Hippo途径在细胞增殖和凋亡中起着至关重要的作用，并可以调节干细胞的维持和胚胎发育。MOB激酶激活剂1A和1B（Mob1a / b）是Hippo途径的关键组成部分，其在小鼠中的纯合缺失会在植入前阶段导致早期的胚胎致死率。为了研究Mob1a / b在干细胞维持和分化中的作用，生成并鉴定了可以有条件地消耗Mob1a / b的胚胎干细胞（ESC）克隆。尽管Mob1a / b耗竭不会影响小鼠ESC的干性或增殖，但是这种耗竭会导致分化为三个胚层的缺陷。Yap组合式挽救了Mob1a / b耗尽引起的体内和体外分化缺陷，提示由Mob1a / b耗尽引起的分化缺陷是Yap依赖性的。在畸胎瘤实验中，Mob1a / b缺失的ESC中的Yap敲低可部分恢复分化缺陷，这表明河马途径另一种效应子Taz的过度活化抑制了向三个胚层的分化。综上所述，这些结果表明Mob1a / b或Hippo信号传导在小鼠ESC分化为三个胚层的过程中起着至关重要的作用，这取决于Yap。Hippo途径与干细胞分化之间的紧密联系支持了其作为再生医学治疗靶点的潜力。河马途径的另一种效应物抑制了向三个胚层的分化。综上所述，这些结果表明Mob1a / b或Hippo信号传导在小鼠ESC分化为三个胚层的过程中起着至关重要的作用，这取决于Yap。Hippo途径与干细胞分化之间的紧密联系支持了其作为再生医学治疗靶点的潜力。河马途径的另一种效应物抑制了向三个胚层的分化。综上所述，这些结果表明Mob1a / b或Hippo信号传导在小鼠ESC分化为三个胚层的过程中起着至关重要的作用，这取决于Yap。Hippo途径与干细胞分化之间的紧密联系支持了其作为再生医学治疗靶点的潜力。

胚胎干细胞（ESC）源自胚泡期胚胎1的多能内部细胞团（ICM）细胞。由于ESC具有自我更新的能力，并且可以分化为动物体内的每种细胞类型，因此多能干细胞的特性引起了人们极大的兴趣，因为它们被用作人类疾病发展和再生过程中缺陷的潜在疗法。最近，研究人员发现，多能干细胞和祖细胞可以聚集并生成称为类器官的组织结构，类似于体内的主要组织2。尽管当前的类器官培养系统不包括内皮细胞或基质细胞，但体外类器官模型可以为基础研究和临床应用提供有用的工具2。

转录因子和染色质调节剂对于保持ESC 3的多能性很重要。胚胎干细胞的多能状态在很大程度上依赖于核心转录因子OCT4，SOX2和Nanog 4，5，6，7。通过表达一组转录因子，例如Oct4，Sox2，Klf4和Myc 8，也可以将分化的成年细胞重编程为诱导性多能干细胞。这些核心转录因子激活维持ESC特性和ESC多能状态所需的基因表达。它们还有助于基因的阻遏编码细胞谱系特异性调节器9，10，11。对于干性维持许多额外的监管机构已经通过基因和蛋白质组筛查发现12，13。

在哺乳动物中，Yes相关蛋白1（Yap）和含WW域的转录调节蛋白1（Taz）通过激活Hippo途径14的核心成分而受到负调控。这些河马核心组件在早期胚胎发育过程中至关重要。Yap -/-：Taz -/-小鼠胚胎在16细胞桑虫阶段之前显示出胚胎致死性，并且缺乏TE谱系规范15。NF2，AMOT，或LATS1 / 2的耗尽导致未能开发ICM衍生谱系16，17，18。河马途径也已经成为ESC干度的关键调节剂。Yap-Tead2复合体可以上调Oct4和Nanog在小鼠胚胎干细胞中的表达19。此外，Yap的过表达会阻止ESC的分化，而Yap的敲低会导致ESC多能性的丧失20。Taz也是Smad2 / 3/4易位进入细胞核以维持TGFβ信号传导和人类ESC 21的全能状态所必需的。因此，Hippo信号传导途径直接通过核心转录因子（例如Oct4）的控制或通过介导ESC中的其他信号传导途径（例如SMAD途径）间接维持多能性和确定细胞命运规格。另外，据报道，提高Yap活性可促进许多器官和组织中的茎干并抑制其分化。如图22所示，表明河马途径可能是损伤后器官再生和修复的潜在靶标。

MOB1是有丝分裂的在酵母中的调节器23，24，25，26。dMob1基因的删除触发果蝇中的肿瘤发展，其中dMob1充当抑癌剂27。在人类中，MOB1A和MOB1B涉及细胞增殖，细胞谱系规范，和有丝分裂退出28，29，30，31。MOB1A / B还可以激活NDR / LATS1激酶32，33，是河马通路与MST1 / 2，LATS1 / 2，并且沿着SAV1的核心部件14。MOB1A / B由MST1的磷酸化/需要MOB1A / B与NDR的相互作用2激酶/ LATS激酶34，35，36。MOB1A / B与LATS1 / 2激酶的结合可完全激活LAST1 / 2活性，进而使YAP和TAZ磷酸化，从而抑制其活性37。因此，Mob1a / b是Hippo通路的基本核心组成部分，可防止不分皂白的Yap / Taz过度活跃。

在这项研究中，我们生成并表征了一个小鼠ESC克隆，其中可以有条件地耗尽Mob1a / b，以研究ESCs的干性或分化能力是否受Mob1a / b调节。我们发现Mob1a / b可以控制小鼠胚胎干细胞分化为三个细菌层，这取决于Yap。

Mob1a和Mob1b基因敲除小鼠的一代

使用先前报道的步骤38，从BAC克隆（分别为bMQ-423L2和240C9）中检索到包含鼠Mob1a和Mob1b基因外显子的15 kb DNA片段，并将其导入pBluescript噬菌粒系统。补充图1中描述了靶向ES细胞克隆的生成以及Mob1a puro和Mob1b puro等位基因的种系传递。Mob1a flox和Mob1b flx等位基因的靶向策略如先前所述39和补充图2中所述进行。所有小鼠品系与C57BL / 6J回交六代以上。该研究由美国国家癌症中心研究所的机构动物护理和使用委员会审查和批准。

为了产生ESC系，使用M2培养基（Sigma-Aldrich）从妊娠雌性小鼠的子宫中收获胚泡期的胚胎。将单个胚胎转移到丝裂霉素C（Sigma-Aldrich）处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养器中，并在ESC培养基中培养，该培养基由高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基（大韩民国Welgene）组成，血清置换率为15％（ Gibco），2 mM L-谷氨酰胺（Gibco），1％非必需氨基酸溶液（Gibco），0.1％β-巯基乙醇（Gibco），5％青霉素-链霉素（Gibco）和0.01％重组小鼠LIF蛋白（Chemicon）。7天后，将细胞与添加了3μMCHIR99021（Sigma-Aldrich）和1μMPD035901（Selleckchem）的培养基孵育1或2周。如补充图2中所述，在PCR之后鉴定每个克隆的基因型。

mESCs的培养和分化

如前所述，将未分化的小鼠ES细胞常规地维持在用丝裂霉素C处理的初级MEF进料器包被的组织培养板上，在ESC培养基中，在37℃，在含有5％CO 2的湿润气氛中，如前所述。为了消耗Mob1a / b，将Mob1a f / f：Mob1b f / f：CAGGCre-ER TM小鼠胚胎干细胞用在乙醇中稀释的0.5 µM 4-羟基他莫昔芬（Sigma-Aldrich）处理至少3天。

对于分化实验，通过在组织培养板上孵育30分钟来耗尽饲养器，然后轻轻搅拌以纯化ESC。使用悬滴法产生胚状体（EBs）。在分化培养基中的组织培养皿盖上孵育细胞（每35 µl 5×10 2个细胞）。将EB悬浮培养4天（以悬滴法放置2天，在细菌级培养皿中放置2天），并在第5天将EB接种在涂有0.1％明胶的组织培养板上以附着并铺展2天。

免疫印迹分析

用含有Xpert蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂（GenDepot）的RIPA缓冲液（GenDepot）裂解收获的ESC。用蛋白质测定染料试剂（Bio-Rad）定量每种裂解物中的蛋白质浓度。在8–13％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分馏出15微克的裂解液，并在硝酸纤维素膜（Bio-Rad）上进行电印迹。在摇床上将印迹与基于0.05％Tween-20 / TBS（TBST）的第一抗体溶液在4°C下孵育过夜，并在室温下与相应的辣根过氧化物酶偶联的第二抗体（GenDepot）在室温下孵育40分钟。化学发光检测采用标准方案进行。抗体在补充表1中列出。

组织学和免疫组化

分离畸胎瘤，并用新鲜的4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水（PBS）固定在4°C过夜，然后包埋在石蜡中。使用切片机制备五微米的石蜡切片，并用苏木精和曙红染色。对于免疫组织化学染色，将切片去石蜡并使用标准方案重新水化。通过在微波炉中煮沸10分钟，在溶液（10 mM柠檬酸三钠，pH 6.0 / 0.05％Tween-20）中进行抗原修复。将组织切片与封闭溶液（10％山羊血清，1％牛血清白蛋白/ Tris缓冲盐水（BSA / TBS））在室温下孵育1小时，并在4°C下与抗Taz抗体（Sigma-Aldrich）反应C过夜，并将相应的生物素化的二抗在室温下在1％BSA / TBS中以1∶500稀释1小时。将载玻片在TBS中的0.3％过氧化氢中孵育15分钟，以封闭内源性过氧化物酶。然后根据提供的规程，使用ABC抗生物素蛋白-生物素-DAB检测试剂盒（Vector Labs，伯林格姆，CA，美国）进行染色的检测和可视化。最后，将玻片用苏木精复染并脱水以盖玻片固定。使用Observer.Z1或Imager.M1（Zeiss）获得图像。

RNA分离，互补DNA合成和半定量/定量PCR

使用试剂（Life Technologies）从细胞中分离总RNA，并通过氯仿和乙醇沉淀进行相分离。将RNA沉淀溶解在焦碳酸二乙酯水中（500 ng / µl）。使用qPCR RT Master Mix（Toyobo）对总RNA进行反转录。使用EmeraldAmp GT PCR Master Mix（Takara）进行带逆转录的半定量PCR（semi-RT-qPCR）。在480 Real-Time PCR System（Roche）40上，使用Premix Ex Taq TM II（Takara）对每个样品进行一式三份的RT-qPCR 。寡核苷酸的序列在补充表2中列出。对于PCR引物Mob1a / B等位基因被设计来识别染色体区域删除由Cre- loxP位介导的重组。

碱性磷酸酶染色

将细胞在-20°C的甲醇中固定10分钟，并根据制造商的说明使用碱性磷酸酶试剂盒（Vector）进行染色。

细胞周期分析

将细胞在4°C的70％乙醇（EtOH）中固定过夜，并用PBS洗涤，然后在0.5 mg / ml RNase A溶液（Sigma-Aldrich）中于37°C孵育10分钟。然后将细胞用50μg/ ml碘化丙锭（Sigma-Aldrich）染色30分钟41。细胞周期分布通过BD FACSCalibur TM（BD Biosciences）评估。

慢病毒感染

为了产生Yap-knockdown细胞，用包含靶向Yap的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒感染小鼠ESC。慢病毒包装质粒pLP1，pLP2和pLP / VSVG和pLKO.1-乙lastic啶或pLKO.1-嘌呤霉素构建体使用JetPEI（Polyplus转染）共转染到293FT细胞中。转染后48小时，在病毒上清液中添加10 µg / ml聚乙烯，通过0.45 µm过滤器过滤，并用于感染小鼠ESC。第二天，用新鲜的ESC培养基更换培养基，感染后48小时，用20 µg / ml杀稻瘟素和2 µg / ml嘌呤霉素（Sigma-Aldrich）选择细胞。敲低实验中使用的靶序列如下。shYap，5'-TGA GAA CAA TGA CAA CCA ATA-3'；shTaz＃1，5'-GAT GAA TCC GTC CTC GGT G-3'；shTaz＃2，5'-CAG CCG AAT CTC GCA ATG AAT-3'；shTaz＃3，5′-CCT GCA TTT CTG TGG CAG ATA-3′；shLats1＃1，5'-GCC CAA CAG GAA CAG TCA TAA-3'；shLats1＃2，5'-GCA ACA TTC AAT TAA CCG AAA-3'；shLats1＃3，5′-CCT ATT CAA CAG CCC GTG AAA-3′；shLats2＃1，5'-CTC TCA GGG AAA TCC GAT ATT-3'；shLats2＃2，5′-CGC AAG AAT AGC AGA GAT GAA-3′；shLats2＃3，5'-CGC CTT CTA TGA GTT CAC CTT-3'。

畸胎瘤形成试验

对于畸胎瘤形成测定，将悬浮于50μlPBS中的小鼠ESC（1.5×10 6个细胞）与50μlMatrigel（Corning）混合，然后皮下注射到BALB / c裸鼠（Orient Bio，韩国）中。在注射后6周，通过与周围组织的解剖来恢复畸胎瘤。将肿瘤固定在4％多聚甲醛中并包埋在石蜡中。使用切片机制备五微米的组织切片，并用苏木精和曙红染色。

统计分析

使用GraphPad Prism 5软件进行统计分析（不配对的两尾学生t检验）。对于所有带有误差线的实验，数据均以平均值±SEM表示。的值p  <0.05被认为是显著; * p  <  0.05，** p  <0.01和*** p  <0.001。

Mob1a / b的消耗导致小鼠早期胚胎致死

为了探索Mob1a / b在胚胎发育中的生理功能，我们通过在小鼠胚胎干细胞中靶向基因来产生条件敲除的Mob1a和Mob1b等位基因。在基因靶向策略，外显子2 Mob1a等位基因和外显子的3 Mob1b等位基因由两个分别侧翼的loxP序列，其被识别并通过Cre重组酶除去。因此，仅正确转录了Mob1a的651个核苷酸中的前75个和Mob1b的651个核苷酸中的216个。这些异常信使RNA转录本包含过早的终止密码子，并被无意义的介导的衰变途径降解（补充图2）。）。由于单纯合突变体（Mob1a -/-：Mob1b + / +或Mob1a + / +：Mob1b-/-）是可行的，直到出生后18个月以上才显示任何异常，因此我们生成了双纯合突变体（Mob1a -/-：Mob1b -/-）。来自杂合子交配的双纯合突变体不可行，并且在E8.5之前表现出胚胎致死性（表1a，b）。这些结果表明Mob1a和Mob1b具有相互冗余性，并且这两种蛋白质之一是小鼠早期胚胎发生所必需的。

Mob1a / b的耗竭对维持干细胞/多能性或小鼠ESC的增殖几乎没有影响

为了研究Mob1a / b基因缺失下胚胎发生的失败是否是由于干细胞丧失或干细胞异常分化引起的，我们生成了Mob1a f / f：Mob1b f / f：CAGGCre-ERTM小鼠ESC，其中Mob1a / b基因可以通过4-hydroxytamoxifen（4-OHT）处理删除，并评估Mob1a / b耗竭对多能性和分化标志物的影响。4-OHT处理3天后，Mob1a / b蛋白几乎耗尽了（图1a）。Mob1a / b的消耗导致Yap-S112磷酸化的减少和Taz蛋白水平的上调（图1a和补充图3）），这证实Mob1a / b在小鼠ESC中可调控Lats1 / 2激酶活性，Yap磷酸化和Taz蛋白表达。Mob1a / b缺失的ESC中多能性相关标记Oct4和Nanog的水平与对照相似（图1b）。Mob1a / b耗尽后，分化相关标记（Gata6，Gata4，Sox17，Eomes，T-brachyury，Nestin和Fgf5）的表达水平也保持不变（图1c）。

在4-OHT处理后指定时间采集的Mob1a f /-：Mob1b f / f：CAGGCre-ER TM小鼠ESC 裂解物中的Mob1a / b和p-Yap（S112）的免疫印迹分析。Gapdh用作加载控件。b在4-OHT处理后指定时间采集的Mob1a f /-：Mob1b f / f：CAGGCre-ER TMmESCs 裂解物中的Mob1a / b，Oct4，Nanog和Yap的免疫印迹分析。GAPDH用作加载控件。c Mob1a的半定量PCR ，多能性标记（Oct4，Sox2和Nanog），以及Mob1a f /-：Mob1b f / f：CAGGCre-ER TM ESCs中的分化标记（Gata6，Gata4，Sox17，Eomes，T-brachyury，Nestin和Fgf5）。d在4-OHT处理后的第七天，Mob1a f /-：Mob1b f / f：CAGGCre-ER TM ESC 的碱性磷酸酶染色的代表性图像。比例尺，200μm。Mob1a的e细胞周期分析f /-：Mob1b f / f：4-OHT治疗后第七天的CAGGCre-ER TM小鼠胚胎干细胞

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接下来，我们研究了Mob1a / b耗竭是否会影响小鼠ESC的体外维持。将耗尽Mob1a / b的ESC维持1周，然后观察ES细胞的形态并使用碱性磷酸酶染色可视化多能性。与标记分析一致（图1b），耗尽Mob1a / b的ESC的细胞形态和碱性磷酸酶活性与对照相似（图1d）。Mob1a / b耗竭也不影响细胞周期进程（图1e）。这些结果表明Mob1a / b耗竭不会影响小鼠ESC的干性/多能性或增殖的维持。

Mob1a / b是将小鼠ESC分化为三个细菌层所必需的

由于Mob1a / b基因缺失对小鼠ESC的干性和增殖的维持几乎没有影响，因此我们研究了Mob1a / b耗竭是否影响小鼠ESC的分化。EB形成通常用作启动ESC自发分化为三个胚层的工具。EB的附连到组织培养皿后的生长表示内胚层谱系细胞的扩增42，43。在此实验中，我们使用悬滴法生成了EB，然后进行了EB迁移分析。将EB接种在涂有0.1％明胶的组织培养皿上后，与对照相比，Mob1a / b耗尽的EB的生长和迁移显着减少，这表明Mob1a / b耗尽的ESC在分化为内胚层方面存在缺陷。血统（图2a）。

一个 EB形成示意图和组织培养皿上天7 EB生长的代表性图像和8后EB形成。虚线表示EB增长。比例尺，400μm的b，c ^定量PCR Mob1a / B和多能性标记（的Oct4，Sox2的，和Nanog的在mESCs和EBS）。ES（-），未经4-OHT处理的ESC；ES（+），经4-OHT处理的ESC；EB（-），未经4-OHT处理的EB；EB（+），经4-OHT处理的EB。数据表示为平均值±SEM。*** P  <0.001

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为了进一步表征耗尽Mob1a / b的EB，我们对多能性标记Oct4，Sox2和Nanog进行了RT-qPCR 。虽然分化条件下对照EB 中Oct4，Sox2和Nanog的表达水平分别显着降低了39.5％，56.7％和69.1％，但在Mob1a / b耗尽的EB中它们没有变化（图2b） ，c）。我们还使用RT-qPCR对三个胚层的标记物研究了Mob1a / b缺陷型EB的分化状态。内胚层谱系标记（Gata6，Gata4，Sox17，FoxA1，和Pdgfra）在对照组中EB形成的第4天和第6天增加了10到20倍。相反，这些标记的表达在Mob1a / b耗尽的EBs中没有增加（图3a，b）。中胚层谱系标记（的表达水平HAND1，T-的brachyury，TWIST2，MESP1和MIXL1）增加40至120倍于天4和EB形成在控制6，但Mob1a的分化过程中没有诱导/ b耗尽的ESC（图3a，c）。此外，外胚层标记（Fgf5，Otx2和Pax6与对照相比，在Mob1a / b耗尽的EB中，诱导分化的程度较小（图3a，d）。在使用Lats1 / 2-knockdown ESCs进行的实验中，我们还观察到了向三个胚层分化的体外缺陷（补充图4）。这些结果表明，小鼠胚胎干细胞中Mob1a / b或Lats1 / 2耗竭会导致胚胎干细胞体外分化为早期三个胚层的缺陷。

小鼠ESC和EB中细菌层标记（内胚层：Gata6，Gata4，Sox17 ;中胚层：T-brachyury，MixL1，Mesp1，Hand1 ;外胚层：巢蛋白 ;滋养外胚层：Cdx2，Eomes）的定量PCR 。b – d EB形成不同阶段的细菌层标记的定量PCR。（b是内胚层；c是中胚层；d，外胚层）。ES，EB形成前的ESC；EB D2、2天培养后的EB（悬挂下降阶段）；培养4天后的EB D4，EB（在细菌级培养皿中）；EB D6，培养6天后的EB（在细胞和组织培养皿中）。数据表示为平均值±SEM。* P  <0.05，** P  <0.01，*** P  <0.001

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由Mob1a / b耗尽引起的分化缺陷取决于Yap

Mob1a / b是一种支架蛋白，可激活Lats1 / 2激酶，该酶通过核离位，胞质螯合和诱导蛋白酶体降解37来磷酸化和灭活Yap转录活性。我们研究了小鼠ESC分化后Yap蛋白和S112磷酸化的水平（补充图3）。Yap-S112的磷酸化随野生型ESC的EB形成而增加，表明Yap活性在小鼠ESC分化为三个胚层时受到抑制。Mob1a / b的耗尽导致Yap-S112磷酸化（即Yap过活化）减少，这表明Yab活性或其磷酸化受Mob1a / b调节。

因此，我们假设由Mob1a / b耗尽引起的ESC分化缺陷是由于Yap的过度活化引起的，这些缺陷可以通过Yap敲除得到挽救。为了研究这个假设，我们在Mob1a / b缺失的ESC中使用shRNA基因沉默敲低Yap表达（图4a），然后进行EB形成和迁移分析以评估这些小鼠ESC的分化能力。

一个免疫印迹分析为邑，Mob1a并/ b，和Oct4在裂解物从Mob1a F / F：Mob1b F / F：CAGGCre-ER TM胚胎干细胞后4-OHT和shYap治疗。GAPDH用作加载控件。b EB形成后八天，EB在组织培养皿上生长的代表图像。虚线表示EB增长。比例尺，100μm的Ç，ð定量PCR Mob1a / B，邑，和多能性标记（的Oct4，Sox2的，和Nanog的后EB形成天6）。ËEB形成不同阶段的细菌层标记（内胚层，Gata6，中胚层，T- 臂膜瘤，外胚层，Otx2）的定量PCR 。（-）未经4-OHT处理的shCon，shControl ESC; （+）shCon，4-OHT处理过的shControl ESC; （-）未经4-OHT处理的shYap ESC; （+）shYap，4-OHT处理的shYap ESC。数据表示为平均值±SEM。** P  <0.01，*** P  <0.001

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直到EB形成的第四天，Yap敲低对Mob1a / b缺失的小鼠ESC的形态几乎没有影响。在第6天，Yap敲除增加了Mob1a / b耗尽EB的生长（图4b）。这些数据表明，Yap敲低可以恢复由Mob1a / b耗尽引起的EB增长缺陷。接下来，我们在EB形成的第6天，使用RT-qPCR分析了经4-OHT，shYap或二者处理的ESC中的干细胞和胚层标记物（图4c）。在分化条件下，Yap敲低可降低消耗Mob1a / b的细胞中Oct4，Sox2和Nanog的表达水平，并增加三个胚层的标志物（图4d，e）。这些结果支持这样的假说，即Mob1a / b耗竭会导致Yaps依赖的ESC分化为三个胚层谱系的缺陷。

Mob1a / b是体内小鼠ESC分化所必需的

为了确定是否需要Mob1a / b来体内自发分化为三个细菌层的组织，而Yap依赖于 Mob1a / b ，我们进行了畸胎瘤形成试验。畸胎瘤是通常由多种细胞类型和源自一个以上细菌层的组织组成的肿瘤。由野生型ESC产生的畸胎瘤由内胚层，中胚层和外胚层组织组成。相比之下，由Mob1a / b缺失的ESC形成的畸胎瘤由未分化细胞组成的组织组成，这些组织没有三个胚层细胞的任何结构特征，这表明Mob1a / b是小鼠ESC分化所必需的进入体内的三个细菌层（图5a）。此外，Mob1a / b缺失的ESC中Yap的下调导致形成了由分化组织组成的畸胎瘤，该组织比野生型ESC生成的畸胎瘤小（图5b）。这些结果表明Yap和其他因素参与了Mob1a / b耗尽ESC分化为三个胚层的体内缺陷。

a，b来源于Mob1a f / f的畸胎瘤的苏木精和伊红染色图像：Mob1b f / f：CAGGCre-ER TM ESC。小鼠ESC注射后6周，通过解剖周围的组织来恢复畸胎瘤。比例尺，200μm。Ç在裂解物的免疫印迹分析为Yap和塔兹Mob1a F / F：Mob1b F / F：CAGGCre-ER TM胚胎干细胞shYap治疗后。Gapdh用作加载控件。d使用抗Taz抗体对畸胎瘤进行免疫组织化学染色的代表性图像。EC，表皮组织；ME，中胚层组织；EN，内胚层组织。比例尺200μm

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转录共激活因子塔兹是雅浦岛的密切相关的旁系同源物和具有在早期胚胎和心脏生长和再生与雅浦岛功能冗余15，44。它也分享转录目标与邑45，46。在Yap-knockdown ESC中，Taz被上调（图5c）。在使用野生型ESC的畸胎瘤形成试验中，我们发现Taz主要定位于未分化的细胞，该细胞未显示三个胚层的任何结构特征（图5d）。在Mob1a / b缺失的畸胎瘤中，大多数包含未分化细胞或部分分化细胞的组织中Taz广泛表达（图5d）。这些结果支持我们的假设，即相对较高的Taz表达是Mob1a / b耗尽后观察到的分化缺陷的关键原因之一。

分化后，Mob1a / b缺失的ESC中Taz表达显着增加（补充图3）。为了研究Taz和Yap在小鼠ESC分化中的作用，我们在Mob1a / b缺失的ESC中使用shRNA基因沉默敲低了Taz或Taz / Yap的表达（补充图5）。小鼠ESC中Taz或Taz / Yap的下调对Oct4的影响很小表达，碱性磷酸酶活性或未分化状态的菌落形态。但是，这两种蛋白在Mob1a / b耗尽的ESC中单独或一起下调克服了至少部分地由Mob1a / b耗尽引起的体外分化缺陷。这些结果与使用shYap ESC获得的结果相似，表明Taz和Yap在将小鼠ESC分化为三个胚层方面具有冗余功能。

综上所述，这些结果表明Mob1a / b-Yap信号传导（即Hippo信号传导途径）在从ESC分化的组织或细胞的形成以及三个胚层的规格中起着关键作用。

因为Mob1a / b是Yap 32的负调节剂，并且ESC的多能性需要Yap 20过度活跃，所以我们假设Mob1a / b的消耗不会引起ESC的变化。正如预期的那样，尽管Mob1a / b完全耗尽，mESC的自我更新和多能性仍得到了很好的维持。相反，在小鼠ESC的分化过程中必须抑制Yap。的确，Yap的过表达阻止了ESC的分化20。因此，Mob1a / b可能在分化中起Yap的负调节剂的作用。

而Lian等。20报告说，在分化条件下Yap的蛋白质水平显着降低，并且Yap敲低导致ESC特性丧失，我们观察到Yap-S112磷酸化在分化条件下增加，而Yap的蛋白质水平变化很小（补充图3）。而且，Yap敲低对小鼠ESC中的集落形成，碱性磷酸酶染色或Oct4水平几乎没有影响（图4a和补充图5）。不同的研究使用了不同的小鼠ESC系和饲养细胞。而Lian等。20使用来自129 / Sv株的ESC系和饲养细胞，我们从C57BL / 6胚泡建立了ESC系，并使用了C57BL / 6衍生的MEF细胞。我们建议使用来自不同的小鼠品系小鼠衍生ESC系和饲养细胞可能导致两组这些相互矛盾的结果47，48，49。

在这项研究中，Mob1a / b的消耗阻止了小鼠胚胎干细胞向三个胚层的分化。在分化为Mob1a / b的ESC的过程中，干细胞和胚层标记物的水平没有变化，与未分化的野生型ESC相似（图2c和3a）。这些结果与以前的报告不同，后者显示在Mob1a / b耗尽的EB中，只有原始的内胚层标记物被显着抑制30。在我们研究的时间依赖性EB形成测定中，每个分化标记物在不同的分化阶段或天数均被上调。例如，T-brachyury表达在EB形成后第4天最高，但Hand1表达在第6天最高（图3c）。这些结果表明，野生型和Mob1a / b缺陷型EB之间的差异取决于将哪个分化阶段作为标准。

在畸胎瘤形成试验中，用Mob1a / b耗尽的ESC产生的畸胎瘤没有显示出三个胚层细胞的任何结构特征（图5a）。此外，与对照（野生型或Yap击倒的ESC）相比，Mob1a / b耗尽的ESC中的Yap击倒仅显示出部分分化成三个胚层的恢复（图5a，b）。这些结果表明，需要Yap下调以及其他因子的上调或下调来挽救在Mob1a / b缺失的ESC中观察到的分化中的体内缺陷。根据我们观察到的Mob1a / b缺失畸胎瘤中Taz水平的升高，Yap和Taz的下调可以恢复小鼠胚胎干细胞在体内向三个胚层的正常分化。

最近的研究表明，邑的激活是足以改变分化细胞干细胞或祖细胞在成年器官和组织，尤其是呼吸道上皮细胞和肝脏50，51。还需要雅浦岛活性以下损伤成年组织的再生44，52，53，54，55。这些结果表明，治疗性抑制河马信号或提高Yap活性可以在治疗上改善组织再生和损伤修复的效率。然而，必须开发在再生医学中实际应用的Yap活性的药理学操作，以瞬时激活Yap并通过其激活来减少有害的副作用，因为Yap被称为致癌蛋白，并且广泛报道了抑制其活性的报道。人类癌症的范围56。由于Mob1a / b是Hippo途径的核心成分，因此靶向Mob1a / b以及其他Hippo信号传导成分可能对开发再生医学中Yap活性的药理操作有益。

总而言之，我们发现Mob1a / b（河马途径的核心成分）的耗竭导致小鼠ESC分化为三个胚层谱系的缺陷，这取决于Yap。这些结果表明，河马途径与干细胞的分化及其作为组织再生和修复的治疗靶标的潜力之间存在密切的关系。