《科学报告》 9 ，文章号： 16825（ 2019）
我们先前报道了具有咔唑和苯并肼结构的新型抗有丝分裂剂的鉴定：N '-[（9-乙基-9 H-咔唑-3-基）亚甲基] -2-碘苯并肼（代码NP-10）。但是，NP-10对癌细胞选择性抑制有丝分裂进程的潜在机制尚不清楚。在这里，我们通过使用NP-10-固定珠从HeLa细胞裂解物中进行亲和纯化，鉴定了NP-10-相互作用蛋白，然后进行了质谱分析。结果表明，一些与有丝分裂相关的因子特异性结合有活性的NP-10，但没有结合无活性的NP-10衍生物。其中，NUP155和importinβ可能参与NP-10介导的有丝分裂阻滞。因为NP-10 在体内未显示抗肿瘤活性在先前的研究中，我们合成了19种NP-10衍生物以鉴定更有效的NP-10-相关化合物。HMI83-2是一种具有Cl部分的NP-10-相关化合物，可抑制裸鼠中HCT116细胞肿瘤的形成，而不会显着降低体重，这表明HMI83-2是开发新型抗有丝分裂剂的有前途的先导化合物。
对复制的染色体DNA进行忠实的分离对于维持基因组完整性至关重要。该过程由纺锤体纺锤体执行，纺锤体由纺锤体微管和中心体在有丝分裂激酶（如Cdk1，Aurora激酶和Polo样激酶（Plks））的控制下进行。此外，忠实的染色体分离需要许多微管相关蛋白（MAPs），包括驱动蛋白和动力蛋白。有丝分裂纺锤体的抗癌化学疗法的最成功的目标中，并且它们保持的新颖抗癌药物有希望的目标1，2，3，4。
紫杉烷类，长春花生物碱类，埃博霉素类和halichondrins是临床实践中使用的代表性抗有丝分裂药物，它们都是微管蛋白结合分子，会阻碍精确的微管蛋白聚合。虽然这些抗有丝分裂剂对癌症治疗有效，但是一些关键问题仍有待解决。例如，经常观察到对这些药剂的先天或后天抵抗。由于微管还在包括神经元细胞在内的非分裂细胞中起作用，因此这些靶向微管的药物会扰乱此类细胞中的一些重要细胞过程，从而导致诸如周围神经病的副作用。因此，付出了大量努力正在进行开发新颖抗有丝分裂的是目标的非微管蛋白有丝分裂因子如Plks，Aurora激酶，CENP-E，和Eg5的1，2，3，4。
我们以前报道新颖抗有丝分裂剂的鉴定用咔唑和苯甲酰肼结构，包括Ñ ' - [（9-乙基-9- ħ咔唑-3-基）亚甲基] -2-碘苯甲酰肼（代码号NP-10），Ñ ' - [（9-乙基-9 H-咔唑-3-基）亚甲基] -4-碘代苯并肼（编号NP-14）和N '-[（9-乙基-9 H-咔唑-3-基）亚甲基] -2-甲基苯甲酰肼（代码编号HND-007）。其中，NP-14和HND-007 在体外抑制微管蛋白聚合，这表明用这些化合物处理的细胞中的有丝分裂停滞部分是由于这种抑制微管蛋白聚合的活性5。但是，NP-10不能抑制微管蛋白的聚合，在NP-10-处理过的细胞中微管的形成仅被部分抑制5。此外，NP-10不会影响Aurora B，Plk1和Cdk1的激酶活性或CENP-E，Eg5和KIFC1驱动蛋白的ATPase活性5。NP-10对癌细胞选择性抑制有丝分裂进程的潜在机制尚不清楚。在这里，我们通过使用NP-10-固定珠从HeLa细胞裂解物中进行亲和纯化来鉴定NP-10-相互作用蛋白，然后通过质谱法解决了这个问题。结果表明，一些与有丝分裂相关的因子特异性结合有活性的NP-10，但没有结合无活性的NP-10衍生物。进一步的分析表明，NUP155和importinβ与NP-10-介导的有丝分裂阻滞有关。
HeLa细胞获自JCRB细胞库（JCRB9004，已通过STR-PCR验证）。HCT116细胞获自ATCC。从雅夫濑博士，爱知县癌症中心研究所，HFF2 / T（端粒酶永生化的正常人成纤维细胞）建立的内部细胞获得HEK293T细胞5。它们生长在Dulbecco改良的Eagle's培养基中，培养基中添加了8％胎牛血清和抗生素。先前在6中建立了过表达人乳头瘤病毒16型E7的HFF2 / T / E7 / KRAS G12V细胞和活化的KRAS突变体G12V，并使其在同一培养基中生长。
基本上如先前所述进行生长抑制测定5。简而言之，将细胞以5×10 3个细胞/孔的密度接种在96孔板中24小时，然后用溶解在DMSO中的所示化合物处理48小时。对照细胞用终浓度为1％的DMSO处理。然后加入MTS / PMS溶液（CellTiter非放射性水细胞增殖测定，＃G5430，Promega），将细胞进一步温育1小时，并测量OD 490以确定活细胞的数量。估计每种药物浓度的抑制百分比，并使用回归分析根据剂量反应曲线的线性部分计算IC 50值。
对于图 1B，将转染的HeLa细胞（见下文）重新铺在含有不同浓度NP-10的培养基中的12孔板（800细胞/孔）上。7天后，将菌落用Giemsa溶液（Wako Pure Chemical Industries）染色。对于图 2，将HFF2 / T和HFF2 / T E7 / KRAS G12V细胞以400个细胞/孔的密度接种在12孔板上的各种浓度的含有NP-10的培养基中。8天后，将菌落用Giemsa溶液染色。估计每种药物浓度下的抑制百分比。然后，使用回归分析从剂量反应曲线的线性部分计算出IC 50值。
NUP155 MC（aa 748–1391）的过表达赋予HeLa细胞NP-10细胞毒性部分抗性。（A）将HeLa细胞用指定的表达载体转染48小时，并用抗GFP抗体进行免疫印迹。蛋白用考马斯亮蓝（CBB）染色以检查相等的负载。（B）将HeLa细胞用指定的表达载体转染24小时，并在各种浓度的NP-10存在下进行集落形成测定。计算IC 50值。数据代表来自9个独立实验的平均值±SD。*** p <0.001（两尾学生t检验）。
与亲代HFF2 / T细胞相比，转化的HFF2 / T / E7 / KRAS G12V细胞对NP-10敏感。在各种浓度的NP-10存在下，将亲本HFF2 / T和HFF2 / T / E7 / KRAS G12V细胞进行集落形成测定，并计算IC 50值。数据代表来自多个独立实验的平均值±SD（对于HFF2 / T，n = 4，对于HFF2 / T / E7 / KRAS G12V，n = 3）。** p <0.01（两尾学生t检验）。
细胞周期分析基本上如先前所述进行5。简而言之，将细胞用所示化合物处理24小时，然后悬浮在含有0.1％TritonX-100，RNase（10μg/ mL）和碘化丙啶（40μg/ mL）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。使用FACSCalibur或FACSVerse流式细胞仪（BD Bioscience）检查细胞周期分布。
合成了以下化合物，用于从HeLa细胞裂解物中亲和纯化结合蛋白（图 3A）：1-（1-（13-Oxo-17-（（3a S，4 S，6a R）-2-氧六氢- 1 H-噻吩并[3,4- d ]咪唑-4-基）-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十七烷基）-1 H -1,2,3-三唑-4-基）-2,5 ，8,11-四氧杂环丁烷-13-基（Z）-N -（（E）-（9-乙基-9 H-咔唑-3-基）亚甲基）-2-碘苯并肼基甲酸酯，为O-聚乙二醇化的NP-10通过1,2,3-三唑部分（代码号HMI1347）与PEG化生物素连接; N-（2-（2-（2-（2-（4-（（E）-1-（9-乙基-9 H-咔唑-3-基）-3-（2-碘苯甲酰基）-6,9,12,15-四恶唑-2,3-二氮杂十六烷基-1-en-16-基）-1 H -1,2,3-三唑-1-基）乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙基）-5-（（3a S，4 S，6a R）-2-氧代六氢-1 H-硫代诺[3 ，4- d ]咪唑-4-基）戊酰胺，它是N -PEG化的NP-10，通过1,2,3-三唑部分与PEG化的生物素连接（代码为HMI1345）；1-（1-（13-氧代-17-（（3a S，4 S，6a R）-2-氧代六氢-1 H-硫代[3,4- d ]咪唑-4-基）-3,6， 9-三氧杂-12-氮杂十七烷基）-1 H-1,2,3-三唑-4-基）-2,5,8,11-四氧杂癸-13-基（Z）-N -（（E）-（9-乙基-9 H-咔唑-3- ））亚甲基）-4-碘代苯甲酰肼酸酯，其是通过1,2,3-三唑部分（代号SBT171）与PEG化生物素连接的O -PEG化NP-14；和Ñ - （2-（2-（2-（2-（4 - （（ë）-1-（9-乙基-9- ħ咔唑-3-基）-3-（4-碘苯甲酰基）-6,7- 9,12,15-四恶唑-2,3-二氮杂十六烷基-1-en-16-基）-1 H -1,2,3-三唑-1-基）乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙基）-5-（ （3a S，4 S，6a R）-2-氧六氢-1 H-硫代[3,4- d ]咪唑-4-基）戊酰胺N，PEG化的NP-14通过1,2,3-三唑部分（代码号SBT-170）与PEG化的生物素连接。补充信息中描述了合成过程。
使用生物素结合的化合物进行下拉测定。（A）生物素化化合物的化学结构。O -PEG化的NP-10（R 1 = I，R 2 = H）或NP-14（R 1 = H，R 2 = I）通过1,2,3-三唑部分与PEG化的生物素连接（上图）显示了通过1,2,3-三唑部分与PEG化生物素连接的N -PEG化NP-10或NP-14（下图）。（B）O-聚乙二醇化，但不N-PEG化的NP-10和NP-14（不含1,2,3-三唑和PEG化的生物素）在HeLa细胞中诱导G2 / M阻滞。将HeLa细胞用媒介物（DMSO）或指定的化合物（10μM）处理24小时。用碘化丙啶染色后，通过流式细胞仪分析细胞周期分布（上图）。还研究了化合物对HeLa细胞生长的体外抑制作用（下图）。估计IC 50（50％抑制浓度）值。数据代表两次独立实验的平均值。（C）将HeLa细胞裂解液与O-生物素化（活性）或N生物素-亲和素相互作用固定化的生物素化（非活性）NP-10珠。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝（CBB）染色分析了下拉的蛋白质。如右图所示，将凝胶切成八部分。通过质谱分析鉴定每个凝胶部分中的蛋白质。
此外，合成了19种NP-10衍生物，包括N '-[（9-乙基-9 H-咔唑-3-基）亚甲基] -2-氯苯甲酰肼（代码HMI83-2）。补充信息中描述了合成过程。
将生物素化的化合物与链霉亲和素Sepharose High Performance（GE Healthcare，17-5113-01）在缓冲液A [50 mM Tris-HCl（pH 7.5），50 mM KCl，5 mM MgCl 2中混合，和1 mM EDTA]。从10 mL培养物中收获HeLa细胞裂解物，重悬于1 mL缓冲液B中[缓冲液A含有1 mM DTT，蛋白酶抑制剂（1 mM苯基甲基磺酰氟，12μg/ mL抑肽酶和1/100蛋白酶抑制剂混合物，得自Nacalai Tesque ），磷酸酶抑制剂（5 mM氟化钠和10 mMβ-甘油磷酸酯）]，然后使用Bioruptor（Cosmo Bio Co.，Ltd.）在冰上超声处理8秒钟10 s。通过以15000 rpm离心15分钟分离可溶级分，并在4°C下与固定化化合物的珠子孵育4 h。用洗涤缓冲液（含0.1％NP-40和100 mM KCl的缓冲液A）洗涤小珠3次，并用1×SDS样品缓冲液（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8、2％SDS，5％）洗脱结合的蛋白。 β-巯基乙醇，10％甘油和0。
通过SDS-PAGE，然后用考马斯亮蓝染色将结合的蛋白分辨出来，以可视化蛋白条带。切下染色的条带，并且将每个凝胶切片中的蛋白质还原，烷基化，并用胰蛋白酶（Promega）在50 mM碳酸氢铵中于37°C消化16 h。然后将产生的肽进行超高效液相色谱系统（AMR），然后进行Q Exactive质谱仪（Thermo Fisher Scientific）。使用Proteome Discoverer 1.4（Thermo Fisher Scientific）和Mascot搜索引擎版本2.4（Matrix Science），将获得的原始数据与SwissProt Homo s智人数据库进行比较。
如先前所述进行免疫印迹7。本研究中使用的抗体如下：NUP155（A303-934A，Bethyl Laboratories），IPOβ（ab2811，Abcam），KNTC1（F2051-10H4，Sigma-Aldrich），hCAP-D2（E4161-4C12，Sigma-Aldrich）， IPO7（ab88339，Abcam），CLTC（sc-271178，Santa Cruz），Cdc2-磷酸化波形蛋白Ser55（D076-3，MBL），GST（G7781，Sigma-Aldrich），GFP（A6455，Invitrogen）和HA标签（克隆3F10，罗氏公司）。二抗是HRP兔抗小鼠IgG（H + L）（61-6520，Invitrogen）或HRP山羊抗兔IgG（H + L）（65-6120，Invitrogen）。
合成具有以下序列（有义链）的siRNA寡核苷酸（IDT）：siNUP155-1（5'-GCAUGUCAGAUAUGGAUUAUCCUdTdT-3'），siNUP155-2（5'-GGCAUCUACUUGUGAGUAAUGUGdgdGdG-3'），siIPOβ-1（5'-GGCGGAGAUCGA -3'），siIPOβ-2（5'-AGAAGAGCCUAGUAAUAAUGUGAdAdG-3'），siKNTC1-1（5'-AGCUCAUAGAUAAAGCAUGGCAGdAdA-3'），siKNTC1-2（5'-AGAAAGGAAUGACAGUUAAGAACdCdT-3'）（sihCAP-D 5'-GGCAAGGCUAUAAUAGAUGAAUUAUdTdG-3'），sihCAP-D2-2（5'-GGCAGACAAGUCAGUGCUAGUAUdGdT-3'），siIPO7-1（5'-GCCUUAGAGCUAACAAGAAGAUGdTdC-3'），siIPO7-2（5'-AGAAGACAU）对照siLuci（5'-GGUUCCUGGAACAAUUGCUUUUAdCdA-3'）和对照siGFP（5'-ACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACdCdG-3'）。HeLa细胞（1×10 5/孔）使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）将18 pmol siRNA双链体转染到12孔板中48小时。siRNA和表达载体的共转染所用的方法如下所述。
pGEX-6P-2-NUP155 N，pGEX-6P-1-NUP155 M和pGEX-6P-2-NUP155 C是通过插入NUP155截短的突变体（编码氨基酸[aa] 1–548、509–992和使用In-Fusion HD克隆系统（Clontech）从pBluescriptR-NUP155（GE Healthcare）分别制备为pGEX-6P-1或pGEX-6P-2（GE Healthcare）。通过将由pOTB7-IPOβ（GE Healthcare）制备的IPOβ截短的突变体（分别为aa 1-450和450-876）插入pGEX-6P中，可以类似地生成pGEX-6P-2-IPOβN和pGEX-6P-2-IPOβC。 -2。
使用以下引物：对于NUP155 N，5'-CCAGGAATTCCCGGGATGCCGTCTTCTTTGTTGGGCG-3'（正向NUP155 N）和5'-ATGCGGCCGCTCGAGCACAAGCCTGGTCTTCC-3'（NUP155 N向反向）；对于NUP155 M，5'-GGAATTCCCGGGTCGCTCAGCACAGGGGAGCCTTATG-3'（正向NUP155 M）和5'-ATGCGGCCGCTCGAGGAGACTGAGGAGCGGCC-3'（NUP155 M反向）; 对于NUP155 C，5'- CCAGGAATTCCCGGGGTTGGACTTCAGGCCTTCC-3'（NUP155 C正向）和5'-ATGCGGCCGCTCGAGCGGATCAGGCCCTTATGGC-3'（NUP155 C反向）; 对于IPOβN，5'-CCAGGAATTCCCGGGATGGAGCTGATCACCATTCTCGG-3'（IPOβN正向）和5'-ATGCGGCCGCTCGAGAGCCAAGTAGACATCATTGATGGC-3'（IPOβN反向）; 对于IPOβC，则为5'-CCAGGAATTCCCGGGCCCCTGCTACAGTGTCTGATTG-3'（正向IPOβC）和5'-ATGCGGCCGCTCGAGTGGGGGTGTCCTCAGGTTATCATC-3'（正向IPOβC）。
通过使用In-Fusion HD克隆系统将IPOβcDNA插入pEGFP-C1（Clontech）中，构建了pEGFP-C1-IPOβ。使用了以下引物：5'-TCCGGACTCAGATCTGAGCTGATCACCATTCTCGAGAAG-3'（正向IPOβ）和5'-AGATCCGGTGGATCCTCAAGCTTGGTTCTTCAGTTTCCT-3'（正向IPOβ）。通过将IPO7 cDNA [由pCR-Blunt II-TOPO-IPO7（ThermoFisher Scientific）制备]插入Not I-和Sma I消化（以去除FLAG-GRWD1）来构建pFLAG-CMV-5b-HA-IPO7 -5b-HA-GRWD1 6使用In-Fusion HD克隆系统。使用了以下引物：5'-CCAGACTATGCGGCCGGAGACCCCAACAACATTATCGA-3'（正向IPO7）和5'-ACAGGGATGCCACCCGGGTCAATTCATCCCTGGTGCT-3'（正向IPO7）。pEGFP-C1-NUP155 MC是使用In-Fusion HD克隆系统通过将NUP155截短的突变体（aa 748–1391）插入pEGFP-C1而构建的。使用了以下引物：5'-TCCGGACTCAGATCTATGCGTCCTGAAAACGGAAAT-3'（正向为NUP155 MC）和5'-AGATCCGGTGGATCCATGAAGCCGTTCTAATTTAGC-3'（正向为NUP155 MC）。
对于图 4，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将表达质粒（0.5μg）和siRNA（12 pmol）瞬时转染到12孔板中的1×10 5 HeLa细胞中。16小时后，将细胞加入新鲜的培养基进行免疫印迹，或以1.67×10 5个细胞/孔的密度重新铺在4孔室玻片（LAB-TEK，Thermo Fisher）中，以进行显微镜分析。转染后48小时，将细胞用于分析。
GFP-IPOβ的过表达和NUP155的沉默导致有丝分裂停滞。（A）将HeLa细胞与所示的表达载体和siRNA共转染48小时，并用所示抗体进行免疫印迹。（B）将如（A）中转染的HeLa细胞用DAPI染色并通过荧光显微镜分析。显示了有丝分裂细胞的代表性图像。比例尺，10μm。描述了具有GFP信号的有丝分裂细胞的百分比。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001（χ 2 -test）。在两个独立的实验中获得了相似的结果。
对于补充图 S3，使用PEImax（Polysciences）将表达质粒（0.8μg ）瞬时转染到12孔板中的1×10 5 HeLa和293T细胞中。转染后48小时，对细胞进行免疫印迹。
对于图 1A，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将表达质粒（1.6μg）瞬时转染到12孔板中的1×10 5 HeLa细胞中。48小时后，将细胞进行免疫印迹。
对于图 1B，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将表达质粒（3.0μg）瞬时转染到35 mm培养皿中的2×10 5 HeLa细胞中。24小时后，将细胞进行克隆形成测定。
如前所述6，在谷胱甘肽微珠上细菌表达并纯化了GST-NUP155 N，GST-NUP155 M，GST-NUP155 C，GST-IPOβN和IPOβC 。将结合生物素化化合物的链霉亲和素琼脂糖与纯化的蛋白质在4°C下孵育1小时。用NUP155的洗涤缓冲液1（缓冲液A含有0.02％NP-40和200 mM KCl）或IPOβ用洗涤缓冲液2（缓冲液A含0.1％NP-40和200 mM KCl）和结合的蛋白洗三遍用1×SDS样品缓冲液洗脱，然后进行SDS-PAGE和免疫印迹。
对于图 4B，将细胞在室温（RT）下用3.7％甲醛的PBS溶液固定10分钟，然后再用100％冰冷的MeOH处理15分钟。然后在室温下用0.1％Triton X-100的PBS溶液渗透细胞10分钟，并用4,6-二mid基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。最后将细胞安装在Fluoro-KEEPER防褪色试剂（Nacalai Tesque）中，并使用KEYENCE BZ-9000显微镜进行分析。
裸鼠的肿瘤研究基本上如先前所述进行5。九州大学动物保健和使用委员会批准了动物实验规程（许可证编号：A23-067和A25-023）。所有动物实验均根据“动物福利和管理法”（日本环境省）和“实验动物管理”（九州大学）中包含的相关国家和国际准则进行。从九州有限公司获得了四周大的雌性BALB / c nu / nu裸鼠。通过对小鼠的背部皮下注射接种4×10 5将HCT116细胞与Matrigel（50μL细胞悬液+ 50μLMatrigel，356234，BD Biosciences）混合。使用数字卡尺检查肿瘤的大小，并使用以下公式计算体积：肿瘤体积（mm 3）=长度×（宽度）2 × / 6。每周测量三次体重和肿瘤大小。一旦肿瘤达到约100mm 3，将小鼠随机分为两组，一组用下文详述的对照载体混合物治疗，另一组用含有HMI83-2（100mg / kg）的载体治疗。如图5B所示，腹膜内施用指定药物七次 。媒介物混合物由40％羟丙基-β-环糊精（HP-β-CyD），30％PEG400、20％乙醇和10％DMSO组成。
HMI83-2抑制裸鼠中HCT116肿瘤的生长。（A）HMI83-2的化学结构。（B）将HCT116细胞皮下接种到BALB / c nu / nu裸鼠中。如材料和方法中所述，用100 mg / kg的HMI83-2或对照媒介物（分别为n = 7，n = 6）治疗小鼠。显示了平均肿瘤体积（带有SD）。箭头代表给药的日子。* p <0.05（与媒介物比较；两尾学生t检验）。（C）通过上述实验获得的Kaplan-Meier曲线。* p <0.05（与车辆相比；对数秩检验）。（D）显示了用HMI83-2或对照载体处理的裸鼠的体重变化。
基本上如先前所述进行数据表示和统计分析6。除非另有说明，否则定量数据显示为来自三个或更多独立实验的平均值±SD。为了表示定性和半定量数据，显示了代表性图像。对于所有这些数据，在多个独立实验中观察到基本相同的结果。除非另有说明，否则两组之间差异的统计显着性是通过两尾学生t检验估计的。P <0.05被认为具有统计学意义。
首先通过单因素方差分析检验两组以上差异的统计学显着性。然后，使用Tukey-Kramer多重比较测试分析两组之间的差异。P <0.05被认为具有统计学意义。
用于亲和纯化的NP-10结合蛋白，我们制备了ö -PEGylated或ñ -PEGylated NP-10经由1,2,3-三唑部分连接于聚乙二醇化的生物素和ö -PEGylated或ñ -PEGylated NP-14连接到通过1,2,3-三唑部分进行PEG化的生物素（图 3A和材料与方法）。首先，我们确定这些化合物是否具有与原始NP-10和NP-14分子5相当的抗有丝分裂作用。流式细胞仪分析显示O -PEG化的NP-10和NP-14（不含1,2,3-三唑和PEG化的生物素），但N-PEG化的NP-10和NP-14以与原始化合物相当的浓度诱导G2 / M停滞并抑制HeLa细胞的生长（图 3B）。因此，以下将O -PEG化的NP-10和NP-14称为活性形式，将N -PEG化的NP-10和NP-14称为非活性形式。将生物素化的NP-10固定在抗生物素蛋白包被的磁珠上，并从HeLa细胞裂解物中纯化结合的蛋白。使用SDS洗脱蛋白质，并进行SDS-PAGE（图 3C），然后进行质谱分析。在使用活性NP-10珠子鉴定出的蛋白质中，选择了吉祥物得分比对照样品高出200倍或≥2倍的蛋白质（补充图 S1）。
由于列出的原因，选择了以下蛋白质用于进一步分析：importin 7，因为它具有最高的吉祥物评分（2820）；输入蛋白β，因为它显示出高得分的Mascot（1246），并且因为以前的报道表明，它参与调节有丝分裂进程8，9，10，11 ; NUP155因为高得分的Mascot（820）和核孔蛋白的有丝分裂调控可能卷入8，12 ; KNTC1的吉祥物评分较高（768），并且可能参与了有丝分裂调控13；和HCAP-D2因为高得分的Mascot（547）和有丝分裂调控可能参与的14，15。
通过下拉测定和免疫印迹证实了所选蛋白质与活性O-生物素化的NP-10珠的结合。如图所示 6A，势必活性所有选定的蛋白质ö -biotinylated NP-10比非活动更有效地Ñ -biotinylated NP-10。这些蛋白质还与活性的O-生物素化的NP-14结合（图 6A）。我们先前显示，NP-14，但不是NP-10，在体外抑制微管蛋白聚合5。因此，有可能在苯环的邻位带有一个碘部分的NP-10和在对位5带有一个碘部分的NP-14（也参见图 3A）共享靶蛋白，而后者也靶向微管蛋白。
NUP155（NP-10的潜在靶标）的沉默可诱导有丝分裂阻滞。（A）将HeLa细胞裂解物与抗生物素蛋白珠一起温育，在其上固定了所示化合物。通过用指定的抗体免疫印迹分析结合的蛋白和5.4％的输入。（B）用对照（siGFP和siLuci的混合物）或靶向NUP155的siRNA（siNUP155-1或siNUP155-2）siRNA转染HeLa细胞48小时。通过用指定的抗体进行免疫印迹分析全细胞提取物。磷酸波形蛋白（Ser55）是Cdk1激酶的靶标，被用作有丝分裂标记。蛋白用考马斯亮蓝（CBB）染色以检查相等的负载。（C）将如上处理的HeLa细胞用碘化丙啶染色，并进行流式细胞术。
因为NP-10可以作为已鉴定蛋白的拮抗剂，所以我们设计了针对它们的siRNA，并研究了沉默对有丝分裂阻滞的影响。为了这个目的，我们测量了磷酸波形蛋白Ser-55的水平，它被Cdk1磷酸化，或者磷酸组蛋白H3 Ser-10，其被Aurora B磷酸化，作为有丝分裂标记5。如图6B和S2所示 ，NUP155的沉默，但不包括importinβ和紧密相关的importin 7的其他因素，引起有丝分裂停滞。通过流式细胞术证实了NUP155沉默诱导的有丝分裂停滞（图 6C）。
importinβ的过表达影响某些MAP的定位，导致异常纺锤体形成和延迟的有丝分裂进程11。由于importinβ和importin 7有效结合NP-10，因此我们假设NP-10可能对importinβ和/或importin 7具有激动作用。为检验这一假设，我们检查了importinβ和importin 7过表达对NP-10的影响。有丝分裂进展。与先前的发现一致，GFP-导入素β的过表达（图 4A）导致有丝分裂细胞的积累（图 4B）。Importin 7的过表达并没有增加有丝分裂细胞的数量，证实了这种作用对importinβ是特异的（补充图 S3）。）。NUP155沉默联合importinβ过表达对有丝分裂进程的影响分析表明，NUP155沉默使GFP-importinβ过表达的HeLa细胞中的有丝分裂种群增加（图 4）。
为了确定纯化的NUP155和importinβ是否直接与活性NP-10结合，我们制备了三个覆盖全长NUP155的片段（NUP155 N端，中端和C端片段；图 7A）和两个覆盖全长的片段importinβ（importinβN末端和C末端片段；图 7A），并研究了它们与活性或非活性NP-10珠的结合。如图7B所示 ，NUP155的C末端片段和输入蛋白βC末端片段特异性结合至NP-10的活性形式。NUP155中间片段显示出与活性NP-10珠的某些结合，尽管程度与无活性NP-10珠的相似。
识别IPOβ和NUP155的NP-10-结合域。（A）全长NUP155和IPOβ（FL）及其截短的突变体的示意图。NUP155的N端和C端部分分别具有预测的β-螺旋桨和α-电磁体结构。IPOβ的N端和C端分别是RanGTP和IPOα结合域。（B将GST，GST-IPOβ突变体或NUP155突变体与有活性或无活性的NP-10-固定珠（通过生物素-亲和素相互作用）孵育。通过抗GST抗体的免疫印迹分析了下拉蛋白，GST-NUP155突变体输入的3.5％和GST和GST-IPOβ突变体输入的5.8％。使用生物素偶联的PEG接头作为阴性对照。量化了频段的信号强度，并显示了输入信号强度设置为1的情况。显示了平均值±SD（对于NUP155 N和IPOβN，n = 3；对于NUP155 M，n = 4；对于NUP155C，n = 5；对于NUP155C，n = 5 IPOβC）。** p <0.01，ns，不显着（Tukey-Kramer检验）。
为证实NUP155有助于NP-10诱导有丝分裂阻滞，我们研究了NUP155 MC片段（aa 748–1391）的过度表达对HeLa细胞药物敏感性的影响，其中包括NP-10-结合区。 。如图1所示 ，NUP155 MC的过量生产降低了HeLa细胞中NP-10的细胞毒性。综上所述，这些数据支持了NP-10充当输入蛋白β的激动剂和NUP155拮抗剂的观点。但是，NP-10可能会影响其他分子以诱导癌细胞中有效的有丝分裂停滞。
NP-10对肿瘤细胞选择性抑制作用的分子机制尚不清楚5。最近的研究表明，癌细胞是不是因为致癌hypergrowth刺激正常细胞较高的复制压力下16，17。尽管尚不清楚过度复制应激的机制，但在癌细胞17中，DNA复制和转录之间的碰撞可能会更频繁地发生，这两者都是由致癌性刺激促进的。此类冲突可能会使复制叉停顿，从而导致过度复制压力。复制应力也导致有丝分裂畸变如染色质桥梁，落后染色体，和超细桥接18，19。因此，我们假设致癌的过度刺激会影响对NP-10的敏感性。为了验证这一假设，我们准备了正常的人类HFF2 / T成纤维细胞（通过端粒酶永生化）和转化后的对应HFF2 / T / E7 / KRAS细胞，其中包含活化的KRAS突变体G12V和16型人乳头瘤病毒E7（HPV16）6，20，和研究了它们的灵敏度为NP-10。结果表明，转化的HFF2 / T / E7 / KRAS细胞对NP-10敏感（图 2），这支持了我们的假设。但是，其他机制也可能有助于NP-10的癌细胞选择性，如先前所述5。
在以前的工作中，我们没有观察到体内 NP-10的抗肿瘤活性5，可能是由于差体内的碘部分的稳定性（对于细节，参见由CAVINA综述文章等人。21）在NP-10。为了获得更有效的NP-10-相关化合物，我们合成了19个在苯甲酰基和咔唑基团上具有不同取代基的NP-10衍生物，以了解其结构活性关系（SAR）（图 8）。流式细胞术分析用于检查是否所述化合物诱导的G2 / M阻滞在10μMHeLa细胞（原NP-10诱导G2 / M期阻滞在10μM 5）。在这19种化合物中，有11种诱导了G2 / M阻滞（图 8），SAR暗示咔唑氮原子上的乙基可能对该活性很重要。通过检查它们对宫颈癌衍生的HeLa细胞和端粒酶永生化的正常人成纤维细胞HFF2 / T细胞生长的影响来确定这些化合物的IC 50（图 8）。此外，我们计算出的IC之间的比率50对HFF2 / T和IC 50为海拉作为癌症细胞选择性指数5（图 8）。11种化合物的活性与NP-10相当，其IC 50值为1.88–8.68μM，选择性指数为1.55–6.12（图 8）。IC 50的SAR选择性指数表明，对于在苯甲酰基部分邻位带有取代基的衍生物，选择性指数可能更好，而当对位存在取代基时，IC 50可能较小。
各种NP-10-相关化合物的生长抑制活性。NP-10衍生物的化学结构及其生长抑制活性。IC 50单位为μM。选择性指数是IC之间的比率50对HFF2 / T细胞和IC 50为HeLa细胞。ND，不确定。
基于所述体外数据（图 8）和一个事实，即在I和CH 3个结构部分通常是不稳定的（对于细节，参见综述文章21，22，23），我们选择了Ñ ' - [（9-乙基-9- H-咔唑-3-基）亚甲基] -2-氯苯甲酰肼（代码号HMI83-2）（图 5A）有待进一步研究。HMI83-2对HeLa细胞显示出较高的生长抑制活性，具有较高的选择性指数，并且具有氯部分而不是碘部分。我们在裸鼠中使用HCT116细胞异种移植模型检查了HMI83-2的体内抗肿瘤活性。
如图5B所示（腹膜内注射），将带有HCT116细胞肿瘤的裸鼠用对照媒介物或HMI83-2（100mg / kg）治疗七次 。在这些实验条件下，HMI83-2的抗肿瘤作用在统计学上显着高于对照（图 5B，C），而体重却没有明显降低（图 5D），这表明除HND-007之外，还有另一种NP-10-相关化合物5HMI83-2是开发新型抗有丝分裂剂的有前途的先导化合物。
当前研究期间生成和/或分析的数据集以及当前研究中使用的材料可根据合理要求从通讯作者处获得。
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