《科学报告》 9 ，文章号： 16832（ 2019）
在几种癌症适应症中，治疗性靶向受体酪氨酸激酶已被证明对克服化疗耐药性至关重要，从而改善了患者的预后。胰岛素样生长因子受体1（IGF-1R）和表皮生长因子受体3（ErbB3）被认为是两种这样的耐药性驱动因子，但是，它们在卵巢癌化疗耐药性中的同时作用仍未得到很好的阐明。这项工作的目的是确定双重IGF-1R / ErbB3抑制作用对卵巢癌细胞信号传导，生长和体内功效的影响。体外评估一组卵巢癌细胞系的化疗反应显示，IGF-1R细胞表面表达增加与对化疗的敏感性降低相关，并且IGF-1R和ErbB3配体诱导的生长被靶向IGF-1R和ErbB3的四价双特异性抗体所阻断，istiratumab。体外化学疗法的治疗提高了卵巢癌细胞系激活配体响应的生存PI3K信号的能力，这可以通过istiratumab治疗来预防。此外，使用依西拉他单抗增强了使用卵巢癌异种移植模型的标准护理化学疗法的体内疗效。我们的结果表明，IGF-1R和ErbB3在驱动卵巢癌的化疗耐药性中具有作用。
卵巢癌是女性中第五常见的恶性肿瘤，是癌症相关死亡的主要原因之一1。在2018年，美国有22,000多名女性被诊断出患有卵巢癌，其中有14,000名与卵巢癌相关的死亡2。由于症状出现较晚，超过三分之二的患者被诊断出患有局部晚期或转移性疾病2，并且已建立的治疗方案包括铂类和紫杉烷类化学疗法的组合（NCCN指南）。最初的治疗反应很普遍，但是通常会伴随疾病的复发。这强调了对卵巢癌的病理生理学和新型治疗方法的深入了解的迫切需求。
受体酪氨酸激酶可能在卵巢癌的病理生理中起关键作用。其中，胰岛素生长因子1受体（IGF-1R）与卵巢癌3的发生，发展，转移和化疗耐药有关。IGF-1R及其激活配体（IGF-1，IGF-2）以及调节胰岛素生长因子结合蛋白（IGFBP）在卵巢恶性肿瘤中表达，支持了IGF-1R信号可能是有希望的治疗靶点的假设4，5。结果，已经开发了在卵巢癌中使用封闭抗体或小分子信号抑制剂来抑制IGF-1R信号的策略。尽管IGF-1R靶向显示出期望的临床前活性的方法，他们迄今未能提供临床益处3，6。
卵巢癌中IGF-1R信号转导的复杂性需要对这种途径的深入了解和知识。IGF-1R可以与其他受体酪氨酸激酶（RTKs）相互作用并异源二聚体，这可能会改变配体亲和力并激活下游信号传导3。此外，在阻断IGF-1R途径后，其他RTK可能通过重新激活生存前PI3K / AKT信号传导来补偿。近年来越来越多的证据表明，ErbB3信号传导在卵巢癌中具有独特的作用。已发现涉及ErbB3及其活化配体HRG的自分泌信号转导环可促进人卵巢癌细胞的细胞增殖，并且通过遗传或药理作用抑制ErbB3废除了HRG / ErbB3的作用7。而且，从卵巢癌患者的组织分析显示与患者的存活率下降的ErbB3或HRG表达的关联8，9。进一步的研究已经揭示ErbB3和其配体的HRG高患病率在卵巢癌10，11。
在这项研究中，我们表征了IGF-1R和ErbB3对卵巢癌生长和治疗抵抗的影响，并揭示了使用istiratumab（一种完全以人为双特异性四价IGF-1R和ErbB3靶向的药物）使卵巢癌细胞对临床相关化疗重新敏感的策略抗体，单克隆IgG1抗体组成，工程改造以含有两个单链Fv片段12，13。以前已证明伊司他单抗具有两种作用方式：（i）阻断IGF-1，IGF2和HRG与其受体的结合；（ii）诱导含有IGF-1R和ErbB3 13的受体复合物降解。我们的数据表明双重IGF-1R / ErbB3抑制对卵巢癌治疗有潜在的好处，并强调了istiratumab与标准护理化疗联合治疗卵巢癌的潜在影响。
为了研究卵巢癌中细胞表面受体酪氨酸激酶表达对化疗敏感性的相对重要性，我们确定了一组十五种卵巢癌细胞系对顺铂或紫杉醇的增殖反应（图 1A）。通过定量流式细胞术测定IGF-1R和ErbB3的细胞表面表达（图 1B）。将图1A的化疗剂量反应曲线下面积（AUC） 与图1B的受体表达作图 ，并确定了化疗耐药性与RTK表达之间的相关性。这些研究确定了化疗耐药性与IGF-1R的表达水平之间有统计学意义的正相关（顺铂为p <0.0006，紫杉醇为p <0.0014），而ErbB3没有（图 1C）。对其他RTK的研究揭示了AUC和cMET表达之间呈正相关，而与EGFR或HER2无关（补充图 1A）。对所有受体表达相关性与体外化疗敏感性的多维偏最小二乘回归分析显示，IGF-1R表达是权重最大的因子（补充图 1B）），紧随其后的是cMET表达。还对11种细胞系的生长因子mRNA表达进行了分析（图 S3），显示7/11可以表达自分泌HRG，而只有3/11可以表达自分泌IGF-1。
IGF-1R表达与卵巢癌细胞株对化疗的敏感性降低有关。（A）按照指示用紫杉醇或顺铂一式三份处理十五个卵巢癌细胞系72小时，并将原始发光值相对于运载体对照细胞标准化。（B）通过定量流式细胞术评估了十个卵巢癌细胞系中IGF-1R和ErbB3的细胞表面表达。（C）来自A的细胞系对紫杉醇或顺铂的反应性与来自（B）的细胞表面受体表达相关。
对卵巢癌患者样品进行了IGF-1R，ErbB3及其各自配体的调查。所有测试的患者样品的IGF-1R蛋白表达均为阳性（n = 11），其中27％2+和73％3+。关于ErbB3表达，测试的患者样本中有58％为2+阳性，而33％为3+（n = 12）。所有测试样品的IGF-1 mRNA表达均为阳性（n = 11），分别为9％2+和18％3+。同样，有91％的患者样本IGF2 mRNA表达阳性，其中18％的得分为3+和55％的得分为4+。55％的患者样品HRG mRNA表达阳性，得分为1+（图 2A，表 S1）。染色的代表性图像在图2B中示出 。
IGF-1R，ErbB3及其相关配体在卵巢肿瘤患者样品中表达。（A）卵巢肿瘤样本中IGF-1R，ErbB3，IGF-1，IGF-2和HRG的患病率定义为IHC（IGF-1R和ErbB3）的得分介于0到3+之间或0到4之间+（IGF-1，IGF-2，HRG）。（B）来自A的代表性图像显示阳性染色。注意IGF-1R和ErbB3蛋白染色的弥漫性棕色染色，以及IGF-1，IGF-2和HRG RNA 原位杂交的点状棕点。
用IGF-1（图3A）或HRG（图 3B）刺激一组十个卵巢癌细胞系，并 在72小时后通过CellTiter-Glo®发光细胞生存力测定法评估增殖。十分之六的细胞系显示出响应IGF-1处理的增殖显着增加，十分之七的细胞显示出响应HRG刺激而显着增强的增殖。在除一个细胞系（PEA2-cis）之外的所有细胞系中，与存在IGF-1的未处理细胞相比，与双特异性和四价IGF-1R / ErbB3 IgG istiratumab共同处理可导致癌细胞增殖减少（图 3A） ，而除一种细胞系（PEA1）以外，在存在HRG的情况下，与未处理的细胞相比，其增殖减少了（图。 3B）。值得注意的是，即使不存在重组IGF-1，双重IGF-1R / ErbB3抑制作用也会显着降低6种细胞系的细胞增殖（图3A），而在没有重组HRG的情况下，对于4种细胞系，情况就是如此（图3A）。 。 图3B）。有趣的是，未 观察到受体IGF-1R或ErbB3（分别为r 2 = 0.008965，p = 0.7947和r 2 = 0.3197，p = 0.0885）的表达水平和对iriratumab的敏感性之间的统计学显着相关性（图 S4）
伊司他单抗抑制卵巢癌细胞系的配体驱动的增殖。如指示的那样，用50nM IGF-1（A）和10nM HRG（B）在有和没有1uM istiratumab的情况下一式两份处理在4％FBS中生长过夜的卵巢癌细胞72小时，并通过CellTiter-Glo®发光细胞评估增殖生存力测定。使用GraphPad Prism软件通过双向方差分析确定显着性（* p <0.033，** p <0.002，*** p <0.001）。
用IGF-1或HRG刺激7个血清饥饿的卵巢癌细胞系15分钟，然后通过蛋白质印迹评估下游信号传导级联。在所有七个细胞系中均响应IGF-1和/或HRG诱导了AKT和/或ERK磷酸化（图 4）。添加双重IGF-1R / ErbB3抑制剂istiratumab能够阻断PI3K和MAPK信号级联反应的激活（图 4）。观察涉及的上游受体酪氨酸激酶，依西拉单抗治疗抑制了IGF-1R和/或ErbB3的磷酸化，以响应IGF-1和HRG的刺激。我们的数据表明用istiratumab治疗导致某些细胞系中总IGF-1R和/或ErbB3蛋白水平降低（图 4）。有趣的是，在图3中显示出对istiratumab单药疗法最大的增殖抑制作用的细胞系 （PEO1，OVCAR8和OV90）也显示出最强的基础p-IGF1R，表明该受体的基础激活水平与药物功效之间存在联系。
Istiratmab抑制卵巢癌细胞系中基础和配体诱导的IGF-1R和ErbB3信号传导。用1uM istiratumab处理细胞60分钟，然后用50 nM IGF-1和/或10 nM HRG处理细胞15分钟，然后裂解并通过Western blot检测PI3K和MAPK信号传导的激活。电泳后将蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，将膜按预期水平的每种靶蛋白分子量水平切成薄片，以便从单个凝胶上印迹多个靶蛋白，从而增加了可评估蛋白的数量无需剥离膜即可从单个样品中提取。如方法部分中所述，在将每个切片与合适的第一抗体，然后是荧光标记的第二抗体一起孵育之前，先对其进行成像。图中显示的每个方框均显示了整个薄膜切片，每个单独的切片都由图像周围的空白区域勾勒出。为便于解释，当在同一凝胶上加载不同细胞系时，切片后的黑色竖线画出轮廓，并用“ +”号表示不同的处理方式。
为了评估细胞系在用顺铂，紫杉醇或阿霉素处理后对IGF-1和HRG的反应如何，将OV90，OVCAR8和PEO4细胞与化学疗法一起培养过夜，然后进行15分钟的IGF-1（图 5A）或HRG（图5A）。 5B）刺激。裂解细胞，并通过ELISA评估AKT磷酸化。与蛋白质印迹分析一致（图 4），IGF增加了OV90，OVCAR8和PEO4细胞中的AKT磷酸化（图 5A），而HRG增强了OVCAR8和PEO4细胞中的AKT磷酸化（图 5B）。）。值得注意的是，在18种化疗配体联合条件中的9种中，在存在生长因子的情况下，化学疗法进一步增强了pAKT的显着增加，这种作用对紫杉醇最强（图 5A，B）。在所有三种细胞系中，依斯拉单抗双重抑制IGF-1R和ErbB3会使pAKT降低至背景水平（图 5A，B）。值得注意的是，单独化疗并没有增加AKT磷酸化水平，具有统计学意义（图 S5）。
伊斯特拉他单抗抑制通过化学疗法和配体共同治疗增强的AKT活化。如单独或与istiratumab，顺铂，紫杉醇或阿霉素组合使用IGF-1（A）或HRG（B）所示，一式三份处理细胞24小时，然后裂解并通过ELISA分析AKT Ser473磷酸化。
我们测试了双重IGF-1R / ErbB3抑制对三种不同临床相关化学疗法在荷皮下OV90肿瘤小鼠体内的抗肿瘤活性的体内作用。选择OV90模型是因为它在体内生长良好，并且显示出对不同化学疗法的敏感性。相比于对照（图6B），紫杉醇导致肿瘤控制（图 6A），脂质体阿霉素脂质体显着延迟了肿瘤的生长 ，而OV90肿瘤在体内对顺铂耐药（图 6C）。Istiratumab单一疗法可导致肿瘤停滞，而双重IGF-1R / ErbB3抑制与化学疗法的结合会导致所有这三种组合的肿瘤消退（图2）。 6）。
Istiratumab与化学疗法相结合可在卵巢癌体内模型中消退肿瘤体积。将小鼠裸露的OV90肿瘤分成平均体积相等的组（n = 10），并每三天一次用生理盐水，30 mg / kg紫杉醇腹膜内治疗，每7天一次腹膜内紫杉醇20 mg / kg紫杉醇治疗（A）5 mg / kg每7天（B）腹腔内顺铂（C）或每3天静脉注射3 mg / kg聚乙二醇化脂质体阿霉素。每周两次测量肿瘤体积。为了清楚起见，在每个子图中表示相同的对照小鼠和经itratratumab治疗的小鼠。
转移性卵巢癌患者化疗后的高复发率强调了对新疗法的需求。受体酪氨酸激酶（RTKs）是卵巢癌进展和治疗耐药性的关键效应物。在这里，我们显示了IGF-1R，ErbB3及其配体在卵巢癌患者样品中的显着比例中表达。在代表不同亚型的卵巢癌包括腺癌（A2780，A2780Cis，OVCAR8，OVCAR5，PEO14，PEO23，PEA1，PEA1，PEA2，SKOV3）的一组细胞系中均显示了IGF-1R表达增加与对顺铂和紫杉醇敏感性降低的相关性），浆液性（OVCAR3，OV90，PEO1，PEO4），透明细胞（TOV-21G）和子宫内膜样癌（TOV-112D）卵巢癌亚型，表明该研究在该疾病适应症中具有广泛的适用性。
IGF-1R是在卵巢癌中表达强烈的RTK，先前已证明IGF-1R的高表达与对顺铂化疗的耐药性相关14。IGF-1R敲除或信令抑制可以抑制卵巢癌细胞增殖15，16和致敏癌细胞于基于铂的化疗17。尽管有令人鼓舞的临床前报道，但临床试验并未为使用IGF-1R抑制剂治疗的卵巢癌患者提供有意义的益处。当IGF-1R抑制剂在化疗后被用作单一疗法时就是这种情况18，并且与其他靶向疗法联合使用时19。。IGF-1R抑制剂在临床试验中的失败很大程度上归因于RTK信号通路的复杂性，包括通过其他RTK激活的补偿性通路。单特异性靶向疗法可能集中在狭窄的地方，平行的信号通路可能促进癌细胞从治疗中逸出。
IGF-1R可与多种在卵巢癌中过表达的RTK相互作用，例如EGFR，HER2，ErbB3和c-Met 3。基于越来越多的证据表明ErbB3 / HRG信号转导轴在该疾病中的关键作用，我们的研究集中于IGF-1R和ErbB3之间的相互作用。ErbB3属于细胞表面受体蛋白的ErbB家族，但是，与其他ErbB家族成员相反，它缺少功能性激酶域20。一旦配体调蛋白（HRG）的结合，与其它RTK的ErbB3异二聚体被促进，从而导致促存活PI3K / AKT信号传导和对各种治疗形式的电阻的强效激活，包括细胞毒性化学疗法12，21。在使用慢病毒递送的短发夹RNA库靶向RTK的卵巢癌细胞的筛选揭示的ErbB3作为相关目标和HRG的遗传和药理学抑制/ ErbB3的轴的激活导致肿瘤生长抑制7，22。
的ErbB3激活涉及通过增加蛋白过度表达ERBB3由其它RTK的转录和激活通过增加分泌或旁分泌HRG信令，以及配体非依赖性激活21，23，24，或通过在蛋白的胞外结构域的突变25。尽管多个RTK的过表达在卵巢癌中相对于正常卵巢组织8，26，27，28，29，尚无明确的成瘾性癌蛋白能在该疾病中得到明确验证，因此，各种RTK的相对影响仍然未知。我们对多种卵巢癌细胞系中RTK表达与化疗敏感性之间相关性的分析表明，IGF-1R和cMET表达具有相关性，但与ErbB3没有相关性。这与以前的发现一致，表明ErbB3的过表达可能不足以单独促进癌细胞的增殖和存活，但需要HRG激活。激活配体的耗竭引起ErbB3激活的卵巢癌细胞系中的增殖停滞，而具有高ErbB3表达水平但不表达激活配体的细胞系不显示ErbB3激活并且对靶向ErbB3的细胞不敏感7。因此，尽管我们在人体样品中的表达分析表明，在相当大比例的卵巢癌中，ErbB3的表达很强，但这一结果也得到以前的发现的支持29，单独的ErbB3表达可能不足以代表用抗ErbB3分子治疗的生物标志物。我们假设ErbB3配体调蛋白（HRG）可能起重要作用，需要进行严格的研究。对晚期铂耐药或难治性卵巢癌患者进行的全人类单克隆，配体竞争性抗ErbB3药物西立班单抗联合紫杉醇的随机2期试验的回顾性单变量生物标志物分析表明，HRG水平可检测的患者已有进展无生存危险比有利于实验组，而无法检测到的HRG有利于对照组9。进一步的证据表明，编码HRG，NRG1的基因发生了重排可以驱动癌症的生长，早期的临床数据支持在NRG1重排的恶性肿瘤患者中使用ErbB3靶向方法30。总之，这些发现强调了进一步研究和阐明HRG在恶性肿瘤中的影响的必要性，并在设计针对ErbB3的临床试验时认真考虑了这一点。基于最近的证据显示肿瘤微环境可通过激活HRG / ErbB3轴对PI3K信号抑制剂产生从头耐药31，至关重要的是，进一步的科学努力应包括研究肿瘤微环境在HRG / ErbB3介导的HRP / ErbB3介导的作用中的作用。癌症，包括卵巢癌。
已经在各种恶性肿瘤中报道了IGF-1R和ErbB3信号传导之间的紧密相互作用。机理研究表明，CD74-NRG1融合基因可促进肿瘤中NF-kB信号通路的激活，进而增强胰岛素样生长因子2（IGF-2）的分泌及其受体IGF-1R 32的磷酸化。此外，最新数据表明，NRG以NF-kB依赖性方式刺激IGF2 mRNA 的转录33。NF-kB的结合位点基序中IGF-2的启动子序列被识别，从而增加IGF-2的生产在转录水平。在IGF-1R / ErbB3的相互作用也通过数据显示，ErbB3的上调可能在恶性肿瘤IGF-1R受体阻断和副补偿反之亦然强调12，13，34。此外，化学疗法已被证明能增加两者IGF-1R和ErbB3的表达在肿瘤细胞系中，使得这些耐细胞毒性治疗12。总之，这些数据表明，ErbB3是治疗IGF-1R阳性肿瘤（例如卵巢癌）的潜在关键RTK。
先前的临床前研究表明，依西拉他单抗在胰腺癌模型中具有非常有前途的潜力12。这些数据构成了CARRIE研究的基础，该研究是一线转移性胰腺癌患者中游离IGF- 1血清水平（www.linicaltrials.gov； ID：NCT02399137）。尽管临床前活动前景看好，但依西拉他单抗未能改善转移性胰腺癌患者一线治疗中的标准治疗化学疗效35。在胰腺癌istiratumab的临床失败的原因仍然不清楚，有待进一步分析。然而，该结果强调需要仔细仔细地临床探索每种适应症中潜在生物标记物的影响，包括癌细胞相关的标记物和肿瘤微环境介导的标记物。在这方面，必须严格考虑其他RTK的相对作用。例如，关于卵巢癌和ErbB3，抗ErbB3分子西立班单抗联合紫杉醇在晚期铂耐药或难治性卵巢癌患者中的2期随机试验显示，对于肿瘤中可检测到HRG mRNA的患者，其治疗获益增加和低HER2 9。
总之，我们的结果表明，IGF-1R和ErbB3之间的相互作用可能充当卵巢癌中肿瘤生长和对化学疗法耐药的调节剂。两种途径的抑制都可能使卵巢癌肿瘤对化学疗法敏感，这在选定的患者人群中代表了一种有吸引力的治疗方法。
OV90细胞获自美国典型培养物保藏中心，OVCAR3，OVCAR5和OVCAR8细胞获自美国国家癌症研究所，PEA1，PEA2，PEO1，PEO4，PEO14和PEO23细胞获自欧洲认证细胞培养物保藏中心。使用前确认细胞株支原体阴性，按照生产商的建议进行维护，并在初次铺板后繁殖少于8周。IGF-1和HRG从R＆D Systems获得。Istiratumab由Merrimack Pharmaceuticals生产，紫杉醇购自LC实验室，聚乙二醇化脂质体阿霉素购自SunPharma，顺铂购自Sigma。
将细胞接种到4％FBS中的无凝胶支架型微方形96孔纳米培养板（SCIVAX）中，生长24小时以形成三维细胞球体，然后按图例所示进行处理。根据制造商的说明，通过CellTiter-Glo®发光细胞活力测定试剂盒（Promega）评估细胞增殖，并在Synergy™H1读板仪上测量发光。
细胞表面受体的水平，通过流式细胞术如先前所述进行定量36。Quantum Simply Cellular IgG珠标准品（Bangs实验室）以及Alexa 647或别藻蓝蛋白（APC）偶联的抗体，可量化每个细胞的表面受体数量。使用FACSCanto™系统（BD Biosciences）分析珠子和细胞。使用FlowJo软件（8.2版）分析数据。
对于ELISA，将细胞以30,000个细胞/孔的速度接种到96孔组织培养板（Costar）中，并添加4％FBS。第二天，在含0％FBS的培养基中通过24小时血清饥饿使细胞同步。为了进行蛋白质印迹，将细胞接种到10％FBS培养基中的10 cm皿中，使其生长24小时，然后用0.5％FBS培养基替换培养基。用冷PBS洗涤终止信号转导实验，并用补充了磷酸酶和蛋白酶抑制剂沉淀物（Roche）和150 mM氯化钠（Sigma）的哺乳动物蛋白提取试剂（Thermo Scientific）生成细胞裂解物。
如先前所述进行ELISA 12。简而言之，用捕获抗体包被高结合测定板（Corning）并孵育过夜，然后用PBS中的2％牛血清白蛋白（BSA，Sigma）封闭1小时。将板与在2％BSA，0.1％Tween-20 PBS中稀释了两倍的裂解液孵育2小时，然后与一级检测抗体孵育2小时，然后与二级检测抗体孵育30分钟。将化学发光底物（Pierce）添加到每个平板中20分钟，并使用Synergy™H1平板阅读器测量发光。在每次温育之间，用含有0.05％Tween-20的PBS溶液将板洗涤4次，所有温育均在室温下进行。
如先前所述，通过蛋白质印迹分析样品12。简而言之，将澄清的细胞裂解液在LDS样品缓冲液（Life Technologies）中于95°C煮沸5分钟，然后使用MES运行缓冲液（Bio-Rad）在4-12％的凝胶（Bio-Rad）上进行电泳分离。使用设备（Life Technologies）将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（Life Technologies）上，并将膜在封闭缓冲液（LI-COR Biosciences）中于室温封闭1小时。在5％BSA（Sigma），0.1％Tween-20 tris缓冲盐水溶液（TBS-T）中，将一抗（Cell Signaling Technology）的膜在4–8摄氏度下过夜，在TBS中洗涤3次，每次10分钟-T，然后在5％牛奶（Cell Signaling Technologies）TBS-T中与抗兔二抗（Licor）孵育45分钟。在TBS-T中再洗5分钟后，条带在LI-CORODYSSEY®CLx成像仪上可视化。使用Image Studio（版本3.1.4）软件对蛋白条带进行定量。
所有动物研究均按照指南进行，并获得Merrimack Pharmaceuticals机构动物护理和使用委员会的批准。雌性无胸腺裸鼠获自查尔斯河实验室，并在无病原体的环境下于受控条件下饲养，并随意进食和饮水。皮下注射5×10 6建立肿瘤将悬浮在200μL1：1生长因子中的细胞还原到未添加的培养基中的Matrigel™（Corning）：剃去的一只剃须后腹。一旦测得的平均肿瘤体积（根据公式：π/ 6×（长×宽×宽）计算）达到〜230 mm3，就将小鼠随机分组，并按照图例中的概述进行治疗。每组的平均起始肿瘤体积在所有组中均相等。每周两次测量肿瘤体积。
卵巢肿瘤样品可从Avaden Biosciences商购，并按照前述方法进行测定13。简而言之，将肿瘤组织样品用福尔马林固定，石蜡包埋，切成4-5μm的厚度，并使用Leica Bond Rx或Ventana Benchmark Discovery Platform进行分析。用于免疫组化（IHC）的抗体如下：抗IGF-1R（Ventana，G11），抗ErbB3（Cell Signaling Technology，D22C5）。由委员会认证的外科临床病理学家使用临床HER2评分系统对所有IHC染色标本进行评分，该评分系统将每个样品分为0-3分。使用原位检测IGF-1（＃313037），IGF-2（＃594367）和HRG（＃311187）转录本杂交按照Advanced Cell Diagnostics提供的协议，对Leica Bond Rx（＃321100）进行自动RNAscope®自动检测。对于每个组织标本，对阳性对照（PPIB，＃313907）和阴性对照（DapB，＃312037）进行评估，以评估组织质量和检测性能，同时对每个目标探针进行评分，并按5层评分进行评分系统（分数0–4）基于每个单元格的点计数。基于如下所述的手动计数对RNA量进行评分。根据在明场显微镜下可视化的点数，将染色结果分为五个等级。0：无染色或每10个细胞少于1个点（放大40倍）；1+：每格1-3个点（以20-40倍放大倍数可见）；2+：每单元4-10个点，很少的点簇（以20-40倍的放大倍数可见）；3 +：> 10个点/细胞，少于10％的阳性细胞具有点簇（以20倍放大倍数可见）；和4 +：> 10个点/细胞，超过10％的阳性细胞具有点簇（在20倍放大率下可见）。
使用图例中的GraphPad Prism 7软件（7.03版）执行统计显着性，曲线计算下的面积以及曲线拟合分析。
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