非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是造成慢性肝病的主要原因，约占总人口的25％1。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是NAFLD的渐进亚型，其可以导致肝硬化，甚至肝细胞癌，因此代表在肝相关的死亡率的初始步骤2，3。NASH的组织学特征是存在肝脂肪变性，与炎症相关的肝细胞膨胀，伴或不伴纤维化4。然而，纤维化已被证明是最重要的组织学预测疾病相关的死亡率5，6，7。现在公认的是，NAFLD / NASH的发病机理是由于源自肠道和脂肪组织的“多次打击”，从而导致肝脏炎症和脂质蓄积8。反过来，脂毒性导致线粒体功能障碍，氧化和内质网（ER）应激，炎症持续，肝星状细胞的活化和最终增加纤维基质沉积和肝细胞死亡9，10。

NAFLD通常与肥胖，2型糖尿病，胰岛素抵抗，高脂血症和高血压1相关，因此有时被认为是代谢综合征的肝脏表现。然而，遗传易感性，果糖和富含胆固醇的饮食，内脏脂肪和血脂异常可以偏向于非肥胖患者“精益NAFLD”的发作11，12。由于肝脏活检的侵入性和进展缓慢，因此对这种多因素疾病的连续监测在人类中具有挑战性。NAFLD的目前患病率上升和疾病的复杂性已经促使替代动物模型的发展13，14，15。理想情况下，该模型应快速重现人类NASH的病理特征，并发展至该疾病的更高级阶段，例如肝细胞癌。尽管已经开发了多种遗传和饮食啮齿动物模型，但要概括人类疾病的异质性，则需要结合使用多种模型16。

在本研究中，我们结合多种方法来消除由经典的富含胆固醇/胆酸盐的动脉粥样化（ATH）饮食和蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食引起的常见和特定改变。两种模型都诱导肝脏中脂质的积累，但是积累的代谢产物的性质不同。虽然两种饮食导致增加肝游离脂肪酸17，18，MCD喂养小鼠的肝脏甘油三酯富集17，19，20，21而ATH-供给啮齿动物的肝脏中主要积累胆固醇18，22。由于能量消耗增加20，23，ATH-和MCD饲料的小鼠没有获得体重和不发展全球胰岛素抵抗18，24。然而，它们存在肝脏胰岛素抵抗18，25，26和适合于研究在不存在混淆参数（全身胰岛素抵抗或肥胖）的NASH发病机理。通过结合经典的组织学，病理评估和基因表达分析，我们表明这两种饮食模型迅速概括人类NASH的肝脏表现。此外，我们的脂质组学分析强烈强调了鞘脂（包括神经酰胺及其衍生物）在肝脏中的蓄积，作为这两种模型中的脂毒性标记。

ATH和MCD诱导的NASH模型的血液，脂肪组织和肠道参数

我们用两种不同的饮食对C57BL / 6J雄性小鼠进行了攻击：一种缺乏蛋氨酸和胆碱（MCD）的饮食7周，或者一种富含脂质，胆固醇和胆酸盐的致动脉粥样硬化（ATH）饮食12周。从全球的角度来看，MCD饮食可显着降低小鼠体重，白色脂肪组织贮藏量和脂肪细胞大小（表   1，补充图   S1A）。相反，当相对于体重表达时，棕色脂肪组织（BAT）的质量仅适度减少甚至增加（表   1）。与对照组相比，饲喂MCD日粮的小鼠的游离脂肪酸（FFA）循环水平更高，但血浆葡萄糖，胰岛素，总胆固醇和甘油三酸酯水平却降低了（表   1）。ATH饮食没有改变体重，但附睾和腹股沟白色脂肪储库适度扩大，而BAT质量下降（表   1）。从组织学上讲，来自ATH和MCD喂养的小鼠的BAT包含越来越少的脂质滴，具有强烈的细胞质染色（补充图   S1B）。饲喂ATH饮食的小鼠的血糖和FFA血浆水平无变化，但胰岛素血症，HOMA-IR（胰岛素抵抗稳态模型评估）指数27和甘油三酸酯血症的减少伴随循环总胆固醇水平的升高（表   1）。两种饮食都显着改变了回肠营养转运蛋白的基因表达。富含脂质的ATH饮食增加了Cd36和Fabp6 mRNA表达，而富含碳水化合物的MCD饮食上调了葡萄糖（Slc5a1）和果糖（Slc2a5）转运蛋白的mRNA （补充图   S2A）。在MCD组中，胆固醇（Npc1l1）和肽（Slc15a1）转运蛋白的水平也增加了，而脂质转运蛋白的表达却略有下调（补充图   S2A）。此外，与CTRL和ATH组相比，MCD饮食通过减少绒毛和隐窝大小，对回肠形态有很大影响（补充图   S2B–D）。

评估ATH和MCD饮食引起的肝损伤

在以ATH喂养的小鼠中肝脏重量没有变化，而在以MCD喂养的小鼠中肝脏重量显着降低（图   1A），但是相对于体重没有观察到变化（图   1B）。在MCD喂养的小鼠中，循环肝酶ALT和AST显着升高，但在ATH喂养的小鼠中，与CTRL对应的小鼠相比，肝脏肝酶没有改变（图   1C，D）。然而，对肝切片进行病理学评估，并用苏木精和曙红（H＆E）染色后发现，两种饮食均会引起肝细胞膨胀和小叶发炎（图   1E，F）。此外，lipogranuloma（我。Ë。围绕脂滴的巨噬细胞组成的炎性结节）在MCD饲料的小鼠的肝脏（图黄色虚线圆中观察到。 1E）。定量地，两组中近60％的肝细胞积聚了脂质（图   1G），超过20％的肝表面积被脂质吸收（图   1E “油红O”染色和图   1H）。尽管在ATH和MCD组类似度脂肪变性，ATH-喂养的小鼠的肝脏中主要呈现无数小的脂质泡囊（我。ê。microsteatosis，图   1G，图灰色箭头   1E），而MCD喂养小鼠的肝有主要为单一的大脂滴（我。ê。大泡，图   1G，图白色箭头。   1E）。在这两种模型NASH，胶原沉积与对照相比（图中显著增加   1E “天狼星红”和图   1I），但MCD组显示出更明显的积累比ATH组（图   1I）。最后，高碘酸希夫（PAS）染色表明，与CTRL小鼠相比，两个NASH模型中糖原存储均无重大变化（图   1E，J）。

ATH和MCD饮食诱发相似程度的脂肪变性，但NASH严重程度不同。肝重量以克（A）表示，以体重百分比表示。（B）血浆肝酶水平：ALT（C）和AST。（D）肝组织学：苏木精和曙红（H＆E），油红O，天狼星红和高碘酸席夫（PAS）。（E）SAF评分与脂肪变性，活动性（小叶炎症+球囊扩张）和纤维化有关。（F）评估肝细胞中微脂肪和大脂肪变性的百分比。（G）脂质（H），胶原蛋白（I）和糖原（J）表示为分别用油红O，天狼星红和PAS染色的面积百分比。比例尺100 µm，黑色箭头：免疫细胞浸润，白色箭头：大脂肪变性，灰色箭头：微脂肪变性，黄色虚线圆圈：脂肪肉芽肿。单向方差分析：* p值ATH / MCD 与 CTRL <0.05，＃ p值MCD 与 ATH <0.05。

全尺寸图片

总之，这些结果证实，两种饮食诱导的NASH，肝脏表现我。e。脂肪变性，肝细胞膨胀，小叶炎症以及纤维化。尽管在以ATH和MCD喂养的小鼠之间脂质蓄积程度相似，但在MCD组中肝脏损伤更为明显，并伴有组织纤维化和肝酶升高。

ATH和MCD喂养的小鼠脂质积累和促纤维化环境背后的肝酶和转运蛋白转录变化

为了阐明在ATH和MCD喂养的小鼠中NASH表现的潜在分子途径，我们通过定量PCR研究了肝转录的变化，特别关注了涉及纤维发生，炎症和脂质稳态的基因（图   2，红色的上调基因） ，以绿色下调基因）。ATH和MCD组均表达了Vim和Acta2 mRNA 的上调，这是活化的成肌细胞样肝星状细胞（HSC）的经典标记。此外，促纤维化标记（Timp1，Col1a1，Col3a1，Tgfb1，Mmp13）在ATH和MCD喂养的小鼠的肝脏中过表达。在与组织学纤维化量化（图线   1I），促纤维化标记物（的一个子集TIMP1，SPP1，COL4A1和MMP2，3，13和14）在MCD喂养的小鼠进一步增加相比ATH-喂养小鼠。此外，促炎性介质（Tnf，Ccl2）和巨噬细胞标志物（Adgre1，Itgax）的过表达）在组织学上证实了小叶炎症。有趣的是，在MCD和ATH组中，骨形态发生蛋白（BMP）家族Bmp6和Bmp7的抗纤维化标记物的表达受到不同的调节。虽然Bmp7在MCD喂养的小鼠中被彻底地废除了，但Bmp6在ATH喂养的小鼠中被显着下调。如TGF和BMP，SMAD2的一个共同的信号转导，先前报道的作为抗纤维化28，29，被显著在两个ATH-和MCD饲料的小鼠下调。

ATH和MCD喂养的小鼠肝脂质基因的实时定量PCR。肝脏相对基因表达（平均值和SEM）按代谢功能排序。标准化为RPS29。平均值以粗体显示：p值与 CTRL组的比较<0.05。根据平均LOG2的颜色代码，从深绿色（高度下调vs CTRL组），白色（无变化）到深红色（高度上调）。

全尺寸图片

转录分析表明，MCD饮食由于脂质出口受损（Mttp表达降低）而导致严重的肝脏脂质蓄积，这与脂类（Cd36，Vldlr）的进口增加有关，源于WAT的脂解作用，如WAT收缩和循环中FFA的增加（表   1）。这种不平衡在肝脏脂质运输是伴随着减少从头脂肪生成（Srebf1c，FASN，SCD1）和脂肪酸氧化（的PPARα，CPT1A）中，用在酶选通甘油三酯翻转没有观察到大的变化（Pnpla2，Dgat2）。ATH组也表现出从头脂肪酸合成（Fasn）和氧化（Cpt1a）减少，但与MCD组相比，脂肪酸转运酶CD36（Cd36）和脂蛋白转运子（Ldlr，Vldlr）的表达水平降低。下调。此外，ATH组中负责维持胆汁中适当的磷脂浓度的ABC转运蛋白MDR3（Abcb4）被上调，脂质输出蛋白（Mttp）略有增加。

ATH和MCD喂养的小鼠均显示出降低胆固醇生成的基因（Hmgcr，Hmgcs1）的下调，但只有ATH喂养的小鼠的心尖胆固醇转运蛋白Abcg5和Abcg8显着过表达。关于胆汁酸（BA）的合成，Cyp7a1（限速酶）在两种模型中均表现出降低的趋势。Cyp8b1（驱动BA合成的经典途径）在ATH和MCD喂养的小鼠中被下调。相反，在ATH组中Cyp7b1（驱动BA合成的替代途径）被上调，而在MCD组中则大大降低。关于BA运输，顶端出口商Abcb11仅在MCD小鼠中被下调。ATH组的基底外侧进口商（Slc10a1和Slco1a1）被下调，而MCD组的基底外侧进口商被下调，而两组的基底外侧出口商Slc51b均被上调。

就葡萄糖稳态而言，在以ATH和MCD喂养的小鼠中均观察到了Glut2表达的降低。此外，在MCD组中，葡萄糖激酶（Gck），磷酸果糖激酶（Pfkl），糖原合酶（Gys2）和糖原磷酸化酶（Pygl）均被下调，与低血糖和胰岛素血症相一致。相比之下，在ATH喂养的小鼠中，驱动葡萄糖和糖原代谢的酶受到的影响很小。

与ATH组相比，几乎所有参与氧化应激的酶在ATH和MCD喂养的小鼠（Sod1，Sod2，Gpx1，Cat）的肝脏中均表达降低，在MCD中观察到更明显的下调。相反，在MCD组中，谷胱甘肽过氧化物酶3（Gpx3）和ER应激标记Chop特别过表达。

综上所述，基因表达的变化表明，在MCD喂养的小鼠中，脂肪摄取增加和脂质输出减少，使肝脂肪变性累积恶化，这种失衡导致新生脂肪生成受到抑制。相反，ATH肝脏对脂肪酸和甘油三酸酯积累（减少进口和合成，增加出口）以及胆固醇积累（减少合成和增加顶尖出口）表现出相反的调节机制。然而，这些补偿机制不足以抵消持续的食物供应。

ATH和MCD喂养的小鼠的脂质组学揭示了肝脏脂质稳态的主要变化

为了评估肝脂质组成的质变，我们通过靶向质谱分析了总共944种脂质，其中在所有组中检测到801种（图   3A）。与 CTRL组相比，倍数变化的分层聚类分析（图   3B）强烈突出了鞘脂（SL）的富集，其总含量在ATH和MCD组中显着增加（图   3C）。事实上，重组簇暗红色脂质种类（我。ê。超过2倍的增加）大多包含SL物种。相比之下，两种NASH模型中的脂质种类均不足（图3B中的绿色） ）主要属于心磷脂的线粒体特异性脂质类别（CL）或磷脂酰肌醇类别（PI，图   3B）。在MCD组（绿色）中减少但在ATH组（白色，浅绿色或浅红色）中没有不同调节的脂质物种簇主要包含磷脂酰胆碱（PC）磷脂，尤其是最常见的物种： PC34：2和PC34：1（图   3B）。脂质组学分析的主成分分析（PCA）显示三种饮食之间的清晰分离（图   3D）。分为主要成分1的脂质类别主要包括鞘磷脂（SM），糖基神经酰胺（GlcCer）和二氢糖基神经酰胺（GlcDHCer），并允许区分这三种实验条件，而ATH组是CTLR和MCD组之间的中间产物。另一方面，主要成分2以磷脂（PL）为主，尤其是含PC的PL和含PL的醚键，并且将ATH组与CTRL和MCD组分开。

对CTRL，ATH和MCD小鼠肝脏中944种脂质的脂质学分析。每种脂质代谢物的平均浓度的LOG2按脂质类别（PC，PE，PI，PS，CL，Cer，GlcCer，SM）排序，并以热图表示。CTRL组=左列，ATH组=中央列，MCD组=右列。（A）801个脂质物种的分层聚类，以LOG2倍数变化对 Ctrl组表示，每个簇中代表最多的脂质类别。（B）每个脂质基团的主要种类以粗体显示。脂质类别的绝对浓度标准化为磷酸盐含量。（C）每组N = 6只动物的801种脂质物种的主成分分析。（D）PC：磷脂酰胆碱，PE：磷脂酰乙醇胺，PI：磷脂酰肌醇，PS：磷脂酰丝氨酸，CL：心磷脂，Cer：神经酰胺，GlcCer：糖基神经酰胺，SM：鞘磷脂，DHCer：二氢神经酰胺，GlcDHCer：二氢糖苷：鞘脂。单向方差分析：* p值ATH / MCD 与 CTRL <0.05，＃ p值MCD 与 ATH <0.05。

全尺寸图片

ATH和MCD-NASH模型中的鞘脂代谢均失调

神经酰胺（Cer）在SL代谢中很重要，因为它们可以被糖基化成为糖基神经酰胺或被磷酸胆碱头基修饰成鞘磷脂。神经酰胺和糖基神经酰胺都富含ATH和MCD组（图   4A）。对于鞘脂前体（二氢神经酰胺（DHCer）和GlcDHCer）和成熟形式（Cer和GlcCer）观察到这种增加。重要的是，在两个NASH模型中，信号鞘氨醇鞘氨醇-1磷酸酯（S1P）信号明显丰富（图   4A）。

在ATH和MCD喂养的小鼠的肝脏中，鞘脂代谢失调。鞘脂类的浓度标准化为磷酸盐含量。（A）参与神经酰胺生物合成途径的主要酶的基因表达。（B）脂质种类的浓度：神经酰胺（C），糖基神经酰胺（D）和鞘磷脂。（E）Cer：神经酰胺，DHCer：二氢神经酰胺，GlcCer：糖基神经酰胺，GlcDHCer：二氢糖基神经酰胺，C1P：神经酰胺-1-磷酸，S1P：鞘氨醇-1-磷酸，SM：鞘磷脂。单向方差分析：* p值ATH / MCD 与 CTRL <0.05，＃ p值MCD 与 ATH <0.05。

全尺寸图片

为了进一步了解在两个NASH模型中鞘脂积累的机制，我们量化了参与SL生物合成的基因的表达。从头合成神经酰胺是由丝氨酸-棕榈酰转移酶（SPT）引发的，该酶具有三个亚基（Sptlc1-3）。所述Sptlc2亚基在两个NASH模型中显著增加，而Sptlc1在ATH-喂养的小鼠（图仅略微上调   4B）。随后，由神经酰胺合酶（CerS）家族产生神经酰胺，所述神经酰胺合酶根据链长对脂肪酰基辅酶A具有不同的选择性。神经酰胺合酶2是肝脏中主要的CerS亚型，可产生含有Cer 30的 C20-C26，31，其中Cer C24是最丰富的Cer物种（图   4C）。即使在我们的NASH模型中CerS2没有上调（图   4B），MCD组中Cer C24也明显增加，而在ATH小鼠中Cer C22也升高（图   4C）。另外，与CTRL和ATH组相比，在MCD喂养的小鼠中糖基化形式（GlcCer C22-C24）显着富集，其中GlcCer C24显示出超过3倍的增加（图   4D）。第二个最表示肝核证减排量是CerS4产生神经酰胺C18-20。Cer C18-20（图   4C）和GlcCer C18-20（图   4D）尽管只有MCD喂养的小鼠显示出CerS4的显着增加（图   4B），但在富含ATH和MCD喂养的小鼠的肝脏中却富含）。MCD组中普遍表达的酶CerS5和CerS6显着上调，而ATH组中则略有增加（图   4B）。这些神经酰胺合酶产生的Cer C14（CerS6）和Cer C16（CerS5 / 6）在ATH和MCD组的含量至少是CTRL组的两倍（图   4C，D）。注意，DCDs1和Degs2使DHCer的去饱和作用，将含有Sphinganine的二氢神经酰胺转变为含有鞘氨醇的神经酰胺，似乎并没有被MCD和ATH饮食改变（图   4B）。鞘磷脂酶使SM快速降解也产生神经酰胺，其中Smpd1在MCD肝脏中显着上调（图   4B）。出人意料的是，即使SM含有胆碱头部组，与CTRL组相比，除胆碱缺乏饮食外，在7周后，除SM C22外，所有其他成分在MCD小鼠的肝脏中均明显富集（图   4E）。实际上，与对照相比，SM C16和SM C18分别显示出3倍和5倍的增加。在ATH组中，总SM含量显示出轻度增加（图。 4A）。尽管C14-C20 SMs与CTRL组相比分别显着富集，SM C14和SM C18分别增加了2倍和3倍（图   4E）。

总而言之，大多数鞘脂类物种在ATH和MCD NASH模型中富集。与ATH组相比，MCD组中神经酰胺的积累更为严重，这与神经酰胺合酶表达的增加相一致。

用MCD喂养的小鼠的肝脏中磷脂酰胆碱和具有长的单不饱和脂肪酰基链的磷脂物质被耗尽

磷脂酰胆碱（PC）是最丰富的一类膜磷脂，在我们的分析中占对照肝脏中所有脂质的52.44％（图   5A）。由于MCD饮食中胆碱的缺乏，PC水平降低（占所有脂质的38.77％），并且膜脂质富含磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰丝氨酸（PS，图   3C和5A）。因此，在MCD饮食中，两种最主要的脂质类别PC / PE之间的比率显着降低（图   5B）。ATH饮食显示出相似的趋势，但是并没有实质性地影响这两种磷脂的相对丰度（图   3C和5A）和PC / PE比（图   5B）。二酰基磷脂是最常见的膜脂质种类（图   5C），它们的增加/减少代表整体总类丰度（图   3C）。溶血磷脂显示出与二酰基磷脂相似的趋势，而其生物合成发生在过氧化物酶体中的醚磷脂（PL-O）则表现出不同的调节作用。在MCD组中，PC-O的相对量显着增加，而PE-O，PI-O和PS-O的相对量减少（补充图   S3C）。MCD饮食还深刻改变了脂肪酸链的长度和去饱和水平，从而改变了它们的相对丰度（补充图   S4）。）。为了评估去饱和度，我们比较了两个脂肪酰基链中具有2–6个双键的磷脂（称为多不饱和脂肪酸（PUFA））与只有1个双键（称为单不饱和脂肪酸（MUFA））。与去饱和酶SCD-1表达的急剧减少相一致（图   2），我们观察到含有MUFA的PL减少了两倍（图5D），这主要是由于MUFA PC的减少（图2D   ）。   5F），也包括MUFA PI（图   5H）中的磷脂。即使包含2–6个双键的PL的总含量没有增加（图   5D），用MCD喂养的小鼠的肝脏富含含有PUFA PL的PE，PI和PS（图   5G–I）。与CTRL和ATH组相比，MCD组中两个脂肪酰基链中碳原子总数为28-34的磷脂的含量明显少于CTRL和ATH组，这主要是由于PC LC脂质的大量减少（图。   图5E，F，H）。相反，具有38-44个碳的PE，PI和PS（称为超长链（VLC）磷脂）增加了（图   5G–I），而PC VLC脂质没有明显变化。共同地，这导致PC，PE和PI的VLC / LC比增加（补充图   S4I–K）。

肝脂质组学强调了ATH和MCD饮食对磷脂稳态的影响，包括磷脂组成，脂肪酸链长度和去饱和水平。脂质类别的相对浓度。（A）磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺的比例。（B）根据脂肪酸键的性质表示的PC，PE，PI和PS总量（二酰基与烷基-酰基（醚）或单酰基（溶血））（C），饱和度（D）或链长（E）与“ C-E”相同，但分别用于磷脂酰胆碱（F），磷脂酰乙醇胺（G），磷脂酰肌醇（H）或磷脂酰丝氨酸。I）PC：磷脂酰胆碱，PE：磷脂酰乙醇胺，PI：磷脂酰肌醇，PS：磷脂酰丝氨酸，SL：鞘脂，CL：心磷脂，二酰基：二酰基磷脂，醚：含烷基酰基的磷脂，溶血脂肪酸：溶血磷脂：单不饱和脂肪酸（两个脂肪酰基链上的1个双键的总和），PUFA：多不饱和脂肪酸（两个脂肪酰基链上的2-6个双键的总和），LC：长链（28-34个总和VLC：两条很长的碳原子数），VLC：很长的链（两条脂肪酰基的碳原子总数为36-44个碳原子）。单向方差分析：* p值ATH / MCD 与 CTRL <0.05，＃ p值MCD 与 ATH <0.05。

全尺寸图片

总之，胆碱缺乏会极大地改变不同磷脂类别的相对丰度，从而强烈影响PC / PE比。MCD肝脏富含与乙醇胺，肌醇或丝氨酸首基结合的磷脂，这些磷脂与具有非常长且多不饱和脂肪酰基链的脂肪酸结合。相比之下，ATH饮食对肝磷脂的影响较小，与CTRL组相比，仅含PE的MUFA发生了显着改变。

在本研究中，我们结合组织学，转录和脂质组学方法来分离由两种经典的NASH诱导模型即致动脉粥样化饮食和蛋氨酸和胆碱缺乏饮食引起的常见和特异性改变。我们表明，ATH和MCD饮食都增加了类似程度的肝脂质含量。然而，两种饮食之间的NASH严重性指标，特别是循环肝酶水平和纤维化标记物（代表人类疾病相关死亡率的最重要的组织学预测因子）有所不同。我们的转录研究表明，在两种NASH模型中，细胞外基质（ECM）产生和降解之间的平衡均失调，但是参与ECM重构的基因（TIMPS和MMP）与饲喂ATH的小鼠相比，饲喂MCD的小鼠的ECM产生（Collagens）以及HSC活化（骨桥蛋白）的失调更多。有趣的是，具有抗纤维化功能的Bmp6和Bmp7在我们的两个NASH模型中受到不同的调节。一方面，在ATH喂养的小鼠中，已显示出能抵抗HSC激活32的 Bmp6明显下调。另一方面，在MCD喂养的小鼠中，Bmp7被彻底和特异性地消除。BMP7可以平衡TGF-β产生/信令和具有抗纤维化作用33，34，35。事实上，其在原代HSC过表达减少了纤维形成标记物的表达36，而腺伴随过度表达禁止显示化学诱导的肝纤维化36，37。因此，在ATH和MCD模型中，Bmp6和Bmp7表达的降低可能分别导致了病理性纤维化。

为了突出两种NASH模型在脂质组成方面的相似性和特异性，我们对ATH和MCD喂养的小鼠的肝脏组织进行了广泛的脂质组学分析。分层聚类和主成分分析指出鞘脂（SL）水平升高是两种饮食NASH模型的共同特征。肝SL已知有助于炎症，胰岛素抵抗和氧化应激38，39，但可以有相当相反的生物学功能给出他们的头部基团或它们的脂肪酰基链长的生化性质40，41，42。丝氨酸棕榈酰转移酶Sptlc2和神经酰胺合酶CerS4-6的上调，以及二氢神经酰胺的富集表明在两个NASH模型中从头 SL合成的增加。神经酰胺合酶（CerS）将Sphinganine转化为二氢神经酰胺，每个CerS对选定的酰基CoA链长30具有高特异性。特别地，对于棕榈CerS6显示高底物偏好（C16：0）辅酶A 43，其产生有毒C16神经酰胺44，45，46，47，48，49，这是2x和2.6倍在ATH和MCD组更丰富，分别比CTRL组（图   4C）。该结果与CerS6在转录水平上的上调一致。相反，优先选择非常长的C22-C24酰基CoA的CerS2的表达没有明显改变，导致相应神经酰胺类（C22-C24）的肝脏水平仅适度相对增加。这些观察结果证实了在饮食诱导的肥胖（DIO）模型，db / db小鼠和其它遗传修饰的啮齿动物先前的研究44，45，46，47，48，49。请注意鞘磷脂磷酸二酯酶1（Smpd1）的过表达表明神经酰胺在MCD模型中也被鞘磷脂（SM）水解富集。奇怪的是，胆碱缺乏症并没有像预期的和在体外50和体内21所观察到的那样，降低了MCD喂养的小鼠肝脏中的SM含量，与CTRL组相比，MCD组甚至增加了1.9倍。这表明由于内源性储存的胆碱池有限，SM的合成得以保留。Smpd1旁系同源物以及两个鞘磷脂合酶的定量分析可能会破译这个难题。在人类中，NAFLD / NASH患者增加到目前神经酰胺的血浆水平51，52鞘磷脂53和SL是NAFLD 54进展的关键生物标志物。在血浆和肝脏中跨NAFLD状态呈现显着差异的脂质物种中，有三分之一是SL。使用线性判别分析，Gorden 等人。54显示SL是区分NAFLD状态的最佳脂质类别，而二氢神经酰胺是区分脂肪变性和脂肪性肝炎的最强生物标志物。始终如一的，Luukonnen及其同事55显示，与对照组相比，代谢性NAFLD（高HOMA-IR）患者的肝脏中几乎所有的神经酰胺和二氢神经酰胺种类均增加。

与SL相反，ATH和MCD饮食对磷脂的影响不同。类似于其他研究56，57，我们的脂质组分析证实，这两个最丰富的类脂质（PC / PE）之间的比例是强烈缺乏胆碱的减少。但是，PC / PE比仅受ATH饮食的影响很小。Li等[ 57]的研究表明，PC / PE比值的降低与循环中的ALT水平一致，并且参与了从脂肪变性到脂肪性肝炎的进展。此外，PC对于维持细胞膜完整性至关重要57，而在NAFLD和NASH人类肝脏中则降低了PC 58。降低PC / PE比也可以通过减少磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的缺乏（导致VLDL分泌减少）来减少PC的生物合成来实现59。与此相反，PC水平可以由MDR2 / ABCB4运送器的部分或全部破坏稳定57，60，其从肝细胞胆汁传送PL。由于与对照小鼠相比，MCD喂养的小鼠显示出不变的Mdr2 / Abcb4基因表达，因此在我们的上下文中未激活这种潜在的保护机制。此外，MCD饮食会影响脂肪酸的去饱和度。我们观察到硬脂酰辅酶A去饱和酶（Scd1）伴随着在其两个脂肪酰基链中结合有一个双键的脂质的减少（称为MUFA），导致单不饱和与饱和（MUFA / SFA）比率降低（补充图   S4）。这些结果与Rizki 等人的研究结果一致。20，而Larter 等人。图17显示了用MCD饮食与猪油或橄榄油组合喂养的小鼠的MUFA / SFA比增加。这种差异可能是由于饮食的不同脂质成分（玉米油：我们的研究和20 VS猪油或橄榄油），或小鼠的性别（男鼠：我们的研究和20 VS雌性小鼠17）。最后，我们对肝脏PL含量的研究表明，具有2–6个双键的脂肪增加（PUFA PE，PI和PS），这可能归因于MCD饮食中的脂肪成分或Δ6和Δ5去饱和酶的增加如Larter 等人的报道。17。在人类NASH中，肝活检的脂质组学分析也突出了脂肪酸合成途径中的失调61。特别地，延长酶ELOVL6和去饱和酶FADS1的酶活性分别降低和增加导致长链脂肪酸的积累和极长链脂肪酸的减少，从而产生了对肝细胞61的高毒性混合物。

就质谱分析而言，我们的组织学观察结果证实了文献中的描述。事实上，大泡，它主要与相关联的甘油三酯积累17，19，20，21，是更频繁的在MCD-喂养小鼠，而microsteatosis，代表cholesterylester积累的18，22，62在以ATH喂养的小鼠中更为明显。胆固醇及其衍生物（如胆汁酸（BA）和氧固醇）过量时对肝脏有毒。在ATH喂养的小鼠中，胆固醇生成基因被显着下调，而顶部的胆固醇输出被上调，反映了胆固醇在肝脏中的预期积累。胆甾醇的产生和胆汁的出口可减轻胆固醇的积累。尽管，由于饮食中胆酸对12 - α-羟化酶（Cyp8b1）表达的强烈反馈抑制作用，ATH组中BA合成的经典（中性）途径几乎被废除63。相反，ATH组胆汁酸合成的替代（酸性）途径被上调，与预期的氧固醇积累相一致。这些观察结果在小鼠和人中模拟的情况下，其中BA合成途径是脱开64，65。相比之下，MCD喂养的小鼠的肝脏同时显示经典和替代BA合成途径的急剧关闭。与田中等人一致。66，我们观察到BA基底外侧进口商的表达减少，而BA基底外侧进口商的表达增加。这些协同抑制肝BA合成和再摄取以及刺激BA外排可以通过炎症信号来限制BA超负荷67，68。

总之，ATH或MCD饮食代表了两种互补的饮食模型，可以快速概括人类NASH疾病的肝脏表现。图6总结了导致NASH的共享的和模型特定的病理生理改变 。根据多次命中假说，肝脏遭受了许多伤害，例如脂毒性，ROS和BA超负荷，导致肝星状细胞（HSC）活化，持续炎症和细胞外基质对胶原蛋白沉积的不平衡稳态。尽管脂质积累程度相似，但ATH和MCD模型仍显示出不同程度的NASH严重性，质疑与脂毒性有关的脂质种类。我们的脂质组学和基因表达分析强调了两种NASH模型上SL代谢的整体失调。与SL和特别是二氢神经酰胺是NAFLD疾病状态的生物标志物54的观察结果一致，我们的研究明确了从头开始神经酰胺合成可作为预防从单纯脂肪变性发展为脂肪性肝炎的潜在靶标。因此，SL生物合成的抑制多球壳菌素处理（一种丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂与已知的抗动脉粥样69，70，71和肝保护性能44，45，46，72，73）在ATH和MCD模型将是特定机械地描述SL在NASH发生和发展中的意义。

转录和脂质组学方法强调了ATH和MCD喂养的小鼠的常见和特异性改变。ATH饮食（左图）和MCD饮食（右图）诱导的基因表达（肝脏和回肠），肝脂质含量和血液参数的主要变化的插图。红色：两种饮食诱导的NASH模型中发散的变化。未经修改的图纸是从免费的医学图像数据库Servier Medical Art下载的。Servier的Servier医学艺术是根据知识共享署名3.0未移植许可证授权的。

全尺寸图片

动物

所有关于动物的实验均得到日内瓦州道德规范当局的批准（授权：GE / 202/17），并根据瑞士法律进行。来自Charles River Laboratories的10周龄C57BL / 6J雄性小鼠在正常条件下饲养，可以随意进食常规食物（CTRL：RM3，特殊饮食服务（SDS），11.5％脂肪，61.57％碳水化合物，26.93％蛋白）和水适应一周。

饮食

从Research Diets购买了蛋氨酸胆碱缺乏症（MCD：21％脂肪，63％碳水化合物，16％蛋白质）和致动脉粥样硬化（ATH：60％脂肪，20％碳水化合物，20％蛋白质，1.25％胆固醇和0.5％胆酸）的饮食。 Inc.（A02082002BR，D17052505）。将小鼠随机分为三个不同的组（CTRL，MCD，ATH）。CTRL和ATH组的小鼠分别饮食12周。由于MCD饮食迅速诱发NASH的肝脏表现以及重要的体重减轻，因此MCD组的小鼠接受CTRL饮食5周，然后接受7周MCD饮食。

组织收集

将小鼠禁食4小时（上午9点至下午1点），用异氟烷短暂麻醉并立即处死。收集腹部血液，在固定或冷冻保存于液氮中之前称重器官。

组织学

将肝，附睾白色脂肪组织（eWAT），腹股沟白色脂肪组织（iWAT），棕色脂肪组织（BAT）和回肠在10％福尔马林中固定过夜，并进行组织学处理。将5μm切片重新水化，然后用H＆E染色以观察总体形态，用Sirius Red / Fast Green进行纤维化定量或用高碘酸Schiff（PAS）进行糖原评估。为了定量脂质沉积，将未固定的肝脏块嵌入最佳切割温度（OCT）化合物中并快速冷冻。将5μm切片快速固定在10％福尔马林中，并用苏木精和油红O溶液染色。

定量和病理评分

使用Olympus VS120显微镜获取图片。用ImageJ软件74的面积测量工具进行纤维化，脂质和糖原定量。回肠绒毛和隐窝大小是用ImageJ软件在H＆E染色的切片上测量的。根据Bedossa 等人的方法，由对饮食不知情的病理学家（CdV）评估了SAF评分（脂肪变性，活动性（肿胀和小叶炎症）和纤维化）。75。

实时定量PCR

使用TRI试剂溶液（ThermoFisher AM9738）从肝脏和回肠组织中分离总RNA。将500 ng的总RNA反转录（PrimeScript RT试剂盒，Takara），并使用Light-Cycler 480（Roche Diagnostics）通过qPCR评估mRNA水平。使用核糖体RPS29基因进行标准化。引物列表可以在补充表S1中找到   。

血液参数

将血样收集在EDTA包被的试管中，血浆保存在-80°C下。使用Cobas c 111分析仪和适当的试剂（Roche Diagnostics）评估血浆葡萄糖，AST，ALT，总胆固醇，游离脂肪酸和甘油三酸酯的水平。使用超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒（Mercodia）测量胰岛素。

血脂分析

如Loizides-Mangold 等人所述进行脂质提取和脂质组分析。76。使用MTBE方案77制备脂质提取物。简而言之，将15-20 mg粉碎的肝组织重悬于100 µl H 2中O.添加360μl甲醇和内标物的混合物（400 pmol PC 12：0/12：0、1000 pmol PE 17：0/14：1、1000 pmol PI 17：0/14：1、3300 pmol PS 17：0/14：1、2500 pmol SM d18：1/12：0、500 pmol Cer d18：1/17：0和100 pmol GlcCer d18：1/8：0）以及1.2 ml MTBE。通过添加200 µl MS级水诱导相分离，然后在真空浓缩器（CentriVap，Labconco）中干燥有机相。将脂质溶解在氯仿/甲醇中，并分成三等份。根据Clarke和Dawson 78的方法，通过碱解处理一份等分试样以富集鞘脂其余两个等分试样分别用于甘油磷脂和磷测定。使用配备了多反应监测（ MRM）。关于碰撞能量，优化了每个单独的离子解离路径。将干燥的脂质提取物重悬于250 µl MS级氯仿/甲醇（1：1）中，并进一步稀释于氯仿/甲醇（1：2）加5 mM乙酸铵（负离子模式）或氯仿/甲醇/ H 2中。O（2：7：1）加5 mM乙酸铵（正离子模式）。相对于相关内标物计算脂质浓度，并相对于每种脂质提取物的磷酸盐含量进行归一化，以说明原料量的变化并在提取过程中校正样品损失。

统计分析

使用GraphPad Prism 7.02版软件通过单向方差分析对数据进行统计分析，认为p <0.05具有统计学意义。如果没有另外说明，则图表表示平均值+平均值的标准误（SEM）。使用“ gplots”包的heatmap.2函数在R中生成了聚集的热图。使用默认参数79的PAST程序执行主成分分析。