MCP验证为CKD的生物标志物和/或治疗靶标 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

纤维化是慢性肾脏病（CKD）最常见的病理生理表现。它被定义为细胞外基质（ECM）蛋白的过度沉积。嵌入在ECM中的是称为母细胞蛋白（MCP）的蛋白质家族，通常在ECM加工的慢性病理过程中表达。这样，在受损肾脏的病理分泌物中鉴定潜在的MCPs可以作为纤维化的诊断/治疗靶标。使用来自两个病因不同的肾脏损伤小鼠模型叶酸（FA）和单侧输尿管梗阻（UUO）的已发表RNA-Seq数据，我们比较并对比了急性和纤维变性期间来自著名MCP家族的各种成员的表达谱伤害阶段。结果是，我们在两种损伤模型之间确定了共同且不同的MCP表达特征。对它们差异表达的MCP基因的生物信息学分析显示，分子功能和生物过程网络具有相似的顶部注释簇，这些簇通常参与纤维化。使用来自FA和UUO损伤小鼠的肾脏裂解物，我们从候选对象列表中选择了MCP基因，以通过Western Blot确认mRNA表达，这与损伤的进展相关。了解MCP的表达将为肾脏修复的过程提供重要的见解，并可能将MCP验证为CKD的生物标志物和/或治疗靶标。那些通常与纤维化有关。使用来自FA和UUO损伤小鼠的肾脏裂解物，我们从候选对象列表中选择了MCP基因，以通过Western Blot确认mRNA表达，这与损伤的进展相关。了解MCP的表达将为肾脏修复的过程提供重要的见解，并可能将MCP验证为CKD的生物标志物和/或治疗靶标。那些通常与纤维化有关。使用来自FA和UUO损伤小鼠的肾脏裂解物，我们从候选对象列表中选择了MCP基因，以通过Western Blot确认mRNA表达，这与损伤的进展相关。了解MCP的表达将为肾脏修复的过程提供重要的见解，并可能将MCP验证为CKD的生物标志物和/或治疗靶标。

介绍

慢性肾脏病（CKD）是一个主要的健康问题，影响着约10％的全球人口1。纤维化是与大多数CKD相关的修复不良适应症。它的特点是异常的硬细胞外基质（ECM）材料过度积累和加工，逐渐替代了柔性实质组织2。换句话说，与修复性ECM相关的建设性恢复过程可能会朝着组织的破坏性重塑（变硬）转变，从而导致永久性疤痕，器官功能衰竭甚至最终死亡3。尽管诸如透析和移植之类的干预方法可以用作肾脏替代疗法，但它们并不妨碍纤维化的进展。此外，目前尚无治疗方法可有效抑制或逆转与适应不良修复相关的损伤信号。确实，迫切需要研究在纤维化发作之前的修复机制，以鉴定用于疾病监测的新型生物标志物以及用于干预的治疗靶标。

ECM的状态是驱动修复的信号通路调控的主要决定因素。这样，在纤维化的背景下，ECM处理和细胞-ECM相互作用是要考虑的重要因素。在过去的20年中，基质细胞蛋白（MCP）已成为这些ECM事件以及因此ECM重塑和细胞行为的必需调节剂。作为分泌蛋白，MCP的各种活性取决于它们与多种ECM和细胞表面分子相互作用的多个功能区域。细胞及其周围环境之间的动态调节作用使MCP与ECM蛋白作为静态结构成分的“经典”作用区别开来。与ECM蛋白在细胞环境中持续存在相反，4，5。然而，MCP的表达在各种损伤和慢性疾病中持续存在，定位于患病组织的细胞外空间并有助于其病理（即纤维化） 6。因此，MCP在疾病进展过程中的细胞外定位和参与暗示了它们进入血液循环的潜力，并可以作为修复的非侵入性生物标志物，以及治疗纤维化副作用少的可及靶标。

多数MCP先前已被表征为纤维化。然而，在肾脏纤维化的背景下，仅进行了一些研究。尽管从针对单个MCP分子的众多实验中取得了这一进展，但尚未汇编来自主要MCP家族的多个成员的全局转录谱。因此，我们的目标是分析急性损伤阶段MCP的瞬时RNA表达模式，并确定那些在纤维化病理过程中持续表达的分子。具体来说，我们从毒物和肾损伤，从充分表征的MCP家庭屏幕所有已知成员的外科小鼠模型利用RNA测序（RNA-SEQ）的数据：小号ecreted P rotein 甲 cidic和- [R ICH在Ç ysteine（SPARC），CCN，血小板反应蛋白（THBS），小号商场我 ntegrin- 乙 inding 栗 GAND ñ -连接的ģ lycoprotein（SIBLING）和生腱蛋白（TN）。我们询问了在这些机制不同的损伤模型之间保守的MCP转录组的可能性，以及特定类型的损伤在修复过程中是否可以刺激其自身的MCP表达模式。此外，基于差异表达的MCP基因，我们通过生物信息学分析在两个实验模型中预测它们各自的功能。最后，我们通过Western Blot分析证实了两种小鼠肾脏损伤模型中早期和晚期MCP基因选择的mRNA表达差异。

我们的分析为在两种机制不同的损伤模型中整个组织重塑过程中MCP表达的可塑性提供了新的见解，并突出了这些损伤特异性蛋白作为纤维化的诊断/预后生物标志物和治疗靶标的潜力，目前尚无这些蛋白批准的治疗。

结果

定义我们的MCP候选对象和鼠标伤害模型

多年来，许多的MCP已发现并基于共享的结构/功能放在不同的家族内7，8。MCP系列SPARC，CCN，THBS，SIBLING和TN因其在维修中的重要机械作用而得到了充分研究。到目前为止，在这5个家庭中，总共确定了29个成员。我们认为具有已知功能的MCP家族成员的表达谱将反映在肾脏修复和/或纤维化的不同阶段发生的过程。此外，该信息可用于推断在纤维化中尚无已知功能的共同成员的作用。因此，我们决定筛选属于5个MCP家族的所有29名已知成员。使用包含“纤维化”和“肾纤维化”等包含术语的PubMed和“肾脏与尿路途径”知识库搜索引擎，我们将每个成员分为“肾脏纤维化已知”，“肾脏纤维化”或“纤维化” （表 1）。

表1根据体外和/或体内模型中已发表的纤维化相关性列出了候选MCP基因。

全尺寸表

我们最初从受伤的小鼠肾脏组织中利用了两个最近发布的基因表达（RNA-Seq）数据集，每个数据集代表了机制不同的损伤模型（图 1），即叶酸（FA）毒物模型和单侧输尿管梗阻（ UUO）手术模型。作为可靠的肾脏纤维化模型9，10，FA是一种倒退受伤，允许组织恢复，而UUO是渐进的和不可逆的; 因此，前者的纤维化组织分布更不规则，而后者则表现出更强的纤维化反应，影响整个肾脏。对于FA模型，我们分析了在FA处理后第0、1、2、3、7和14天（GEO＃GSE65267）从一式三份的小鼠肾脏样品中收集的总RNA得出的RNA-Seq数据11。至于UUO模型，在UUO后2天和8天后，对从一式三份的肾脏样品中获得的总RNA进行RNA-Seq，将其与4只假手术小鼠（GEO＃GSE79443）进行比较 12。两种损伤模型通常都以伤后7天为参考点，以区分急性适应性修复反应（<7天，在愈合过程 13中出现临时基质和修复基质）和纤维化结局（≥7天，修复标志物的病理水平 11，14，15，16，17），分别指定为“急性”和“纤维化”阶段。为了比较不同病因的两种损伤之间的相似性和差异，我们在每种损伤刺激的过程中对MCP小组中的基因表达水平进行了时间分析。

叶酸损伤的肾脏中MCP基因表达谱的鉴定

FA肾病是与损伤进展啮齿动物经常执行的一个简单的肾损伤模型和纤维化媲美人肾疾病14，18，19。已知腹膜内注射（ip）高剂量的FA会在肾小管内积聚和结晶，但也会对上皮细胞产生直接的毒性作用。因此，这导致肾小管病变引起修复反应20，并在后期出现轻度纤维化。纤维化的这种发展是类似的患者过渡到CKD即出现，说明了FA-损伤模型的纤维化相关人的条件11，21，22。与FA模型一致11，23，24中的基因表达在适当的时间对急性（KIM-1，TGFβ在1-3天）和纤维化（胶原蛋白，纤连蛋白，α-SMA，所述RNA测序数据集表现出预期的变化在第7和14天）受伤11。然后使用这个时间范围，我们评估了29个MCP候选基因的平均倍数变化（相对于未处理的）和绝对表达，以鉴定在FA诱导的损伤的急性和纤维化时间点上调或下调的基因（图。图2A-d ）。绝对表达保留给其对照没有可检测的表达的基因（图 2B，D）。

我们观察到MCP家族之间，以及MCP家族成员之间基因表达的明显动态和时间趋势。考虑到急性FA诱导的损伤（第1-3天）中的表达趋势，SIBLING和THBS基因大多被上调，CCN和TN基因混合表达，而SPARC基因则被下调（图 2A，B）。SIBLING基因Spp1是上调最多的MCP，在3天之内保持高表达，并在100倍以上达到峰值，而TN基因Tnr上调最多。只有THBS和SIBLING家族的成员只有在FA损伤后才表达。因此，使用它们的绝对值来显示THBS基因Thbs4和Comp，在FA治疗3天的某个时间点，SIBLING基因Bsp（也称为Ibsp）和Dspp被上调（图 2B）。但是，在修复的早期阶段，CCN基因Wisp2和SIBLING基因Dmp1和Mepe没有可检测到的表达。在FA诱导的纤维化损伤期间（第7和14天；图2C，D）进一步检查了MCP的基因表达趋势。SIBLING和THBS家族成员的表达水平仅被上调，而CCN和SPARC家族成员的表达水平却被上调。TN基因趋向于下调表达，除了一个成员，Tnc，它是仅次于Spp1的第二高表达的MCP 。MCP基因表达下调最严重的是SPARC家族成员Spock1，其基因表达水平降低了近90倍。在正常组织中无法检测到的MCP基因中，Wisp2和Dmp1的表达增加可忽略不计，而与早期时间点相比，Mepe在晚期损伤期间仍未检测到。

示意性地表示急性MCP反应与纤维化MCP反应之间的相似性，当基因表达水平在至少一个时间点使用DESeq分析进行统计学差异至少1个时间点时，被分类为差异表达（图 2E，F），其中p值≤0.05且log2倍数变化＞ 1.5（图 2A，C）。该分析中包括那些仅在损伤后FPKM绝对截止值> 2的情况下可检测到表达的MCP基因（图 2B，D）。在这29个MCP基因中，有13个差异表达上调，没有一个对Acute特异，有9个对Fibrotic特异，在两个阶段中有4个，而2个基因仅在Acute阶段才有差异。大多数SPARC家族基因在MCP纤维化反应过程中差异表达（Sparcl1，Smoc2，Sparc，Fstl1）。尽管Sparcl1和Smoc2基因的上调被归类为纤维化反应（图 2E），但在急性反应期间它们的表达最初有差异地下调（图 2F）。Thbs4，Tnc，Cyr61和Spp1是在至少一个时间点在急性期和纤维化期均显示差异表达的唯一基因。对于SPARC，THBS和TN家族，从急性反应到纤维化反应的基因表达趋势总体上呈上升趋势，而对于CCN家族，则呈恒定趋势。SIBLING家族在两个时间响应中的表达水平都有波动，但是唯一一个成员Mepe的成员在任何时间点都没有可检测到的表达。

单侧输尿管梗阻伤肾中MCP基因表达谱的鉴定

UUO是间质纤维化的是逐渐地从输尿管的手术结扎的发展，和随之而来的间质炎症，肾小管扩张，萎缩和细胞凋亡的已建立的小鼠模型16，17。UUO不是人类肾脏疾病的常见原因，而是肾盂积水的可靠模型11。此外，UUO模型被很好地描述以概括表征各种形式CKD 9的基本病理机制。修复转录组的基因表达变化在第2天出现急性损伤，而在第8天出现纤维化12。与我们的FA分析类似，我们评估了UUO损伤模型中每个29个MCP家族成员的平均倍数变化（相对于对照）和绝对表达，以将其表征为急性和/或纤维化阶段。

UUO后受伤（第2天，图3A，B）对MCP基因表达谱的急性分析表明，家庭之间存在变异。来自SIBLING家族的成员仅上调了基因表达，包括Spp1，这是所有MCP中最高的。仅有的表达检测不到的MCP是Tnxa，Bsp和Mepe。所有其他MCP家族的表达谱在其各自成员之间强度不同，尽管上调的MCP基因多于下调的基因。最下调的基因是TN成员Tnn。UUO诱导的损伤的纤维化阶段分析（第8天；图 3C，D）几乎所有MCP基因的表达都被上调，而3个基因的表达却未检测到（Spock1，Tnr和Mepe），而6个基因的表达下调了（Smoc1，Spock3，Comp，Tnn，Tnxb，Wisp3）。实际上，有5个基因的表达差异大于10倍（Thbs2，Thbs4，Wisp1，Wisp2，Spp1）。SIBLING家族是仅有的一个成员，其成员具有来自正常组织的不可检测的mRNA水平（图 3B，D）。在这些基因中，只有Dspp和Dmp1随时间推移表现出明显的上调，而Mepe 在急性和纤维化UUO损伤中均无法检测到。

通过DESeq分析鉴定出肾纤维化进展过程中差异表达的MCP基因，其p值≤0.05，log2倍数变化> 1.5，或者仅在损伤后表达，绝对FPKM值> 2。在总共29个MCP基因中，有14个差异上调，其中11个处于纤维化阶段，而3个处于急性和纤维化阶段（图 3E）。没有基因显示出表达上的显着差异，仅UUO应答的急性期除外。相反，Tnn，Spock3和Comp是唯一被发现明显下调的MCP基因（图 3F）。Tnn在急性和纤维化阶段均明显下调，而Spock3和Comp的下调仅限于纤维化阶段。UUO模型的一个显着方面是，与急性期相比，仅在损伤的纤维化阶段发现了差异上调的基因数量，这表明了不同的时间表达。SPARC家族的显着上调基因数量最多（4个成员）。从急性到纤维化损伤反应，基本上所有MCP基因的表达都呈现出增加的趋势，其中从两个时间点来看，在所有MCP中，Tnn是表达最低的基因，Spp1是表达最高的基因。

比较不同损伤阶段的肾脏损伤小鼠模型之间的MCP表达谱

为了确定MCP表达是限于特定的损伤机制还是可以不受初始损伤的影响而泛化，比较了FA和UUO模型中MCP的mRNA表达水平。在损伤模型之间的相似时间点比较差异表达的基因，这些基因通过DESeq调整后的p值≤0.05或绝对值> 2进行统计学比较：2天FA与2天UUO进行急性损伤分析，以及7天FA与8天UUO进行纤维化损伤分析。

在急性期，我们确定了FA模型（Tnc，Sparcl1，Smoc2）特有的3个MCP基因，UUO模型（Tnn，Dspp）特有的2 个MCP基因和两个模型（Cyr61，Spp1）重叠的2 种差异表达（图11）。。图4A）。然而，在两个损伤刺激中，纤维化期具有更多差异表达的MCP基因（图 4B）。仅在两种损伤模型之一中发现了数量有限的差异表达基因。我们仅发现了2个对FA损伤特异的MCP基因（Thbs1，Bsp），而6个MCP基因（Tnn，Thbs2，Spock3，Wisp1，Wisp2，Dmp1）对UUO模型具有特异性。虽然比较表达在每种损伤中均差异表达，表达类型是损伤特异性的，因为其在FA中上调而在UUO中下调。总体而言，两个模型均在纤维化期表达差异最大的基因（共10个；Tnc，Thbs4，Sparcl1，Sparc，Smoc2，Fstl1，Cyr61，Ctgf，Spp1，Dspp），表明MCP基因的保守签名与类型无关的伤害机制。从急性期的第2天开始，在FA和UUO的两个纤维化阶段差异表达的所有MCP基因都具有相同的上升趋势，除了Spp1在FA模型中从急性期到纤维化阶段均降低。

肾纤维化中差异表达MCP基因的综合分析

使用STRING数据库25对我们的数据集进行了生物信息学分析，该数据库生成了一个网络，以0.70的最小置信度汇总每个伤害组的MCP之间的预测关联（图 5）。在总共29个已知的MCP基因中，FA（7天）和UUO（8天）的纤维化阶段经历了比其各自的急性阶段更大的差异表达基因（图 4）。为了增加预测的关联数，仅对这组更大的差异表达基因进行了STRING处理。从我们生成的网络中，MCP表示为节点（图 5；球形），而其预测的功能关联表示为边缘（图 5）。; 行）。鉴于UUO和FA之间存在大量共享的MCP基因，他们的分析创建了相似的边网络（图 5）。有趣的是，UUO和FA的损伤特异性基因在它们的共享网络上基本上没有产生新的边缘，因此，UUO和FA之间的边缘总数相似。综上所述，这些在损伤之间共享的MCP基因相互作用组暗示，它可能是常见纤维化反应的一部分，而与病因无关。

MCP基因也与STRING和Gene Ontology（GO）生成的“分子功能”结构化网络相关。除了预测每种肾损伤的MCP之间的相互作用组之外，我们的分析还预测了我们精选的MCP中最重要的“分子功能”网络（图 5；用结点颜色表示）。所有预测的“分子功能”网络都涉及与特定ECM分子（即肝素，纤连蛋白，整联蛋白和胶原蛋白）的结合，这表明与它们各自的ECM结合时，MCP之间具有结合支架的可能性。尽管在我们的肾脏损伤模型之间预测的顶部注释没有差异，但我们确实揭示了构成每个“分子功能”网络的实际MCP的差异。

正如预期的那样，我们对来自FA和UUO模型的差异表达MCP基因的STRING和GO分析预测与各种ECM蛋白的结合具有高度相关性。为了在纤维化阶段共表达ECM微环境的情况下获得MCP基因的一般功能理解，编译了UUO或FA RNA-Seq数据集的差异共表达的MCP（图 4B）和ECM基因进行STRING和GO分析。对于每种肾脏损伤，合并的MCP和ECM数据集使我们能够识别其他潜在的重要相互作用网络，并更加确定地预测构成纤维化的众多因素中最重要的“生物过程”（补充图 1）。）。毫不奇怪，尽管UUO模型具有5个MCP基因（Dmp1，Comp，Smoc2，Ctgf和Cyr61）/ 55个ECM基因，而FA具有4 个MCP基因，但两种损伤的最高注释簇（由结点颜色表示）是“细胞外结构组织”。MCP基因（Ctgf，Smoc2，Bsp2和Cyr61）/ 24个ECM基因。两种损伤模型还共享“血管生成”，“细胞迁移调控”和“细胞粘附调控”的顶级簇，不同之处在于UUO具有更多的ECM基因集。两种损伤之间的主要区别是FA与UUO相比具有额外的网络，即“肽酶活性的调节”。当ECM沉积物通过肽酶活性进行重塑时，在纤维化FA晚期的缓解期可能需要这个额外的网络，由于UUO持续损伤诱导的ECM产生，因此UUO无法实现这种转变。可以理解的是，此类最重要的“生物过程”通常涉及修复。但是，我们的分析还提供了构成每个“生物过程”网络的MCP和ECM蛋白簇。这些集群可能在各自的复杂单位内协同工作，以建立其预测的“生物过程”网络。该信息与他们的相互作用网络（以相互作用边缘表示）结合在一起，以暴露出可能与他们各自的损伤模型的纤维化期有关的丰富信息来源。例如，将我们预测的“生物学过程”的结果与我们各种相互作用基因组的结果相结合，从而揭示出某些分子可能通过与相互作用成员的结合而具有的其他可能的生物学过程，特别是对于那些未分类的MCP分子（即补充图。该信息与他们的相互作用网络（以相互作用边缘表示）结合在一起，以暴露出可能与他们各自的损伤模型的纤维化期有关的丰富信息来源。例如，将我们预测的“生物学过程”的结果与我们各种相互作用基因组的结果相结合，从而揭示出某些分子可能通过与相互作用成员的结合而具有的其他可能的生物学过程，特别是对于那些未分类的MCP分子（即补充图。该信息与他们的相互作用网络（以相互作用边缘表示）结合在一起，以暴露出可能与他们各自的损伤模型的纤维化期有关的丰富信息来源。例如，将我们预测的“生物学过程”的结果与我们各种相互作用基因组的结果相结合，从而揭示出某些分子可能通过与相互作用成员的结合而具有的其他可能的生物学过程，特别是对于那些未分类的MCP分子（即补充图。 1 ; 白色节点）。因此，对于每种肾脏损伤，我们提供了共享各种注释簇的MCP和ECM分子的特定网络，并揭示了纤维化相中具有统计学意义的MCP和ECM蛋白之间的相互作用网络。

总体而言，此类基因的差异表达可能会影响我们确定的途径，从而导致通常在纤维化中观察到的预测功能改变和疾病发展。

验证MCP在急性和纤维化期的表达并将其与肾脏病理相关

通过从急性期和纤维化期的两个模型之间选择mRNA表达谱中最高的变化之一，可以在蛋白质表达水平上验证来自UUO和FA损伤模型的RNA-Seq数据。结果，我们选择CYR61和SPP1代表急性MCP，而选择SMOC2和FSTL1代表纤维化MCP。还选择了这类MCP候选物，因为它们在肾脏纤维化中的已知作用。因此，可作为纤维化MCP的阳性对照（表 1）。另外，选择THBS2是因为它在肾脏纤维化中具有新颖性，而选择BSP和DSPP来验证新型MCP在纤维化中的作用。我们在C57BL / 6 J小鼠中进行了250 mg / kg FA或赋形剂注射，然后在3、5和7天后收获了肾脏。我们还对C57BL / 6J小鼠进行了UUO操作，并在UUO术后2天和8天后使用对侧肾脏作为对照，收获了它们的肾脏。

病理学上的肾小管间质纤维化明显增加，证实了FA和UUO诱导的肾脏纤维化，如通过Masson的三色性色素（图 6A）和经典的损伤标记物纤连蛋白（图 6B）所检测。不出所料，UUO的进行性损伤随着时间的推移表现出纤连蛋白的增加，而回归FA模型达到纤连蛋白表达的峰值，随后是恢复期。由于输尿管系在UUO模型中，因此只能在FA模型中进行从受损肾脏的清除以评估肾功能。此外，血浆肌酐不能测量UUO肾脏的肾脏功能，因为通畅的对侧肾脏可以补偿肾脏阻塞引起的肾脏功能丧失26。由于UUO模型的这些局限性，仅在FA模型中分析了肾功能，通过测量血清肌酐，血尿素氮（BUN）和尿蛋白从其中收集尿液和血清来确认肾脏损伤（图 6C）。我们的结果表明，FA模型对血清肌酐和BUN有影响，暗示肾脏功能恶化。但是，我们并未在蛋白尿中看到明显的作用，可能是因为FA靶向了不参与蛋白质重吸收的远端小管27。因此，我们不会期望蛋白质水平发生变化。因此，对用FA治疗的肾脏进行的肾脏功能分析清楚地表明，肾脏活性降低，随后恢复，这是一种回归模型。

两种损伤模型的蛋白质印迹分析表明，我们的所有候选MCP基因的表达在损伤过程中均显着升高，而不论其是通过FA施用（图 7A）还是UUO（图 7B）启动的。有趣的是，所有候选MCP都反映了损伤的严重程度，其中MCP的表达分别遵循FA（图6A–C和7A）和UUO（图 6A，B和7B）的典型损伤回归和渐进模式。

讨论区

当前对CKD的诊断和治疗对于监测和预防疾病进展是无效的。不论病因如何，大多数CKD都具有过度ECM沉积的病理特征，从而取代了肾脏中的柔性实质组织，导致功能逐渐丧失。尽管基于组织学的ECM沉积测试代表了CKD诊断的金标准，但这种痛苦且侵入性的手术极易引起诸如出血等并发症，因此很少使用。我们推测处理细胞外基质蛋白的细胞外空间中的因素与纤维化病理密切相关。如果是这样的话，这些因素可以代表阻止和/或逆转纤维化的战略目标，但也可以提高治疗性进入和检测纤维化标记物的可及性水平。由于MCP符合这些标准并在组织重塑过程中表现出特异性表达（即纤维化），因此本研究旨在通过RNA-Seq评估包括5个特征明确的MCP家族（SPARC，CCN，THBS，在不同的纤维化模型中，在急性纤维化损伤过程中发生了SIBLING和TN）。患病组织中某些MCP的存在可能会成为新的生物标记。此外，它们在细胞外的位置可能导致它们陷入循环，并有可能充当非侵入性诊断和预后生物标志物。确实，患有多种组织重塑疾病的患者尿液中显示了几种MCP。特别是，在我们选择的MCP候选对象中，我们先前已经证明CKD患者尿液中可以回收SMOC2参照图 24，尽管已经在肾脏缺血再灌注损伤的小鼠的尿液 28和前列腺癌患者的尿液 29中分别发现了SPP1和CYR61。

我们在此介绍了所有已知的29个成员的基因表达谱，这些成员包括特征明确的MCP家族SPARC，CCN，THBS，SIBLING和TN。就我们所知，这些成员中的大多数以前从未与其他MCP进行过比较，也没有针对UUO和FA损伤后的疾病进展进行过调查，在其他情况下，从未进行过肾脏纤维化或一般纤维化的研究（表 1）。值得注意的是，在纤维化的背景下研究了SPARC家族的2个成员（Sparcl1，Smoc1），THBS家族的3个成员（Thbs2，Thbs3，Thbs4）和CNN家族的1个成员（Wisp2）是针对纤维化而非肾脏纤维化的。此外，我们报告了3位SPARC成员的表达趋势（Spock1，Spock2，Spock3），4个TN成员（TnxA，TnxB，Tnr，Tnn）和4个SIBLING成员（Bsp，Dmp1，Dspp，Mepe），以前没有针对任何类型的纤维化损伤进行过描述。

在从未进行过纤维化研究的MCP中，UUO模型的Spock3，Dmp1和Tnn，FA模型的Bsp和两种模型的Dspp是唯一在损伤后表现出差异表达的MCP。众所周知，Spock3可抑制基质金属蛋白酶30的活性，基质金属蛋白酶30是蛋白酶的一大家族，与降解修复过程中调节组织重塑的多种ECM蛋白密切相关。Spock3也已被证明由成肌纤维细胞表达，即晚期纤维化的效应细胞31。Dmp1已经研究了在调节羟基磷灰石的成核，其可具有自羟基磷灰石驱动肌成纤维细胞活化肌成纤维细胞上活性的效果32，33。关于Tnn，其功能随细胞类型而变化的知之甚少。实际上，该因子抑制了成纤维细胞34的增殖和分化，但通过内皮细胞35的延长，迁移和发芽而刺激了肿瘤血管生成。这两个BSP和的Dspp是骨基质的主要结构蛋白，但不发挥纤维化任何已知的功能，并没有关于他们的组织定位的信息有限36，37。在我们分析的所有MCP基因中，无论有无损伤，只有Mepe在任何一种损伤模型中均表现出不可检测的水平。我们新近分类的肾纤维化MCPs是有希望的靶标，值得进一步研究，因为它们的每个功能都可能提供急性和/或纤维化性肾损伤的新机制。

FA和UUO模型的病理机制差异很大，因此使其成为确定MCP表达特征在损伤之间是否保守还是每种病因所特有的理想模型。与急性期相比，我们仅分析了两种损伤的纤维化阶段，因为它具有大量差异表达的MCP基因，可以提供更全面的分析。尽管我们确定了损伤特异性表达或损伤之间重叠的差异表达基因，但除Bsp，Wisp1和Dmp1之外，大多数29种MCP基因在FA和UUO的纤维化期之间显示出相似的表达趋势（图 2C，D和3C， D）。BspWisp1和Dmp1分别在FA中表达差异但在UUO中表达可忽略不计，而Wisp1和Dmp1在UUO中均显示差异表达，但分别在FA中下调和表达极低。如前所述，从未研究过Bsp和Dmp1的纤维化。然而，已知Wisp1可以诱导足细胞中胶原蛋白和纤连蛋白的表达38，其血清水平显示出有潜力作为CKD 39患者肾纤维化的非侵入性生物标志物。总体而言，我们的比较分析描述了针对不同类型损伤的差异表达的MCP，即进行性（UUO）与渐进性（FA）的差异，但同时也表明那些在FA和UUO中差异表达的MCP可能会成为常见的治疗靶点，纤维化发展的生物标志物，无论最初的损伤如何。事实上，二FA和UUO重叠的MCP，Cyr61基因和Smoc2，已经独立地示出了用于在肾纤维化的各种型号它们的治疗潜力24，40，41。

我们对在纤维化阶段差异表达的MCP和ECM基因的STRING分析确定了修复范围内已知的众多分子中预测的最高分子功能和生物学过程。两种损伤之间共享的MCP表达谱（图 4B）构成了这些预测的纤维化功能中的大多数（图 5和补充图 1），进一步表明，这一保守的MCP基因集可能与糖尿病的一般病理机制有关。肾脏纤维化无论损伤的性质如何。因此，将这些共享的MCP作为可能的治疗靶点进行组合研究将是值得的，因为靶向单个MCP可能导致显着抑制一般纤维化特征。

从两种损伤模型的每个急性期或纤维化期中mRNA表达变化最大的那些中选择用于验证MCP表达的候选者。具体来说，分别选择CYR61和SPP1，以及SMOC2和FSTL1分别代表急性和纤维化阶段MCP。还选择了这样的MCP候选物作为肾纤维化的MCP阳性标志物（表 1）。SMOC2以前与FA和UUO模型的纤维化有关24。在当前的研究中，来自FA和UUO模型的SMOC2蛋白表达与先前使用相同的损伤模型显示的表达相似24。但是，与我们以前的结果一致，我们现在揭示SMOC2表达也与肾脏功能不全相关。此外，SMOC2先前已显示可影响肾脏成纤维细胞向成肌纤维细胞的转化24。尽管在各种肾脏损伤模型中研究了FSTL1，SPP1和CYR61，但在此我们首次在FA模型中展示它们的表达。在UUO- 小鼠模型研究42中，显示FSTL1在术后2天和5天后在肾脏成纤维细胞中被特异性上调，而我们的分析是在整个肾脏中进行的。然而，我们注意到，这个因素被证明是参与纤维化过程中的其他器官模型43，44，和在一种情况下，以博莱霉素诱发的肺纤维化中影响促纤维化因子TGFβ 45。单侧输尿管梗阻和缺血再灌注（I / R）肾损伤模型，CYR61一直与损伤的早期阶段，促炎症和纤维化的作用联系在一起的，它的抑制有可能无法长期持续的抗纤维化效果46，47。SPP1已被广泛显示在许多小鼠肾损伤模型，包括UUO，肾毒血清肾炎和糖尿病性肾病修复早期炎症阶段被牵连48，49，50。我们还选择了在纤维化或肾纤维化方面具有新颖性的候选药物。因此，我们选择了THBS2，因为从未在肾脏纤维化的背景下对其进行过研究，而我们首次呈现了BSP和DSPP在纤维化环境中的表达。

对于我们大多数的候选MCP，蛋白质水平与mRNA表达相关，并且与UUO中的损伤进展模式和FA中的损伤消退模式相关，这些均使用纤连蛋白进行了评估。此外，我们观察到MCP候选物的表达与肾功能恶化和纤维化的Masson Trichrome染色相关。尽管我们的MCP候选者具有这些相关结果，但FA中SMOC2 mRNA和蛋白表达之间存在差异，而UUO模型中则没有差异。的确，我们预期在纤维化阶段内高水平的SMOC2 mRNA可以转化为相似的蛋白质水平。但是，我们在急性期观察到了最高的蛋白质表达。这可能意味着影响蛋白质表达的调控机制，例如翻译和/或翻译后调控的机制。

总之，我们提供了肾损伤发展各个阶段的MCP基因表达模式的概况，并预测了与纤维化进展相关并可能介导纤维化进展的功能网络。我们的分析揭示了靶向治疗的潜在候选物，以及具有早期诊断和预后价值的有前途的生物标志物。

方法

化学制品

叶酸（FA），丽春红S，过硫酸铵和TEMED是Sigma-Aldrich CAN的产品。从VWR获得Tween20，Tris-碱，甘氨酸，EDTA，甲醇，SDS，丙烯酰胺和双丙烯酰胺。所有化学药品均为ACS级或更高。Trimidox和Torbugesic购自CDMV，Saint-Hyacinthe，CAN。

动物模型

将8至12周龄的C57Bl / 6J小鼠（美国杰克逊实验室）饲养在HôpitalMaisonneuve-Rosemont（HMR）研究中心的动物设施中，并提供Harlan Teklad啮齿动物饮食＃2018（Envigo，Lachine），CAN）和水随意使用。所有实验均根据加拿大动物保护委员会关于实验动物的护理和使用的指导原则进行，并在我们当地动物保护委员会CIUSSS de l'Est-de-l的保护委员会的监督和批准下进行蒙特利尔蒙特利尔（批准的协议＃2018-1261）。

手术和实验方案

如先前所述，使用了两种小鼠肾脏纤维化模型24。在一天的同一时间一致地进行手术和注射。简要描述了这些模型：

FA模型。8至12周龄的雄性C57Bl / 6J小鼠（25-29 g）接受单次腹膜内注射溶解在0.3 M碳酸氢钠溶液中的FA（250 mg / kg）。处死前一天，在代谢笼中收集尿液24小时，以确定尿液蛋白浓度。FA施用后第3、5和7天对小鼠实施安乐死，以收集器官和血液。安乐死是在异氟烷麻醉下进行的。

UUO模型。吸入异氟烷麻醉8至12周龄的雄性C57Bl / 6J，并通过侧面切口暴露其左肾。用3-0缝合线（Ethicon； Perma-hand Silk / Black Braided）在靠近肾脏的两个位置结扎左输尿管。左肾用作对侧对照。小鼠在手术后立即失去补液（1 ml生理盐水，在37°C，ip加热）和抗生素（Trimidox）。手术后第2天和第8天对小鼠实施安乐死以收集器官和血液。安乐死是在异氟烷麻醉下进行的。

在这两种模型中，在处死动物时，均用冷PBS灌注肾脏，立即切除并在磷酸盐缓冲液（PBS）中冲洗。将用于组织学染色的样品在福尔马林中固定24至48小时，然后包埋在石蜡中。Western Blot的样品在液氮中速冻。收集血液用于进一步的生物化学表征。

组织学

将石蜡包埋的肾脏切成4至6μm的切片，并进行Masson Trichrome染色处理。在HMR的成像设施中获取图像。通过NIH ImageJ使用由Gabriel Landini（版本v1.8）编写的颜色阈值算法（用于比较图像集的相同阈值设置）分析了所有图像，该算法可从http://www.mecourse.com/landinig/software/software.html获得。。

生化参数

血清样品中的肌酐浓度采用改良的酶法（CREP2，加拿大罗氏诊断公司（Roche Diagnostics，Canada））进行测定。简而言之，通过将50 µl标准品或血清转移至1.5 ml微量离心管中来制备样品。沉淀蛋白质，并在真空下（LABCONCO冷冻干燥系统，VWR，加拿大）冻干上清液。将冻干的样品在25 µl去离子水中复原，并充分涡旋混合。在室温下孵育30分钟后，将样品再次充分涡旋混合，然后以11000×g离心5分钟。将8 µl每种上清液一式两份转移至半面积平板（Costar＃3695）。将62 µl CREP2 R1添加到每个孔中。将板以1000 rpm涡旋混合（MixMate，Eppendorf，Canada）30秒，并在37°C下孵育15分钟，以允许内源性肌酐降解。进行405 nm和540/630 nm的读数，然后将31 µl CREP2 R2添加到每个孔中。将板以900 rpm涡旋混合30秒。以动力学模式进行读数，每分钟进行30分钟（ELx808，BioTek，美国）。

根据制造商的说明，用Quantichrom尿素测定试剂盒（BioAssay Systems，Hayward，CA，USA）测量血清尿素。尿肌酐和尿蛋白分别在Architect c16000临床化学分析仪（Abbott Diagnostics，IL，美国）上使用动力学碱性苦味酸盐法和比浊法进行测定。

组织准备以进行蛋白质印迹分析

使用高架搅拌器（IKA）在含有1x蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Roche，Sigma，Canada）的RIPA缓冲液（Pierce，ThermoFisher，Canada）中匀浆小鼠肾脏的冷冻活检样品。使用BCA方法（Pierce，ThermoFisher，加拿大）测定蛋白质浓度。

蛋白质印迹

通过蛋白质印迹分析评估蛋白质水平。在含有0.4％十二烷基硫酸钠（SDS）的10％聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离10至50 µg蛋白质的样品，然后电泳转移至硝酸纤维素膜上（Amersham Protran 0,45 µm，GE Healthcare Life science，密西沙加，加拿大）。将膜用含0.1％Tween20（TBST）的Tris缓冲盐水（TBS）中的5％NFDM饱和，并用TBST洗涤。以下一级抗体用于检测特定蛋白：抗SMOC2（1：200； R＆D Systems，AF5140），抗CYR61（1：2,000；又名CCN1 R＆D Systems，AF4055），抗–FSTL1（1：10,000； R＆D Systems，AF1738），抗SPP1（1：10,000;又名OPN R＆D Systems，AF808），抗THBS2（1：1000; Santa Cruz Biotechnology，sc-136238），抗DSPP（1：750; Santa Cruz Biotechnology ，sc-73632），抗BSP（1：750；圣克鲁斯生物技术，sc-73630）和抗GAPDH（1：5,000； Abcam，ab9485）。辣根过氧化物酶偶联的针对绵羊（Sigma，A3415），山羊（Sigma，A5420）和兔子（Santa Cruz Biotechnology，sc-2357）的二抗用于检测合适的一抗。用来自Bio-Rad Laboratories（Hercules，美国）的Clarity Max Western ECL底物检测条带。使用来自GE Healthcare Life Sciences（Mississauga，CAN）的ImageQuant LAS-4000系统，ImageJ和FUJIFILM MultiGauge V3.0，通过计算机辅助光密度法分析结果。sc-2357）用于检测合适的一抗。用来自Bio-Rad Laboratories（Hercules，美国）的Clarity Max Western ECL底物检测条带。使用来自GE Healthcare Life Sciences（Mississauga，CAN）的ImageQuant LAS-4000系统，ImageJ和FUJIFILM MultiGauge V3.0，通过计算机辅助光密度法分析结果。sc-2357）用于检测合适的一抗。用来自Bio-Rad Laboratories（Hercules，美国）的Clarity Max Western ECL底物检测条带。使用来自GE Healthcare Life Sciences（Mississauga，CAN）的ImageQuant LAS-4000系统，ImageJ和FUJIFILM MultiGauge V3.0，通过计算机辅助光密度法分析结果。

RNA-Seq数据库和生物信息学分析

我们按照以下步骤处理RNA-Seq数据。从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库存储库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中检索了FA（GSE65267）11和UUO（GSE79443）12鼠标模型的原始读取计数。删除所有样本中读数计数低于1的成绩单。使用DESeq在每个时间点识别差异表达（DE）的转录本。2 在R中使用默认参数实现的程序包51。差异表达的MCP转录本是那些对数变化最小的对数> 1.5，调整后的p值≤0.05，或者在没有检测到mRNA的情况下绝对FPKM值> 2。为了识别细胞外分子，我们使用了clusterProfiler 52仅在属于GO术语的差异表达基因（对数倍数变化> 1.5，且调整的p值≤0.05）上具有R包装：细胞外空间（GO：0005615）。FDR≤0.05的本体术语被认为是重要的。

MCP家族的成员因参与纤维化而闻名。使用数据库PubMed，肾脏和泌尿途径知识库（KUPKB）对我们的29个MCP基因候选物和关键词“纤维化”或“肾纤维化”进行了搜索。将每个MCP的结果列表为参与了包括肾纤维化在内的纤维化，排除了肾脏纤维化的纤维化或未参与任何纤维化。

用于检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具（STRING）53用于基于已知和预测的蛋白质相互作用的数据库来可视化我们MCP候选基因内的网络相互作用。GO被用作STRING中的辅助工具，以识别分子功能和生物学过程的网络。

统计分析

结果表示为平均值±标准误差。多重比较的统计学显着性是通过带Bonferroni校正的两尾Student t检验（p≤0.05 / n，其中n =样本量）计算的。使用GraphPad Prism v6.05进行统计分析。