儿童颅内放疗对年轻癌症幸存者的认知，情绪和社交能力有不利影响。在这种情况下，目前利用海马神经发生的治疗具有重要意义。锂，一种众所周知的情绪稳定剂，具有神经保护作用，促神经原作用以及抗肿瘤作用，在本研究中，我们在照射后4周引入了锂治疗。雌性小鼠在出生后第21天（PND）接受一次4 Gy全脑辐射剂量，并随机分配至0.24％Li2CO 3正常或正常食物从PND 49到77。在PND 77、91和105上评估了海马神经发生。我们发现锂处理对神经祖细胞具有增殖作用，但是神经元整合仅在停药后才发生。而且，该治疗改善了在辐照小鼠中观察到的空间学习和记忆保持的缺陷。基因表达谱分析和DNA甲基化分析确定了两个与观察到的效应相关的新因素，与微管稳定相关的Tppp和与神经元信号相关的GAD2 / 65。我们的结果表明，即使在损伤后很长时间引入锂，锂治疗也可以逆转辐射引起的海马神经发生和认知障碍的丧失。我们建议锂治疗应该是间歇性的，以便首先使神经祖细胞增殖，然后在停药后使其分化。我们的发现表明，对儿童癌症幸存者进行认知所谓晚期效应的药物治疗是可能的。

由于治疗方法的巨大进步，近十年来[ 1 ] ，儿童癌症生存率有了显着提高。治疗包括外科手术，化学疗法和放射疗法的结合，以及最近新增的免疫疗法。然而，越来越多的幸存者往往不得不面对与治疗相关的疾病[ 2 ]。众所周知，放疗会导致令人衰弱的认知改变[ 3 ]，从而导致加工速度，注意力和工作记忆受损，导致社会孤立，进一步影响情绪和心理健康，并最终导致焦虑和创伤后应激症状[ 4]。]。在智商和学习成绩下降纵向随访和这些影响生活，学习成绩的质量，以及每日总活性[中已经观察到5，6 ]。

在接受放射治疗的患者中观察到的认知变化涉及不同的机制[ 7 ]。细胞因子水平的增加似乎介导一些这些变化，以及直接和间接的DNA损伤，内分泌功能障碍，小胶质细胞和星形胶质细胞，hypomyelination的活化，和降低的神经发生[ 5，8，9 ]。特别地神经源性区域，窝藏细胞增殖，显示照射更高的灵敏度作为在啮齿动物模型和人类中[看出10，11，12]。照射，即使是单个中等剂量后，显示出引起细胞凋亡和渐进性下降在年轻大鼠和小鼠导致严重认知下降的神经发生[ 10，13，14，15，16，17 ]。成年海马神经发生在整个生命中持续存在，主要发生在海马的亚颗粒区（SGZ）和侧脑室的脑室下区（Altman和Das 1965）。这些区域具有不断分裂的神经干细胞和祖细胞（NSPC），从而诞生了新生的神经元。这被认为有助于海马可塑性，特别是学习，记忆和情绪调控[ 18，19 ]。

锂通常用于双相情感障碍的治疗，已显示出在多种神经损伤中发挥神经保护和再生作用[ 20 ]。在临床前研究锂保护，以防止缺氧缺血（HI）的神经变性效应的新生儿脑[ 21，22，23 ]，救出在成人以及在颅照射后年轻小鼠认知损失[ 24，25，26 ]。锂的颅照射后的神经保护作用是由于增强的海马神经发生与在年轻大鼠和小鼠[凋亡减少24，25 ]。

锂还可以在唐氏综合症小鼠模型中恢复突触可塑性[ 27 ]，正在进行的试验旨在将锂引入治疗广泛的脑相关疾病[ 28 ]。尽管有关锂的研究激增，但仅部分阐明了确切的作用机理。锂通过调节细胞内第二信使并随后改变复杂和相互连接的细胞内酶级联反应发挥其作用[ 29 ]。一个靶标是蛋白激酶糖原合酶激酶Gsk3β[ 30 ]。直接[ 31，32 ]和由锂GSK3β的间接抑制[ 33]导致认知功能受损的改进，可能涉及各种不同的机制，诸如支持长时程增强和减少长期抑郁，促进神经发生和最终还原的炎症和凋亡的24，25，34，35 ]。

令人鼓舞的结果支持使用锂的结合癌症治疗，以提高治疗效果，例如，作为放射增敏剂[ 36，37，38，39]。然而，放射治疗后的锂治疗仍可能是优选的，以安全地排除保护肿瘤细胞的风险，从而增加复发的风险。本文的研究调查了锂治疗对脑照射后NSPC增殖，存活，树突取向和认知的影响，以及治疗相关剂量是否能在幼年脑照射后很长时间就能挽救神经发生并改善记忆缺陷。最终，我们为涉及锂靶向的新型蛋白质的可能分子机制提供了证据，并进一步阐明了辐射对NSPC命运的影响以及锂如何利用这一过程。

在3个不同的时间点（PND 77）之后，PND 91（PND 91）之后2周和（PND 105）4周之后（PND 105）在三个不同的时间点进行神经发生的评估（增殖，树突取向和NSPC的存活）。暴露（图   1a体内研究设计）。

辐照后4周锂处理增加了PND 77上GCL的增殖，但神经元成熟没有增加。体内实验设计的时间表显示，辐照后4周开始了锂处理。研究了三个不同的时间点（PND 77、91和105）以评估锂对神经发生的早期和晚期影响。b在PND 77下，不同治疗组的GCL中的BrdU免疫反应性。比例尺= 100 µm。×20放大倍率。Ç的BrdU定量的交错点图在图GCL表示深水（*锂处理的效果p  = 0.0485）和IRR组（* p = 0.0471）。双向方差分析表明，辐照和锂处理均具有效果：辐照（F 1,16  = 57.77，＃p ＃  0.0001），锂（F 1,16  = 12.45，** p  = 0.0028）。d PND 77上不同治疗组的GCL中的DCX免疫反应性。比例尺= 100 µm。×20放大倍率。e PND 77上的GCL中DCX定量的交错点图图。双向ANOVA显示辐照但不锂处理的影响：辐照（F 1,16  = 127.3，#### p  <0.0001），锂（F 1,16  = 1.34，p = 0.7974）。锂处理未改变Sham（p  = 0.8097）或Irr（p  > 0.9999）组DCX阳性细胞的密度。f所有实验组在DCX +细胞中树突状示踪的代表性图像。g细胞体面积（µm 2）表明，在PND 77 时，锂处理显着降低了Sham和Irr组的未成熟细胞的大小。h DCX +未成熟神经元的树突复杂性的点图显示了ShamLi，Irr中较低的复杂性和IrrLi与Sham在PND 77处进行比较。圆圈，三角形和正方形标记代表每只动物中每个神经元的值。ñ（动物数量）=每组3只。每只动物的追踪神经元数量为15-20。线性混合模型，* p  <  0.05，** p  <  0.01，*** p  <  0.001。误差棒代表点估计和95％置信区间。i Sholl对DCX +未成熟神经元的分析表明，锂处理减少了Sham的PND 77处树突远端部分（50-60 µm）的交叉点数量，但不适用于Irr脑。误差棒代表SEM **** p  <0.0001；** p  <0.01；* p  <0.05

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连续四周的锂处理增加了DG中增殖细胞的数量，但降低了双皮质素阳性（DCX +）细胞的细胞体面积和树突状复杂性

为了分析锂对NSPCs增殖的影响，我们测量了在PND 77上BrdU的掺入（图   1b）。通过媒介物和锂处理的小鼠的照射，GCL中的增殖显着降低（图   1c）。假手术组和假手术组中，锂均增加了增殖细胞的密度，假手术组和假手术组分别为83％和33％。我们进一步确定了锂对PND 77上GCL 中双皮质素阳性（DCX +）细胞密度的影响（图   1d）。辐照使GCL 中的DCX +细胞密度降低了60％，但锂对假手术和经辐照的大脑都没有影响DCX +细胞密度（图   1e））。

此外，我们在PND 77上进行了DCX +未成熟神经元的形态分析（图   1f）。我们发现，锂处理可减少假手术动物和受辐照动物的细胞体面积（图   1g），而放射线可显着降低树突状细胞的复杂性。在PND 77上的ShamLi，Irr和IrrLi组中观察到树突复杂性降低（图   1h）。肖尔分析表明，锂处理减少了假手术中PND 77上树突远端部分（距躯干50和60μm）的交叉点数量，但在受辐照的动物中却没有（图   1i）。

锂的中断阻止了PND 91上DCX +细胞的辐照诱导的过程方向和树突复杂性的改变

为了评估PND 77上增殖细胞的增加是否导致存活率提高和分化为未成熟神经元，我们分析了锂停用2周后PND 91上GCL 中DCX +细胞的密度（图   2a）。如预期的那样，通过辐射降低了DCX +细胞密度，但锂处理却逆转了这种降低。同样，在未经辐照的大脑中，DCX +细胞密度增加。锂和假锂处理组分别增加了156％和24％（图   2b）。为了进一步解决辐射和锂处理对新生神经元整合的影响，我们进行了DCX + / BrdU +双重免疫染色（图   2c），使我们能够确定在锂治疗的最后5天出生的神经元的主要树突过程的方向与GCL平行还是径向。我们之前已经表明，辐照会导致主要的树突状过程从径向方向变为平行方向[ 40 ]。我们的结果证实，辐照将平行过程的百分比从假手术中的22％增加到被辐照的41％，而放射状过程的数量从假手术中的64％减少到被辐照的48％（图   2d）。值得注意的是，我们发现锂处理将受辐照的大脑的并行主要过程的百分比降低了一半，从41％降低到21％，降至与假对照组相同的水平（22％）（图。 2d）。然而，无论是在假手术还是在辐射过的大脑中，锂都没有改变放射状主要过程的比例。此外，我们发现，与未用锂处理的辐照组（11％）相比，在用锂处理的辐照组（25％）中未标记DCX 的BrdU +细胞数量增加了。然而，PND 91上DCX +细胞的形态分析（图   2e）显示，受辐照组的细胞体面积与假手术组无差异，锂也没有影响细胞体面积（图   2f）。 。DCX +的树突复杂性与假手术组（7％）相比，辐照组的细胞数量明显减少，但是锂处理将其完全恢复到假手术水平（图   2g）。Sholl分析进一步证实了这一点，我们发现在PND 91上用锂处理的辐照组中，距躯干50和60 µm处的交叉点数量被标准化为假水平（图   2h）。

锂还原射线诱导在Doublecortin的枝晶树枝状（DCX改变+）细胞在DG的颗粒下区（SGZ）在PND 91. 一个在PND 91比例尺=100μm的DCX免疫反应不同治疗组的GCL 。×20放大倍率。b GCL 中DCX +细胞定量的交错条形图，显示了假手术组（** p  = 0.0030）和Irr组（** p  = 0.0023）锂处理的效果。双向方差分析显示了两种处理的效果：辐照（F 1,18  = 400.6，#### p  <0.0001），锂（F 1,18 = 28.70，**** p  <0.0001）。c通过对BrdU和DCX进行双重标记来确定PND 91处未成熟神经元的径向（上图）和平行（下图）过程的表型，如DCX +（红色），BrdU +（绿色）的代表性共聚焦图像所示。并在GCL中合并了BrdU + –DCX +单元。比例尺= 20 µm。d带有DCX双重标记且呈放射状或平行过程表型的BrdU细胞百分比的饼图。lithium治疗未影响of突的百分比：假 手术组p = 0.2341和Irr组p = 0.5313。双向方差分析显示辐照对放射状过程的影响：辐照（F 1,18  = 24.4，*** p  =  0.0001），锂（F 1,18  = 3.96，p  =  0.0619）。辐照后，平行过程的百分比增加，锂处理恢复了Irr组的平行过程的百分比（**** p  <0.0001），但对假手术组没有影响（p  = 0.0570）。两向方差分析：辐射（F 1,18  = 33.59，**** p  <0.0001），锂（F 1,18  = 34.75，**** p <0.0001）。未标记DCX的BrdU百分比不受辐射影响，但在IrrLi组中有所增加（** p  = 0.0094）。双向方差分析：相互作用（F 1,18  = 5.277，* p  = 0.0338）。e所有实验组的动物DCX +细胞中树突状示踪的代表性图像。˚F示出在PND 91没有任一锂或辐射的作用细胞体区域的点图图克DCX的树突状复杂的点图图+与PND 91时的所有其他组相比，Irr组中的未成熟神经元显着减少。圆圈，三角形和正方形标记代表每只动物中每个神经元的值。每组中N（动物数量）= 3。每只动物的追踪神经元数量为15-20。线性混合模型，* p  <0.05，** p  <0.01，*** p  <0.001。误差棒代表点估计和95％置信区间。h对DCX +未成熟神经元的Scholl分析显示，锂治疗恢复了Irr PND 91处树突远端部分（50-60 µm）的交叉点数量，但在假手术治疗组中则没有。ñ（动物数量）=每组3只。每只动物的追踪神经元数量为15-20。两向方差分析和事后Bonferroni测试。 与Irr组相比，* p  <0.05，*** p <0.001。误差棒代表SEM。**** p  <0.0001; ** p  <0.01；* p  <0.05

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锂在体外照射后参与细胞周期和神经元信号传导的上调基因与DNA甲基化的变化相关

为了研究辐照后锂效应可能涉及的分子机制，我们设计了一项体外研究（图   3a），其中在第3代扩增（P3）后，从15.5天大鼠胚胎的端脑分离出的NSPCs暴露于2.5 Gy辐照和锂处理[ 41 ]。最初，我们进行了RNA测序，并比较了不同条件下的Reactome。主成分分析显示，假假组聚在一起形成PC2（图   3b），而受辐照组聚集成PC3（图   3c）。），表示NSPC对个别治疗有特殊反应。对每台PC的Reactome配置文件的更深入分析显示，PC2识别了与多种大脑发育以及突触传递过程有关的基因表达的变化（图   3d），而PC3则发现了主要涉及以下基因的差异基因表达：细胞周期以及轴突引导（图   3e）。为了确定参与特定应答的单个候选基因，我们接下来寻找假表达和假锂处理（图3f）之间以及假以锂处理（图3g）之间的基因表达的最高倍数变化   。 ）。该分析突出了两个基因，一个编码微管蛋白聚合促进蛋白（Tppp），另一个编码GAD65蛋白的谷氨酸脱羧酶2（GAD2）基因[ 42 ]。通过RT-qPCR证实了mRNA水平，并且锂占假手术和照射组的Tppp表达水平（图   3h）以及GAD65（图   3i）的大部分变异性。

锂调节体外细胞周期和神经元传递相关基因的表达。体外实验设计的时间轴显示，神经干祖细胞（NSPC）在第0代（P0）建立，在第3代（P3）暴露于锂中，照射后进行RNA测序。b，c主成分（PC）分析图基于过滤后的百万分之一标准化数据，这使我们能够识别不相关的变量，从而解释不同治疗组（Sham，ShamLi，Irr和IrrLi）中最大方差的来源）。d基因本体论（GO）分析表明，PC2不同治疗组反应组的变化与神经元传递有关。“ numDEInCat”是相应的GO类别中差异表达（DE）基因的数量，而“ numInCat”是相应的GO类别中检测到的基因数量。È基因本体论（GO）分析表明，在不同的处理组的对PC3的reactome的变化相关的细胞周期调节。f与用锂处理的ShamLi细胞相比，Sham细胞中差异表达的基因表。g辐照细胞与辐照细胞相比差异表达基因的表。H对鉴定出的细胞周期基因的基因表达分析表明，锂在假手术和辐射细胞中均显着增加了Tppp表达。双向方差分析显示锂处理的效果：辐照（F 1,16  = 0.5473，p  = 0.4702），LiCl（F 1,16  = 5.439，* p  = 0.0331）。我的所识别的神经元传递的基因表明，锂在两个深水和IRR细胞显著增加GAD65表达的基因表达分析。双向方差分析显示锂处理的效果：辐照（F 1,16  = 0.1073，p  = 0.7475），LiCl（F 1,16  = 4.576，* p = 0.0482）。误差棒代表SEM。**** p  <0.0001; ** p  <0.01；* p  ＜0.05。j通过MeDIP-qPCR对Tppp进行的甲基化分析显示组之间存在显着差异（* p  = 0.0145）。事后检验显示，与假手术组相比，IrrLi组明显减少（* p  =  0.0123）。ķ GAD65的的MeDIP-qPCR分析表示组之间的差异显著（* p  =  0.0112）。事后检验显示，与假 手术（* p  = 0.0284）和IrrLi组（* p  = 0.0273）

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为了研究基因表达变化的潜在机制，我们接下来使用基于MeDIP的方法[ 43]分析了Tppp和GAD2基因调控区对DNA甲基化的影响[ 43 ]，并分析了5-甲基胞嘧啶（5mc）的水平。我们开发的体外胎儿神经干细胞模型中这两个基因的调控区。调节区域的DNA甲基化最经常但不是唯一地与转录阻遏有关，因此甲基化水平降低通常与基因表达的高水平相关，但并非总是如此[ 44]。这些实验揭示了辐射和锂处理对基因表达的影响与相应的DNA甲基化水平之间存在明显的相关性。与假对照组相比，在Tppp基因处，经放射处理的细胞经过锂处理后5mc水平显着降低（图   3j）。在该5MC水平GAD2调节区还显示出与假手术对照组和照射组（图相比，与锂处理的照射组一个显著下降   3K）。这些结果表明，辐照后的锂处理会影响表观遗传机制，从而降低DNA甲基化水平。

锂在体内辐照小鼠体内上调Tppp和GAD65水平

为了能够验证我们体内模型中的DNA甲基化和RNA测序数据，我们通过免疫印迹研究了海马组织中Tppp和GAD65的蛋白表达水平。在所有治疗组中，PND 77上的Tppp水平均相同（图   4a，b和补充图   1A），而在PND 91处，辐照锂处理组的Tppp表达显着增加（图   4c） ，d和补充图   1B）。辐照组中PND 77上GAD65的水平显着降低，而其他组则未改变（图   4e，f和补充图   1C）。），但在PND 91上，其表达在用锂处理的照射组中显着增加（图   4g，h和补充图   1D）。

锂调节体内细胞周期和神经元传递蛋白的表达，并逆转辐射诱导的小鼠DG中NSPC命运进程的变化。a在PND 77处Tppp迁移的代表性蛋白质印迹泳道。在37 kDa的分子量处观察到Tppp信号。在预期的分子量118 kDa处观察到用作载体对照的Vinculin。b点图显示了在PND 77处Tppp相对于其负载对照纽蛋白的标准化化学发光峰的定量。在所有治疗组中DG中Tppp表达水平均未改变。两向方差分析：辐射（F 1,16  = 0.4998，p  = 0.4898），锂（F 1,16  = 3.654，p = 0.0740）。Ç在PND 91 TPPP迁移的代表性免疫印迹泳道d点图曲线图，表示对在DG PND 91. TPPP表达水平它的加载控制纽蛋白TPPP的归一化的化学发光的峰值的定量在IrrLi组显著增加（ * p  = 0.0313）。两向方差分析：照射（F 1,16  = 0.7927，p  = 0.3865），锂（F 1,16  = 3.414，p  = 0.0832）。e PND 77处GAD65迁移的代表性蛋白质印迹泳道。在65 kDa的分子量处观察到GAD65信号。在预期的分子量118 kDa处观察到用作载体对照的Vinculin。f点图显示了GAD65的标准化化学发光峰相对于PND 77上的对照蛋白纽蛋白的定量 。Irr 组中DG中GAD65的表达水平显着降低（* p = 0.0431），但未观察到变化。其他组。两向方差分析：照射（F 1,16  = 5.232，* p  = 0.0361），锂（F 1,16  = 0.599，p  = 0.4502）。克在PND 91 GAD65迁移的代表性免疫印迹泳道ħ点图显示了在PND 91处GAD65相对于其上样对照蛋白的标准化化学发光峰的定量。在IrrLi组中DG中GAD65表达水平显着增加（** p = 0.0017）。双向ANOVA：照射（˚F 1,16  = 3.543，p  = 0.0781），锂（˚F 1,16  = 7.228，* p  = 0.0161。我代表共焦的NeuN（红色），BrdU的（绿色），和S100β的图像（蓝色）的免疫反应性在GCL在PND 105描绘的BrdU和NeuN的在成熟的神经元（上图）和BrdU和S100β的共定位的共定位在星形胶质细胞（下图）。比例尺=20μm以下。×63的放大倍数。Ĵ饼状图，标有针对NeuN或S100β双重标记的BrdU细胞百分比。在IrrLi（** p  = 0.0031）中，NeuN + / BrdU +细胞的百分比显着增加，而在ShamLi  组中则没有增加（p > 0.9999）。两向方差分析：辐照（F 1,14  = 22.5，*** p  = 0.0003），锂（F 1,14  = 7.02，* p  = 0.0191）。辐照后，S100β + / BrdU +的百分比显着增加，但通过锂处理部分归一化。两向方差分析：辐照（F 1,14  = 4.89，* p  = 0.0442），锂（F 1,14  = 0.831，p  = 0.3774）。Irr组中BrdU +细胞的剩余百分比显着增加（* p  = 0.0137），而其他组中未改变。两向方差分析：照射（F 1,14  = 13.1，** p  = 0.0028），锂（F 1,14  = 5.12，* p  = 0.0401）。ķ DCX免疫反应性在PND 105在不同的治疗组的GCL。比例尺= 100 µm。×20放大倍率。l GCL 中DCX +细胞定量的交错点图显示辐射的影响（**** p <0.0001）在GCL中DCX阳性细胞的密度。两向方差分析：辐照（F 1,16  = 372.2，＃  < = p p <0.0001），锂（F 1,16  = 0.02213，p  = 0.8836）。误差线表示SEM。*** p  <0.001；** p  <0.01；* p  <0.05

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锂可阻止其在停药后4周观察到的辐射引起的nspc命运变化

为了评估NSPC在以后的神经发生过程中的存活和分化，我们在PND 105上的DG中进行了BrdU，NeuN和S100β的三重免疫染色（图   4i）。我们发现，辐射显着降低了NeuN / BrdU +细胞的比例（从76％降至40％），并增加了S100β/ BrdU +细胞的比例（从10％至21％）（图   4j）。辐照后的锂能够将神经元定律的百分比从40％恢复到66％，星形胶质细胞定律的百分比从21％恢复到14％，接近虚假水平。锂不会改变假动物的细胞命运。此外，辐射显着增加了存活细胞的百分比（BrdU +）既不是神经元谱系也不是星形细胞谱系。为了进一步评估锂是否对DCX +电池的正调制具有持久的影响，我们分析了PND 105上GCL中DCX +电池的密度（图   4k）。辐照后密度仍显着降低，与以前的模型一致（Boström等，2013）（图   4l）。另外，在载体和经锂处理的小鼠之间，DCX +细胞的密度在照射组和假手术组中均没有显着差异（图   4l）。另外，BrdU +密度的定量（细胞/ mm 3在PND 105处，GCL中的结果显示，在假手术组中，放射线降低了存活率，而锂增加了成人生成的DG细胞的存活率（Sham = 8064 vs ShamLi = 10,791，** p  = 0.0016），但在辐照组中则没有（ Irr = 3459 vs IrrLi = 4469）。总之，这表明锂处理促进了NSPC的增殖，而中止处理则促进了神经元分化的浪潮，同时阻止了辐射诱导的星形细胞分化的浪潮。

锂在停药4周后缓解了辐照引起的空间学习和记忆保持障碍

评估小鼠在莫里斯水迷宫（MWM）中的空间学习，记忆和逆向学习，这是一项公认的海马依赖任务（图   5a）[ 45 ]。根据发现可见平台的潜伏期（p  > 0.05，数据未显示）判断，在提示的MWM进行提示的第一天中，未观察到视觉缺陷（因此，所有小鼠都包括在该任务的后续阶段中）。在第一个采集期间（第2-7天），所有组均显示学习，因为随着时间的流逝，寻找隐藏平台的平均潜伏期和距离减少（图   5b和补充图   2）。）。有统计学上显着的组效应，但没有组×天互动和事后比较显示，Sham和IrrLi小鼠比ShamLi和IrrLi小鼠表现出更好的学习，即，在训练过程中寻找潜伏平台的潜伏期和距离缩短了天。在逆向学习期间，所有组都能够学习平台的新位置，这可以通过减少任务的第8天到第10天之间的等待时间和距离游击来判断（图   5b和补充图   2））。逆向学习没有观察到小组效应或小组×天互动。重要的是，在整个任务（第1-10天）中，所有小鼠的游泳速度都显示出正常且相似的游泳速度（Sham 19.51±0.28 cm / s，ShamLi 19.62±0.36 cm / s，Irr 19.82±0.43 cm / s，IrrLi 19.89±0.28 cm / s s），爬上淹没式逃生平台没有任何困难。

锂挽救了辐射引起的海马依赖性学习和记忆障碍。莫里斯水迷宫任务的实验方案；该平台在提示，学习和逆向学习培训课程之间移动。b所有组均成功学习了一段时间内的隐藏目标（GEE的潜伏期：W 5,270  = 64.960，### p  <0.001）和逆向学习测试（GEE的潜伏期：W 2,135  = 37.8941，### p  <0.001），但在第一个采集期间（第2-7天），Sham和IrrLi小鼠发现隐藏平台的速度比Irr和ShamLi小鼠快（GEE组效应：W3,270  = 29.384，*** p  <0.001; 事后检验：Sham vs. ShamLi p  = 0.004，Sham vs. Irr p  <0.001，IrrLi vs. ShamLi p  = 0.005，IrrLi vs. Irr p  <0.001）。c逆向学习的第一个试验的所有动物群的代表性热图。d与上一个目标位置的穿越次数。与Irr和ShamLi小鼠相比，IrrLi和Sham小鼠对平台的先前位置表现出更高的偏好（GLM组效应：W 3,45  = 58.844，p  <0.001；事后测试：Sham vs. ShamLi *** p  <0.001，Sham vs. Irr *** p <0.001，ShamLi与IrrLi *** p  <0.001，Irr与IrrLi *** p  = 0.001）。e在反向学习的第一天的第一次试用期间，在象限中花费的时间。有显着的群体效应（GLM：W 3,45  = 23.068，p  <0.001）。在获取期间，Sham和IrrLi动物对平台所在的象限表现出比Irr小鼠更强的偏好（事后测试：Sham与Irr *** p  <0.001，Irr与IrrLi *** p  = 0.001 ），而ShamLi与其他三个组相比则具有中等价值。F左侧海马网络示意图。来自内嗅皮层（EC）的输入信号通过两条连接路径传输，分别由内侧（浅绿色）和外侧（蓝色）穿孔路径的轴突组成，MPP和LPP。这些轴突与成熟的颗粒细胞神经元的树突（灰色）建立稳定的突触，而与未成熟的双皮质素（DCX）细胞（红色）在颗粒细胞层（GCL）中的树突建立稳定的突触。颗粒下带（SGZ）位于GCL和hilus的边界，静止的神经干细胞（qNSC）产生扩增的神经祖细胞（ANP），允许齿状回（DG）的连续神经元重新繁殖。qNSC和ANP是多能干细胞，能够产生星形胶质细胞，少突胶质细胞和神经元。来自DG的输入信号通过成熟的颗粒细胞的轴突传递到近端的角膜氨化区域（CA3），该轴突形成了长满苔藓的纤维突起。信号转导继续通过沙弗尔侧支纤维到达CA1区，并最终到达其他皮质区域。hilus中的小白蛋白（PV）中间神经在通过反馈和前馈抑制来调节输入信号以及通过释放神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的NSC增殖和整合中起重要作用。右上：辐照对DG的影响的示意图。星形胶质细胞的数量增加而ANP的数量减少。神经元分化过程减少，有利于星形细胞命运的发展。右下：锂对辐照DG的影响的示意图。与星形胶质细胞分化相比，锂通过增加ANPs细胞数量和促进神经元命运的发展发挥作用

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从热图中可以明显看出（图   5c），在反向学习的第一天的第一个试验中（可以认为是记忆保留测试），与平台先前位置的交叉次数存在显着的组差异。 （图   5d），以及在训练的前几天在放置平台的象限中所花费的时间（图   5e））。与ShamLi和IrrLi小鼠相比，Sham和IrrLi小鼠的射门次数更高，这表明Sham和IrrLi组的记忆保持力更好。此外，在获取期间，Sham和IrrLi动物在平台所在的象限中表现出比Irr小鼠更强的偏好，而ShamLi与其他三个组相比则具有中等价值。

锂即使在受伤后很长时间才有效

颅骨放射疗法是小儿患者长期并发症的主要原因[ 1 ]。在这里，我们选择调查女性患者，由于其倾向从照射后认知缺陷[遭受更多的6，46，47 ]，并考虑到锂效果不依赖于性，我们认为，在女性成功的锂盐治疗可能援助男性受试者以相同的程度[ 48，49 ]。这些并发症包括后期出现认知障碍，以及社会能力[产生负面影响3，50]。它已被证明在动物模型中维持或促进神经元再生有助于照射小鼠和大鼠[观察削弱认知缺陷26，40 ]。进展在查明底层锂的脑损伤的啮齿动物模型，包括抗细胞凋亡作用[神经保护作用的机制而完成的23，25，51 ]。当锂在损伤后5天给药后，即使未成熟的HI可使脑组织损失减少39％，也显示出再生作用[ 21]。]的模型中，神经元细胞的死亡在HI后1-2天达到峰值，但其潜在机制尚未被鉴定。从未报道过在全脑颅照射后延迟给予锂以维持神经发生。在这项研究中，我们证明，即使在损伤后很长时间引入锂，雌性小鼠的锂处理也可以逆转辐射诱导的海马神经发生损失和认知障碍。

辐照引起的海马损伤后，GCL中的神经发生级联经历了一些持久的变化：NSPC凋亡增加，NSPC增殖持久减少，这些NSPC分化的倾向性降低，其中神经胶质形成优于神经发生。发作炎症的[ 10，25，52 ]。现在我们证明，在PND 77上，经过连续4周的经锂辐照小鼠锂处理后，锂可促进NSPC的增殖，如BrdU +密度的增加所表明的GCL中的单元格。在另一项研究中，我们发现锂在体外增强了小鼠海马来源的NSPC的增殖，与对照组NSPC相比，它们在细胞周期的G1期更快地驱动了它们[ 41 ]。在齿状回响应亲神经的刺激，如体育锻炼，丰富的环境，和抗抑郁药的细胞中，主要是放大神经祖细胞[ 53，54，55，56 ]。因此，锂可能会增加扩增的神经祖细胞群体的对称分裂速率，这将具有治疗益处，因为那些细胞代表了神经元前体的可再生来源。

为什么要选择延迟开始锂治疗？锂对肿瘤细胞的作用只是部分探讨[ 26 ]，存在潜在的风险，即锂不仅可以增强正常脑组织的神经发生，而且可以增强其余肿瘤细胞的增殖。因此，当肿瘤复发的风险较低时，对脑瘤治疗后认知迟发效应的“药理康复”可能在治疗结束后的几年内更安全。锂的某些促增殖作用是基于已被充分描述的途径[ 29 ]，但仍未完全理解。已经描述了锂对脑肿瘤细胞或白血病细胞的某些作用：尽管锂可能无法保护肿瘤细胞[ 24，26 ]，或甚至可能作为在某些类型的髓母细胞瘤[的抗肿瘤剂36，37 ]，成胶质细胞瘤[ 39 ]，神经胶质瘤[ 57 ]或白血病[ 58 ]，其对其它类型的肿瘤细胞作用仍然不确定。因此，它可能是最好等到抗癌疗法已完成。因此，正如我们所做的那样，证明锂可以在辐照后很长时间内挽救神经发生，是验证其在儿童脑肿瘤幸存者中使用之前的重要步骤。然后，锂治疗可用于已接受治疗且患有迟发性认知缺陷的所有幸存者。

间歇治疗很重要

从概念的角度来看，至关重要的是，即使在放疗后很长时间，研究增强神经发生和认知功能是否完全可行。我们发现在体内首次锂停药可以在照射脑恢复神经元命运进展，从而抵消先前描述NSPCs的照射诱导的星形胶质细胞分化[ 59，60]，进一步表明锂在颅放疗后恢复神经发生中的作用。以稳定的血清浓度连续口服锂可促进NSPC增殖，但可防止神经元分化。停药允许在接下来的4周内发生分化和整合。因此，我们推测序贯的治疗方案，例如含锂1个月和不含锂1个月的治疗方案，将更有效地治疗认知迟发效应。另一个优点是可以更好地耐受锂治疗患者中经常报道的副作用[ 61 ]。这是一个新颖的概念，值得在患者中进行测试。

机制识别

体外研究大鼠神经干细胞和体内研究小鼠海马神经发生，使我们能够确定间歇性锂治疗的积极作用的分子机制。相关的功能整合DCX的两个指数+细胞进入GCL是积分DCX的取向+细胞，和它们的树枝状突起[成熟62，63 ]。3型成神经细胞具有细长的细胞体，其侧翼与SGZ相切，暗示了成熟的早期阶段，而新生神经元对SGZ呈放射状，表明功能整合到了颗粒细胞层[ 64]。通过表型分型在用BrdU和DCX双标记细胞树枝状突起的取向中，我们发现，如先前报道[ 40，65]，该辐射减少了径向迁移，并增加了该细胞群内神经元不同子集的平行树突状过程的数量。在用锂处理的辐照小鼠中，具有平行树突的细胞百分比降低，但径向迁移模式不受影响。可以说，锂通过限制具有平行树突过程的细胞数量来防止辐射损伤，从而在该阶段不维持未成熟的神经元。总的来说，这些数据表明锂的停用对于新生儿细胞存活的关键关键时期以及其结构和突触整合至关重要。在这里，辐照持续降低了树突的复杂性（数量，长度66，67 ]。我们扩展了这些发现，并表明连续的锂处理以及一段不含锂的时间对树突的成熟和复杂性具有积极的作用，这是一个形态计量学参数，在记忆功能和抗应激机制中具有重要的功能意义[ 68 ]。我们假设这归因于参与细胞骨架重排（Tppp）和突触传递（GAD65）的关键调控蛋白。已知Tppp表达可提高微管网络的稳定性，从而在细胞分化中发挥关键作用[ 69 ]，而敲低GAD65会损害新生颗粒细胞的成熟[ 70]。]。令人惊讶的是，在停用锂后2周（PND 91），Tppp和GAD65在体外的mRNA水平和体内的蛋白质水平均被上调（PND 91），进一步证实了锂对神经发生过程以及神经元过程的正调节作用。停止锂的增殖驱动以使新生细胞整合的重要性。辐照后GAD65表达的减少与以前的观察结果一致，表明辐照减少了下层皮层中GABA能，小白蛋白阳性细胞的数量和激活[ 71 ]，而其他人则报道了大麻素1中神经元中GABA释放增加，强直性GABA能信号减少，并增加海马的主要细胞活化[ 72]。两种类型的中间神经元均能调节主要细胞的活化，并且我们先前证明了早期生命照射会增加成年齿状回的兴奋性并损害其长期增强能力[ 73]。]。一种假设是，照射到抑制性网络上的辐射会长期破坏不同大脑区域的同步活动，并且锂可能通过增加被辐射的大脑中GAD65的表达来使总体抑制-激发平衡正常化。此外，我们发现，在用锂处理的辐照组中，Tppp和GAD65的表达增加都伴随着这两个调节基因甲基化的减少，这表明辐照后锂的积极作用归因于表观遗传调节。对细胞命运，成熟和整合至关重要的基因。

值得注意的是，锂诱导的Tppp和GAD65的上调仅发生在受辐照，受伤的组织中。这表明间歇性锂治疗在受辐照的大脑中具有未知目标。

更重要的是，当经历成熟的成年DG细胞暂时减少时，这被证明对学习和记忆有害[ 74 ]，因为这个成熟阶段（4-8周）在这些功能中起着至关重要的作用[ 75 ]。在此，我们表明，当锂停止治疗后第4周锂对神经发生的增殖作用结束时，与Irr组相比，IrrLi组逆转的第一天，MWM中的记忆保持能力得到改善。我们表明，DG细胞的成熟阶段对于学习和记忆似乎至关重要，并且辐射对成年DG细胞的长期功能作用是通过中断锂处理获得的，如图5f所示。 。ShamLi组为何表现不佳，与Irr组相似，还有待确定。一种可能的解释是，尽管ShamLi组的BrdU +细胞存活率提高，但这些细胞的成熟度可能受损。我们确实发现，锂处理本身减少了ShamLi中的树枝状分支（交叉数），但没有减少IrrLi组中的树枝状分支。虽然分子参数这里考察不指向这样的障碍，我们推测在类似的研究[报道，异常神经发生可能导致这些赤字76，77，78]。必须对其功能进行更深入的分析。另一方面，令人震惊的是锂治疗如何挽救神经发生和认知，这表明受伤的大脑因此对锂的反应要比完整的具有不受挑战的微环境的大脑更敏感。

双相情感障碍患者停用锂可能会减弱再治疗后的治疗反应[ 79 ]，但是建议在倾向于产生副作用的患者中停用锂[ 80 ]。尽管反复停药和再处理锂可以减少副作用，但仍有证据表明可以维持抢救的认知。总之，锂有可能成为儿童癌症幸存者中认知迟发效应的首个药物治疗方法。最佳剂量方案尚待确定，但我们假设间歇性锂治疗将奏效。

动物和道德许可

C57BL/6 female mice were obtained from Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germany). Pups were delivered with their respective dams and were separated at weaning (PND21). Mice were kept under standard temperature, humidity, and daylight conditions (12-h light:dark cycle) and were provided with food and water ad libitum. All experiments were conducted in accordance with the national and European laws for the use of animals in research (EU Directive 2010/63/EU) and were approved by the local ethical committee (Ethics Committee on Animal Research, Stockholm North). The ethical identification numbers were: N9–12, N248–13 and N163–15 for the in vivo study, and N284–11 and N190114 for the in vitro study.

Irradiation procedure

在整个过程中，先用4％的异氟烷麻醉小鼠，然后再诱导1.5–2％。将小鼠以俯卧姿势（头到龙门架）放置在定制的聚苯乙烯泡沫塑料框架上，并将框架放置在内部为体内进行体内设置的X射线系统（Precision X-RAD 320，North Branford，美国）内能量为320KV，12.5 mA，剂量率为0.75 Gy / min的靶向放射治疗研究。整个大脑被2×2 cm的辐射场照射。在出生后第21天（PND），将4 Gy的单剂量给药至每只动物。源到皮肤的距离约为50 cm。假手术的小鼠被麻醉，但不进行照射。

锂体内给药

雌性同窝（4-6动物在每个笼）被随机分配到锂食物（2.4克/千克栗2共3，0.24％，TD.05357碳酸锂饮食2018，哈兰实验室，荷兰）或对照食物饮食（T. 2918.CS，Harlan实验室，荷兰Venray）。该方案已在我们先前的研究中确定[ 81 ]，足以在小鼠中产生0.7-0.9 mM的锂血清浓度，相当于人类常用的0.6-1.2 mM的治疗范围。从PND 49到PND 77维持锂食物4周（图   1a体内研究设计）。

免疫组织化学

从PND 72开始，将动物腹膜内注射50 mg / kg BrdU（5-Bromo-2'-Deoxyuridine）（B5002，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA），持续5天。处死动物以进行三点分析不同的时间点，每个时间点间隔2周：PND 77，PND 91和PND 105。

如先前所述进行免疫组织化学和定量[ 81]。使用了以下一级抗体：大鼠抗BrdU（1：500，英国基德灵顿AbD Serotec）和山羊抗DCX（1：100，美国加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司）。使用了以下二级抗体：生物素化的驴抗山羊IgG（H + L）（Molecular Probes，Paisley，UK）和生物素化的驴抗大鼠IgG（H + L）（Jackson ImmunoResearch Europe，Suffolk，UK）。对于免疫荧光，使用了以下一级抗体：大鼠单克隆抗BrdU（1：500，AbD Serotec，英国基德灵顿），山羊抗DCX（1：200，Santa Cruz Biotechnology Inc.，达拉斯，美国），小鼠单克隆抗NeuN（神经核）（1：200，Merck Millipore，Billerica，EMD Millipore Corporation，Temecula，CA，美国）和兔多克隆抗S100β钙结合蛋白Abcam，英国剑桥）。使用了以下二级抗体：Alexa Fluor® 555驴抗小鼠IgG（H + L），Alexa氟® 488驴抗大鼠IgG（H + L）（Invitrogen公司，生命技术，卡尔斯巴德，CA，USA），Alexa氟® 555驴抗山羊IgG（ H + L）（Biotium公司，海沃德，CA，USA），和Alexa Fluor ® 633驴抗兔IgG（H + L）（Biotium公司，海沃德，CA，USA）。切片固定在的ProLong ® Gold抗淬灭试剂与DAPI（＃8961，Cell Signaling Technology公司生产，Danvers，MA，USA）。对于DCX +细胞分析和密度测量，使用荧光显微镜，并使用无偏计数软件（Stereo Investigator，MicroBrightField Inc .；美国佛蒙特州科尔切斯特）估算细胞总数和轮廓区域。其他荧光分析使用共聚焦显微镜进行，如先前报道的（van Praag，Kempermann和Gage 1999）（Axio Observer-Z1，带有ZEN lite软件，Carl Zeiss AG，Oberkochen，德国）。仅计数具有完整的，清晰可见的细胞体的细胞。

树突重构和形态分析

使用共聚焦显微镜通过使用20X物镜（X20 / 0.8复消色差透镜，Carl Zeiss）（1024×1024像素）以1 µm的间隔采集图像，在PND 77和PND 91上对树突状树突进行成像。在所捕获的图像的整个树突和每个神经元的细胞体，使用Neurolucida手动追踪®软件（MBF Bioscience公司，威利斯顿，VT，USA）。进行重建的神经元的三维分析和使用资源管理器Neurolucida测量的总长度树枝状，树枝状的复杂性和细胞体区域®软件（MBF Bioscience）。将一个分支顺序分配给每个枝晶，然后计算枝晶复杂度如下：树突的复杂度= [末端总和+末端数目]×[总树突长度/初级树突数目]（Pillai et al。2012）。在每组中随机盲目选择三只动物（1:12系列）进行DCX染色后进行此分析。对研究动物不知情的研究人员随机选择每只动物15-20个细胞。为了测量在不同距离处远离体的树状乔木的程度，Sholl分析（Sholl 1953）通过对一系列以10 µm间隔排列的同心球的树状交叉点的数量进行了计算。同心球的中心位于躯体的质心处。选择满足以下标准的未成熟神经元进行分析；（i）全标签的DCX+有丝分裂后阶段的细胞[ 63 ]，（ii）将神经元与相邻的DCX阳性神经元相对分离，以避免干扰分析；（iii）位于SGZ或位于颗粒状细胞内部三分之一内的体细胞齿状回的上叶片，以比较处于未成熟阶段的神经元。截短的细胞从分析中排除。为确保公正性，同一研究人员盲目进行了形态分析。

蛋白质定量

如先前所述，对海马组织进行蛋白质定量处理[ 82]。Wes毛细管电泳系统（Protein Simple-Bio Techne，加利福尼亚州圣何塞）用于所有蛋白质定量。解冻样品等分试样，并根据制造商的说明，使用0.1x样品缓冲液和5x预混液（400 mM DTT和10x样品缓冲液的1：1混合物）将所有目标样品解冻并稀释至0.2μg/μl。样品在95°C下变性5分钟。分别以1：200和1：2000的浓度使用Rabbitα-GAD65（PA5-22260，美国Thermo Fisher Scientific）和Rabbitα-Tppp（ab92305，美国Abcam）。兔α-Vinculin以1：200,000的浓度用作家政对照。试剂盒中提供了α-兔二抗，并根据制造商的说明使用。为了进行蛋白质定量，将总化学发光峰面积相对于管家对照的相应参考毛细管进行标准化。曲线下的归一化峰面积用于蛋白质定量。

胚胎远脑NSPC培养和LiCl暴露程序

如先前所述[建立NSPCs的原代培养物83，84 ]。细胞是 从定时怀孕的Sprague Dawley大鼠（Harlan Laboratories，Harlan，荷兰）的HBSS（Life Technologies，Carlsbad，CA，美国）中解剖的胚胎末梢脑（n = 10–12 /细胞制备）获得的，（道德许可：N284） / 11和N190114）在E15.5（交配插头的日期定义为E0）。机械破坏组织，并使脑膜和较大的细胞团沉降10分钟。将细胞以40,000 / cm 2的密度铺板在预先涂有聚-1-鸟氨酸和纤连蛋白的碟子上（均购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich；美国斯德哥尔摩）。每24小时将细胞保存在含有10 ng / ml碱性成纤维细胞生长因子（R＆D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）的富集N-2培养基中，每隔一天更换培养基以使细胞保持未分化和增殖状态。通过刮取HBSS使细胞每5天传代一次。此后，将细胞在N-2培养基中轻轻混合并以1：4密度铺板。为了研究LiCl（美国圣路易斯的Sigma-Aldrich）的影响，如之前所述[ 41 ] ，我们在照射LiCl（3 mM）前12小时暴露了第3代（P3）NSPC 。光子60使用Co辐射源以设定的80cm的距离和2.5Gy的吸收剂量使NSPC暴露。辐射后24小时收获P3细胞用于基因表达分析（图   3a，体外研究设计）。

RNA，cDNA和RT-qPCR

对于实时qPCR，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取培养的NSPC的总RNA，并保存在-80°C下直至进一步使用。使用Qubit（Thermo Fisher Scientific）测量提取的RNA的完整性和浓度。使用高容量cDNA反转录试剂盒（Thermo Fisher），根据制造商的规程，从提取的RNA中合成cDNA。实时定量PCR使用Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG（Thermo Fisher Scientific）和位点特异性引物进行。将表达水平相对于管家基因，TATA-box结合蛋白水平标准化。

RNA测序

使用具有96个双重指标的Illumina TruSeq链式mRNA样品制备试剂盒（Illumina，CA，USA）制备用于测序的RNA文库，每种条件分别为四个生物学样品（Sham，ShamLi，Irr，IrrLi），总共16个样品。使用利用纯化步骤的Agilent NGS工作站（安捷伦，CA，USA），为[先前描述的方案进行自动85，86]。用2100 Bioanalyzer（安捷伦）检查质量控制，所有16个样品的RIN值为8或更高。使用HiSeq SBS Kit v4化学试剂盒，在HiSeq 2500（HiSeq控制软件2.2.58 / RTA 1.18.64）上以2×126设置对文库测序，平均深度为32.3 M读数（30.4–34.5）。对数据的简要处理如下：对原始测序读数进行FastQC / 0.11.5质量检查，使用Star / 2.5.1b将读数与参考基因组大鼠褐家鼠基因组Rnor_6.0和QualiMap / 2.2进行比对。评估此路线的质量。使用默认参数，使用featureCounts（subread / 1.5.1）对外显子区域中的阅读片段重叠进行计数，即，不对与一个以上特征重叠的片段和多重映射阅读进行计数。

差异表达分析是使用EdgeR / 3.16.5软件包在R / 3.3.3下进行的。通过将至少两个样本中的百万分之一的读数保持在至少1个读数中来过滤低计数读数。通过使用每对样本之间的M值修整平均值，通过找到一组最小化大多数基因样本之间对数倍变化的文库大小比例因子，来对RNA组成的计数进行标准化。基于实验设计定义设计矩阵，拟合基因智能glms模型，并为选择的组比较运行似然比测试。RNA序列数据已以登录号E-MTAB-7238 的形式存储在EMBL-EBI（www.ebi.ac.uk/arrayexpress）的ArrayExpress数据库中。

定量PCR

根据制造商的说明，使用MagMeDIP试剂盒（Diagenode）进行MeDIP-qPCR。简而言之，将大鼠NSPCs细胞裂解，并使用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（Sigma-Aldrich）提取DNA，使用Purelink Genomic DNA试剂盒（Invitrogen，现在的Thermo Fisher）纯化，然后使用Bioruptur（按照MagMeDIP试剂盒设置，用抗5'-甲基胞嘧啶抗体（Diagenode）进行免疫沉淀。使用Qubit dsDNA HS分析试剂盒（Thermo Fisher）测量DNA浓度。如上所述，使用RT-qPCR对免疫沉淀的DNA进行定量，所用温度曲线为：95°C持续7分钟，95°C持续15 s的40个循环，以及60°C持续1分钟，然后是1分钟95 ℃。Tppp， 3）。甲基DNA免疫沉淀的效率使用以下公式表示为相对于输入DNA的百分比：

行为评估

 行为研究使用了三组不同的小鼠（n = 15-16 /组）。从使用的每个垫料中，将动物随机分配给所有四个实验组。将动物分组饲养（n = 3–4只小鼠/笼），每个笼中都包含来自不同实验组的动物。所有的动物都很幼稚。为了降低压力，但在低照度（100-150 Lux）下进行的测试在10.00和16.00之间进行，强度足以提供适当的环境提示可见性。在测试的那天，将动物带入他们的笼子里带到测试室，并在实验开始前让它们休息和适应至少1小时。在测试的最后一天根据阴道涂片确定发情期，以避免对动物造成额外的压力。我们验证了所有动物组都显示了动情周期的所有阶段，它们的相对频率没有任何明显的差异（数据未显示）。

莫里斯水迷宫

如先前轻微的修改[所述进行MWM 87，88，89，90]。在MWM的参考和逆转记忆版本中对小鼠进行了训练，以在圆形水池（直径120厘米）中找到隐藏的逃生平台（10厘米×10厘米）。将该池放置在温度和湿度稳定的房间中。该平台被淹没在水面下1厘米处，其位置相对于迷宫3D视觉提示（O'Hara＆Co. ltd，东京，日本）是固定的。用无毒的白色染料（MWM的不透明剂，目录号OP301，法国西夫列克斯市的Viewpoint）使水不透明，并保持在22±1°C的温度下。在第一天，进行了提示版本的MWM，在此期间，每只鼠标都接受了四次试验，以信用卡大小的塑料“标志”为指导定位平台。连续6天发布了MWM的参考版本。 5a）。每节（一天）包括四项试验，每15分钟间隔一次，每次试验的最长持续时间为60秒。在每个试验中，起始位置都是按照伪随机顺序进行的，并且每天在池的所有四个象限中都包含入口点。当动物找到平台时或60秒后，每个试验都结束了，在这种情况下，实验者将动物引导到平台上。在任何一种情况下，它都会在平台上停留20 s，然后返回其家笼。在第8天，连续3天发布了MWM的反向版本。将平台移至与参考记忆训练所用的象限相反的象限180°，然后动物每天以伪随机顺序从四个不同的入口点再次进入水迷宫。使用Noldus Ethovision软件（Ethovision XT 14.0，Noldus Information Technologies，Wageningen，荷兰）记录并分析了动物的行为。对于每项试验，对于每只小鼠，都确定了潜伏期（爬到平台上的时间（以秒为单位））和游动距离（爬升到平台上的总距离（以cm为单位）），并计算了每天的平均值。对于反向学习的第一个试验，我们计算了平台在学习阶段在象限中所花费的时间百分比，以及在平台“先前位置”上的交叉次数。为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍是由于运动活动不足引起的可能性，计算游泳速度（cm / sec）。荷兰瓦赫宁根）。对于每项试验，对于每只小鼠，都确定了潜伏期（爬到平台上的时间（以秒为单位））和游动距离（爬升到平台上的总距离（以cm为单位）），并计算了每天的平均值。对于反向学习的第一个试验，我们计算了平台在学习阶段在象限中所花费的时间百分比，以及在平台“先前位置”上的交叉次数。为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍是由于运动活动不足引起的可能性，计算游泳速度（cm / sec）。荷兰瓦赫宁根）。对于每项试验，对于每只小鼠，都确定了潜伏期（爬到平台上的时间（以秒为单位））和游动距离（爬升到平台上的总距离（以cm为单位）），并计算了每天的平均值。对于反向学习的第一个试验，我们计算了平台在学习阶段在象限中所花费的时间百分比，以及在平台“先前位置”上的交叉次数。为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍是由于运动活动不足引起的可能性，计算游泳速度（cm / sec）。确定潜伏期（爬到平台上的时间（以秒为单位））和游动距离（爬上平台的总距离（以厘米为单位）），并计算每天的平均值。对于反向学习的第一个试验，我们计算了平台在学习阶段在象限中所花费的时间百分比，以及在平台“先前位置”上的交叉次数。为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍是由于运动活动不足引起的可能性，计算游泳速度（cm / sec）。确定潜伏期（爬到平台上的时间（以秒为单位））和游动距离（爬上平台的总距离（以厘米为单位）），并计算每天的平均值。对于反向学习的第一个试验，我们计算了平台在学习阶段在象限中所花费的时间百分比，以及在平台“先前位置”上的交叉次数。为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍是由于运动活动不足引起的可能性，计算游泳速度（cm / sec）。

统计分析

在免疫组织化学，蛋白质定量，和基因表达分析的统计学差异使用两因素ANOVA分析，随后是使用GraphPad Prism进行多重比较校正进行Bonferroni事后检验计算®（美国加利福尼亚州拉霍亚）。对于甲基化分析，使用Kruskal–Wallis检验进行多次比较，然后进行Dunn的多次比较测试。对于树突分析，使用R版本3.3.3（R统计学计算基金会，维也纳，奥地利），对每只动物使用具有随机截距的线性混合模型来解释个体内部的依赖性。由于数据不是正态分布的，因此使用自然对数转换来满足正态性要求。为确保正态分布，使用SPSS（IBM SPSS Statistics，版本21.0，美国伊利诺伊州芝加哥）将变量绘制为Q-Q图。对于Sholl分析，使用GraphPad Prism（版本7.03，GraphPad Software，La Jolla，CA，美国）进行双向ANOVA，然后进行事后Bonferroni测试。所有定量均以盲法进行。行为分析是使用SPSS v.24软件（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国），由对动物的群体身份不了解的调查员进行的。使用广义估计方程模型评估了对群体的等待时间和到达平台的距离以及在MWM中学习和逆向学习期间的速度的任何影响。将动物ID用作对象变量，将天用作对象内变量，将组，天和组×天用作预测因子，将组（垃圾）用作构建嵌套的预测因子。任何小组都会影响在提示学习过程中移动的等待时间和距离，以及在学习过程中平台所处象限中所花费的时间百分比，以及在第一次反向学习过程中越过平台旧位置的次数，使用广义线性模型进行评估，将组作为预测因子，将组（垃圾）作为构建嵌套预测因子。对于具有统计学意义的影响，使用Bonferroni事后检验来确定特定的组差异。在所有分析中，数据代表平均值±SEM。重要性级别设置为p  ＜0.05。