依赖性VEGF的诱导

接下来，我们研究了在PM2.5暴露下，哪些p53下游靶标参与调节自噬依赖性VEGF的表达。为此，通过用各自的siRNA转染Beas-2B细胞来抑制这些p53靶标的表达。然后我们观察到抑制Sestrin2的表达既不会影响自噬小体积累（LC3BII / I和Beclin1上调）和自噬降解（p62下调）的标志水平，也不会改变PM2.5诱导的VEGF表达上调（图   2A）。有趣的是，尽管废除DAPK1表达可有效抑制LC3BI / II和Beclin1的积累和p62的降解，但在相同条件下VEGF的上调没有明显改变（图   2B）。）。因此，这些结果排除了Sestrin2和DAPK1对PM2.5对自噬依赖性VEGF诱导的可能贡献。然后，我们发现抑制TIGAR表达不仅可以阻止LC3BI / II和Beclin1表达的上调，而且可以有效地挽救PM2.5暴露后p62的降解（图   2C）。在相同条件下，通过敲低TIGAR表达，可显着降低Cyto-ID自噬检测试剂染色的Beas-2B细胞的特异性自噬荧光信号（图   2D，E）。这些结果表明TIGAR是p53的另一个转录靶标，可在PM2.5暴露下触发自噬。

TIGAR在PM2.5暴露后参与自噬依赖性VEGF的诱导。（甲 - C ^）BEAS-2B细胞用TIGAR，Sestrin2，DAPK1的siRNA或它们的对照siRNA转染的分别。然后将细胞暴露于PM2.5（100μg/ mL），在PM2.5暴露后12 h检查LC3BI / II，Beclin1，p62和VEGF的表达。（D，E）用TIGAR siRNA或对照siRNA转染Beas-2B细胞，然后暴露于PM2.5（100μg/ mL）。然后在暴露于PM2.5后12小时，用Cyto-ID绿色自噬检测试剂（D）或通过定量流式细胞仪（E）对细胞染色后，在共聚焦显微镜下检查自噬。（F如（D）中所述转染Beas-2B细胞。收集细胞上清液，并在暴露于PM2.5后24小时通过ELISA检测VEGF的表达（** P  <0.01）。（G）用TIGAR siRNA或对照siRNA 转染经VEGF启动子驱动的荧光素酶报道基因稳定转染的Beas-2B细胞，然后用PM2.5（100μg/ mL）处理。然后，在PM2.5暴露后12小时确定诱导VEGF依赖性启动子的荧光素酶活性（** P  ＜0.01）。（H）如（D）中所述转染和处理Beas-2B细胞。然后在PM2.5暴露后12小时检查Src / STAT3途径的激活。（I）用TIGAR siRNA或对照siRNA转染经STAT3依赖性荧光素酶报道基因稳定转染的Beas-2B细胞，然后用PM2.5（100μg/ mL）处理。在PM2.5暴露后12小时确定了STAT3依赖的荧光素酶活性的诱导（** P  <0.01）。

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接下来，我们研究了TIGAR在响应PM2.5暴露时在VEGF诱导中的可能作用。在这里，我们发现TIGAR表达的损伤极大地抑制了蛋白质的合成和VEGF的分泌（图   2C，F）。为了进一步证实这些结果，我们接下来检测了TIGAR是否也调节VEGF的转录。图2G中的数据   显示，敲除TIGAR表达可显着抑制PM2.5暴露后诱导的VEGF启动子驱动的荧光素酶报道分子活性。这些结果共同表明TIGAR在介导PM2.5诱导的VEGF的转录和蛋白质合成中的关键作用。

根据我们以前的报告，PM2.5诱导的自噬通过激活Src / STAT3途径12促进了VEGF的产生。在接下来的研究中，我们进一步观察到抑制TIGAR的表达完全阻断了Src蛋白激酶的激活以及STAT3的磷酸化和反式激活（图   2H，I），表明TIGAR还通过Src / STAT3途径依赖性方式调节VEGF表达。 。

PM2.5暴露后，Beas-2B细胞中p53 / TIGAR途径激活需要LKB1

在以前的报告中，我们还揭示了ATR / CHK1在介导PM2.5诱导的应答中介导p53 / DRAM1途径活化中起着关键作用12。因此，在以下研究中，我们着重于鉴定PM2.5处理后可能在Beas-2B细胞中激活p53 / TIGAR途径的上游蛋白激酶。为此，我们测试了几种已知的p53蛋白激酶（ATR，ATM，CHK1，LKB1，AMPKα，p38K）的激活状态及其对p53 / TIGAR级联激活的潜在作用。我们发现，尽管ATR和CHK1具有触发p53 / DRAM1途径激活的功能，但在PM2.5处理的Beas-2B细胞中并未参与TIGAR的诱导（图   3A，B）。在检测ATM，AMPKα和p38K时也观察到类似的反应（数据未显示）。有趣的是，在PM2.5暴露后，我们观察到Beas-2B细胞中LKB1的剂量依赖性和时间依赖性活化（图   3C，D）。最重要的是，敲低LKB1表达完全阻断了p53的磷酸化和反式激活以及PM2.5诱导的TIGAR上调（图   3E，F）。这些数据一起表明，PM2.5暴露后，Beas-2B细胞中p53 / TIGAR途径激活需要LKB1。

PM2.5暴露后，Beas-2B细胞中p53 / TIGAR途径激活需要LKB1。（A，B）分别用ATR siRNA，CHK1 siRNA或它们的对照siRNA转染Beas-2B细胞。然后将细胞暴露于PM2.5（100μg/ mL），并在PM2.5暴露后12 h检测TIGAR的表达。（C，D）将Beas-2B细胞用不同剂量的PM2.5处理12小时或用单剂量的PM2.5（100μg/ mL）处理指定的时间，然后检测LKB1的活化。（E）用LKB1 siRNA或对照siRNA转染Beas-2B细胞，然后使其暴露于PM2.5（100μg/ mL）。在PM2.5暴露后12小时检查p53 / TIGAR途径的激活。（F）用LKB1 siRNA或对照siRNA转染经p53依赖性荧光素酶报道基因稳定转染的Beas-2B细胞，并用PM2.5（100μg/ mL）处理。在PM2.5暴露后12小时确定了p53依赖的荧光素酶活性的诱导（** P  <0.01）。

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LKB1促进PM2.5暴露后Beas-2B细胞中自噬依赖性VEGF的诱导

接下来，我们研究了LKB1是否还参与调节PM2.5暴露下Beas-2B细胞中p53 / TIGAR依赖性自噬和VEGF的诱导。我们观察到，通过敲低LKB1表达可有效抑制LC3BI / II和Beclin1的上调以及PM2.5诱导的p62的降解（图   4A）。此外，来自Cyto-ID自噬检测试剂染色的Beas-2B细胞的特异性自噬荧光信号显着减少，而LKB1表达受损（图   4B，C）。在相同条件下，VEGF的转录和蛋白质合成都被完全阻断（图   4A，D，E）。这些数据表明，PM2.5暴露后，Beas-2B细胞中自噬和VEGF诱导也需要LKB1。在以下研究中，我们进一步观察到，敲低LKB1表达可显着抑制Beas-2B细胞中Src / STAT3途径的激活（图   4F，G）。综合这些数据，我们得出结论，PM2.5暴露可以通过连接Src / STAT3信号级联反应而激活LKB1 / p53 / TIGAR途径，从而导致自噬依赖性VEGF表达。

暴露于PM2.5后，LKB1促进Beas-2B细胞中自噬依赖性VEGF的诱导。（A）用LKB1 siRNA或对照siRNA转染Beas-2B细胞，然后暴露于PM2.5（100μg/ mL）。在PM2.5暴露后12小时检查自噬标志物和VEGF的表达水平。（B，C）如（A）中所述转染Beas-2B细胞并用PM2.5（100μg/ mL）处理。然后，将细胞用Cyto-ID Green自噬检测试剂染色，通过对细胞进行共聚焦显微镜分析或流式细胞术分析以定量测量细胞内的自噬荧光强度来检查自噬（** P  <0.01） 。（D）用LKB1 siRNA或对照siRNA 转染经VEGF启动子驱动的荧光素酶报道基因稳定转染的Beas-2B细胞，然后用PM2.5（100μg/ mL）处理。在PM2.5暴露后12小时确定了VEGF启动子依赖性荧光素酶活性的诱导（** P  <0.01）。（E）如（A）中所述转染Beas-2B细胞并用PM2.5（100μg/ mL）处理。收集细胞上清液，并在暴露于PM2.5后24小时通过ELISA检测VEGF的表达（** P  <0.01）。（F）如（A）中所述转染Beas-2B细胞并用PM2.5（100μg/ mL）处理）。然后在PM2.5暴露后12小时检查Src / STAT3途径的激活。（F）将用STAT3依赖性荧光素酶报道基因稳定转染的Beas-2B细胞用LKB1 siRNA或对照siRNA转染，然后用PM2.5（100μg/ mL）处理。在PM2.5暴露后12小时确定了STAT3依赖的荧光素酶活性的诱导（** P  <0.01）。

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PM2.5暴露导致呼吸道VEGF浓度升高并触发了肺血管内皮的炎症反应

为了进一步证实VEGF诱导在介导肺部炎症反应中的病理作用，然后在暴露于武汉PM2.5的SD大鼠中进行了体内分析。因为我们在先前的报告中12证明了PM2.5可以直接吸收到Beas-2B细胞中，所以将气管内（IT）滴注PM2.5的大鼠可以促进气道上皮细胞吸收PM2.5。如图   5A所示，吸入PM2.5会强烈诱导肺组织提取物中的VEGF表达，并伴有PM2.5处理的大鼠的支气管上皮中VEGF表达的明显上调和VEGF浓度的升高。支气管肺泡灌洗液（图   5B，C）。这些结果表明，PM2.5暴露能够诱导大鼠气道VEGF上调。

PM2.5暴露导致呼吸道VEGF浓度升高，并触发了肺血管内皮的炎症反应。（A）SD大鼠未经治疗或暴露于PM2.5（3mg / kg体重），然后制备肺组织提取物。然后通过western-blot法检测肺中VEGF的表达。（B）制备未处理或暴露于PM2.5的SD大鼠的肺组织切片，并通过免疫荧光测定法检测支气管上皮中的VEGF 原位表达。VEGF表达的特异性信号（红色荧光）如箭头所示。（C）从未经治疗或暴露于PM2.5的SD大鼠收集支气管肺泡灌洗液。然后通过ELISA检测VEGF浓度。（D）未免疫或暴露于PM2.5的SD大鼠的肺组织切片用于通过免疫荧光法检测驱动肺血管内皮中的血管炎症的粘附分子的表达。VCAM-1，E-选择素和P-选择素表达的特异性信号（红色荧光）用箭头表示。（E）通过HE染色检测肺血管内皮中的炎症反应。箭头表示暴露于PM2.5的大鼠血管内皮中的单核细胞浸润。（F，G）将HUVEC置于未经治疗的状态或用VEGFA（5 ng / mL）进行24 h的治疗，无论是否进行卡博替尼（1 nM）预处理2 h。然后通过免疫荧光法和定量流式细胞术检测VCAM-1，E-选择素和P-选择素的表面水平（** P <0.01）。（H）（F）和（G）中的HUVEC 与BCECF / AM标记的U937细胞共培养。通过定量流式细胞术评估U937细胞对血管内皮细胞的粘附性（** P <0.01）。

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为了确定VEGF诱导是否可以触发血管炎症反应，我们接下来研究了用PM2.5治疗的大鼠肺血管内皮中驱动血管炎症的粘附分子的表达。免疫荧光分析的结果显示，PM2.5处理后，血管内皮表面的VCAM-1，E-选择素和P-选择素表达水平较高（图   5D）。在相同条件下，在PM2.5暴露后很容易观察到HE染色信号显着增加，表明单核细胞浸润在血管内皮上（图   5E）。这些数据表明，PM2.5暴露还会引起肺血管内皮功能障碍以及气道VEGF上调。

为了确定在PM2.5暴露下VEGF上调与血管内皮功能障碍之间的潜在功能联系，在 VEGFA处理下的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中进行了体外测定，以模拟支气管内的局部反应和其周围血管在VEGF上调。在这里，我们发现VEGFA暴露导致HUVEC中VCAM-1，E-选择素和P-选择素的表达显着上调，而通过特异性VEGFRII抑制剂Cabozantinib的预处理有效地中断了这些反应（图   5F，G） 。在相同条件下，经过卡博替尼预处理，VEGFA诱导的U937单核细胞与HUVEC的粘附几乎被完全阻断（图   5H））。这些数据一起表明，VEGF的诱导有效刺激了血管内皮的炎症反应。

肺部炎症的诱导被认为是在心肺系统PM2.5诱发的不良影响的关键机制1，2。因此，说明介导气道和血管炎性反应的信号传递事件是颗粒毒理学研究的主要问题。在我们的最新报告中，我们证明了PM2.5暴露可通过激活p53依赖性自噬来诱导气道中VEGF表达的局部上调12。因此，在本研究中，我们进行了更深入的研究，以研究与PM2.5处理的支气管上皮细胞中p53 /自噬轴激活和VEGF诱导有关的上游和下游信号事件以及气道的生物学意义。在PM2.5治疗的大鼠中VEGF上调。

这项研究的重要发现之一是LKB1充当负责p53依赖性自噬诱导的上游蛋白激酶。如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，LKB1不仅用作一个完善的肿瘤抑制15，16，但也可作为AMPKs，对葡萄糖和脂质代谢在不同刺激的关键调节器的主上游激酶。因此，LKB1 / AMPK轴的激活涉及广泛的细胞功能17。据报道，自噬的诱导是在多种应激条件下激活LKB1 / AMPK途径后的主要事件18。该响应由AMPK的上mTORC1的活性的负调控，其次是mTOR抑制的解除对自噬的诱导介导19，20，21，22。最近，在肺癌细胞中也观察到了LKB1依赖性而AMPK / mTOR依赖性的自噬23，表明LKB1可能与AMPK和mTOR相关事件之外的自噬有关。在这项研究中，我们发现LKB1激活通过触发p53磷酸化和TIGAR上调，在PM2.5处理的人支气管上皮细胞中诱导自噬通量。这些结果不仅为依赖LKB1的自噬的功能机制提供了新发现，而且为应激条件下的p53 /自噬轴确定了新的调节剂。

在调节炎症累及LKB1的作用已被广泛研究在以前的报告中24，25，26，27，28，29，30，31。大多数数据支持LKB1起到抗炎作用。它不仅可以发挥拮抗由分枝杆菌感染引起的炎症反应中的保护功能，LPS或FGF21 24，27，29，而且在控制中的T细胞，心肌细胞，肾上皮纤毛，褐色脂肪组织的炎症中发挥关键作用，骨骼肌等25，26，28，30，31。在当前的研究中，我们提供了新的证据，即LKB1参与了PM2.5暴露后介导的支气管上皮细胞促炎反应。结合先前的报道（其中LKB1被证明是HUVEC 32中血栓烷受体依赖性NF-κB激活和促炎性细胞因子诱导所必需的），我们认为LKB1在炎症反应中的调节作用可能在不同条件下有所不同。

TIGAR最初被确定为p53的转录靶点，具有控制新陈代谢的功能14。然而，尽管涉及TIGAR p53独立调节的相应机制鲜为人知，但在几种人类癌细胞系33中也已检测到TIGAR p53独立表达。实际上，TIGAR是一种多功能蛋白质，不仅参与调节新陈代谢，还参与调节细胞凋亡，自噬，细胞周期进程和放射反应34。p53 / TIGAR轴在减轻缺血后减轻线粒体以加剧心脏损害中的作用和机制与TIGAR的抗氧化活性可降低ROS积累有关35。而且还显示p53独立的TIGAR表达可通过限制ROS的水平来限制营养缺乏或代谢应激条件下的自噬36。在当前的研究中，我们已经确定了TIGAR在PM2.5暴露后在促进支气管上皮细胞自噬中的相反作用，该反应严格取决于p53的活性。因此，我们得出结论，p53 / TIGAR轴激活可能在不同应激条件下正向或负向调节自噬。更重要的是，这两种p53依赖性和独立的TIGAR表达已经根据以前的报告显示出调节自噬和随后的细胞凋亡14，35，36。当前研究的数据揭示了p53 / TIGAR轴激活对VEGF表达的诱导和气道炎症反应的贡献，这为这一重要级联的功能研究提供了扩展的发现。

总之，我们已经确定了LKB1 / p53 / TIGAR依赖性自噬可介导PM2.5诱导的VEGF产生和肺部炎症反应。减轻气道中的自噬诱导或抑制VEGF表达可能有助于克服PM2.5引起的心肺损伤。

抗体，siRNA和试剂

本研究使用了以下一级抗体，包括Beclin1（CST，3495），LC3BI / II（CST，3868），p62（CST，8025），p53-p-Ser15（CST，9284），p53（CST，2524） ），Src-p-Tyr416（CST，6943），Src（CST，2109），STAT3-p-Tyr705（CST，9145），STAT3（CST，9139），LKB1-p-Ser28（CST，3482），LKB1 （CST，3047），ATR（CST，2790），CHK1（CST，2360），VEGF（sc-65617），TIGAR（sc-166291），Sestrin2（CST，8487），DAPK1（CST，3008），VCAM- 1（SC-13160），P-选择素（SC-8419），E-选择素（SC-71017）和β-肌动蛋白（sc-69879）抗体。特异性靶向TIGAR，Sestrin2，DAPK1，ATR，CHK1，LKB1，p53的siRNA及其对照siRNA购自Riobo Technology（中国广州）。VEGFA购自Proteintech Group。Inc（美国IL）。VEGFR II抑制剂卡博替尼购自MedChemExpress（NJ，USA）。

细胞培养

Beas-2B人支气管上皮细胞及其稳定转染子（Beas- 2B- VEGF -Luc，Beas-2B-p53-Luc和Beas-2B-STAT3-Luc）已建立并在我们先前的报告中进行了描述12。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人单核细胞白血病细胞（U937）在我们以前的研究中描述的37。将细胞保持在补充有抗生素/抗真菌药（Life Technologies）的10％胎牛血清（Life Technologies）的DMEM（Life Technologies）中。

PM2.5样品的收集，制备和细胞/动物处理

本研究中使用的PM2.5样品采集于中国武汉的汉阳区。为了保持过滤器样品的稳定，使用恒定的温度和相对湿度（-20±0.5°C，40±5％RH）存储过滤器。为了制备PM2.5样品，通过超声处理从水浸式过滤器中提取颗粒，然后将提取水的样品冷冻成粉末。称量粉末，分装并保存在-20°C下直至使用。对于细胞处理，将PM2.5样品粉末悬浮在细胞培养基中，超声处理5分钟后稀释至最终浓度。根据我们以前的结果，排除了PM2.5样品中的内毒素污染11。如先前所述进行动物治疗37。所有动物实验的方案均经军事认知和脑科学研究所伦理委员会批准。所有方法均按照相关准则和规定执行。

RT-PCR测定

如先前所述进行总RNA提取和反转录12，37。合成以下寡核苷酸，并用于分析TIGAR，Sestrin2和DAPK1转录的诱导：TIGAR：正向：5'-GCTGCCGATGTCAGAATGGT-3'），反向：（5'-TTCACCTCGAGTG ACTTGCC-3'）；Sestrin2：正向：5'-ACTCAGCGAGATCAACAAGT-3'），反向：（5'-TCTGTTCACTAGGGGGTGTA-3'）；DAPK1：正向：5'-CGTACCCTCCTGGATTGTGG-3'），反向：（5'-TCCTGTTGTCACA GAAGGGC-3'）。

HE染色

将未处理或暴露于PM2.5（3 mg / kg体重）的SD大鼠的肺组织浸入4％的聚甲醛中，并通过常规方法制备石蜡切片样品。在免疫染色之前，肺组织切片在二甲苯中脱蜡，通过降低乙醇浓度重新水化，然后用苏木精和曙红（H＆E）染色。染色后，通过增加乙醇和二甲苯的浓度使切片脱水。

单核细胞粘附测定

按照制造说明，用BCECF / AM（生命技术）标记U937细胞。然后将标记的U937细胞添加到VEGFA处理或未处理的HUVEC中进行共培养。通过用流式细胞术（BD Biosciences，FACSCalibur）检测荧光强度来定量评估U937细胞对血管内皮细胞的粘附。

正如我们在以前的报告中所述进行其他实验方法，包括免疫印迹法，荧光素酶报告基因检测，自噬检测，免疫荧光法，酶联免疫吸附，细胞变异性分析和统计分析，12，37。