il-23共同刺激抗原特异性mait细胞的激活，并使接种细菌感染成为可能
摘要
黏膜相关不变T(MAIT)细胞由核黄素合成途径产生的抗原(包括5-(2-氧丙基氨基)-6-)以tcr依赖的方式激活。D-Ribitylaminouracil(5-OP-RU)，与MHC相关蛋白-1(MR1)结合.然而，MAIT细胞在体内的激活还没有得到详细的研究。在此，我们发现并表征了肺后MAIT细胞最佳活化和扩张所需的额外分子信号。军团菌或沙门氏菌小鼠感染。我们表明，骨髓来源的APC或非骨髓来源的细胞可以激活MAIT细胞在体内，取决于病原体。在体内最优的MAIT细胞激活需要通过诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)信号传递，而ICOS在MAIT细胞上高表达。随后MAIT-17/1型反应的扩展和维持依赖于IL-23。IL-23加5-op-Ru疫苗增强MAIT细胞对肺的控制作用军团菌感染。这些发现揭示了在生理条件下操纵MAIT细胞功能的细胞和分子靶点。
导言
黏膜相关不变T(MAIT)细胞通过识别来自核黄素生物合成的化合物对一系列细菌和真菌作出反应，其中最有效的是5-(2-氧丙基氨基)-6-D-Ribitylaminouracil(5-op-RU)，由主要组织相容性复合物相关蛋白-1(MR1)(1, 2)。MAIT细胞表达一种保守的αβT细胞受体(tcrαβ)，该受体由一个相对不变的α链和广泛的β链组成，但优先使用Vβ(3–7)。在小鼠中，MAITTCRs使用TCRα可变基因片段(TRAV)1-TRAJ 33(Vα19-Jα33)，通常与TCRβ可变基因片段(Vβ6)或TRBV 13(Vβ8)组装，人体内存在同源TCRs。已证明MAIT细胞对多种细菌和真菌(包括致病性和共种)都有反应，这与这些生物中参与核黄素生物合成的基因的存在有关，从而与其产生抗原(Ag)的能力有关。2, 8–10)。多项研究表明，MAIT细胞已进化为宿主防御微生物病原体。然而，MR1在低水平(11–13)，在真正的感染过程中，通过MR1向MAIT细胞呈现抗原的细胞还没有被描述。此外，对MAIT细胞活化的要求及其在防止病原体感染方面的作用仍有待解决。
从胸腺流出的MAIT细胞显示记忆/效应细胞特性(14–17)，使它们有别于天真的传统T细胞。然而，在tcr依赖的刺激下，mait细胞获得激活状态，使其能够以“先天”的方式，以“与生俱来”的方式，扩展并迅速产生细胞因子，包括白细胞介素-17(IL-17)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。15, 18)。最近，我们发现MAIT细胞不同于传统的循环细胞，因为它们似乎在感染部位被激活增殖，对MAIT细胞在这些部位的积累起了很大的作用。19, 20)。与传统T细胞类似，MAIT细胞除了需要TCR识别合成的5-op-RU抗原(Ag)外，还需要其它共刺激信号来激活。19, 21)。这些附加信号可由Toll样受体(Tlr)激动剂或细菌产品(19)，但在体内MAIT细胞启动的这种强制性信号的性质尚不清楚。某些细胞因子在tcr依赖性激活MAIT细胞(22–25)，特别是在体外实验中，有报道称IL-12和IL-18可以独立于MR1-TCR连接来驱动MAIT细胞的活化(8, 26).
无论是通过在TLR激动剂存在下预先接种5-op-RU来激活MAIT细胞，还是通过过继转移活化的MAIT细胞，都可以改善对细菌感染的保护。20)。为了了解刺激MAIT细胞在体内发挥最佳功能所需的信号，我们开始研究MAIT细胞在感染两种病原体的小鼠模型中的激活需求，长叶军团菌和肠沙门氏菌[医]霸王龙S.)。在这里，我们使用骨髓(Bm)嵌合体，其中要么是bm衍生的[野生型(Wt)→]。MR1−/−]或非BM衍生(MR1−/−→WT细胞或两者(WT→WT)表达MR1，因此可能通过MR1呈现抗原，表明BM衍生抗原提呈细胞和非BM来源细胞都能根据病原体在体内激活MAIT细胞。诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)在MAIT细胞上高表达，是体内最优激活MAIT细胞所必需的。我们证明，mit-17/1型应答的随后扩展和维持依赖于IL-23，而将小鼠与IL-23和5-op-Ru联合接种可增强mit细胞对肺的控制作用。军团菌感染。
结果
根据细菌感染的生物学特性，bm衍生细胞和非bm衍生细胞通过mr 1激活mait细胞的不同要求。
MR1的低水平，无处不在的表达(11–13)使得在体内难以识别驱动MAIT细胞反应的细胞。有研究报告说，MAIT细胞在体外已经激活了BM-和非BM-衍生细胞或细胞系(23, 27–29)，提示这两种细胞类型均能在MR1上呈现抗原，促进MAIT细胞的活化。为了评估bm衍生的不同mr 1表达细胞在体内以mr 1依赖方式激活和推动mr 1细胞增殖的能力，我们采用了两种c57bl/6小鼠鼻内感染模型。S.Typhimurium BRD 509或龙舌兰在NSW 150中，我们曾报道过MAIT细胞的激活和扩张(19, 20)。我们首先证实，MAIT细胞聚集在感染部位(肺部)在肺部感染。鼻内感染后7天S.Typhimurium BRD 509或龙舌兰NSW 150，平均分别占tcrβ的46%和24%。+MR1-5-op-Ru四聚体检测肺内淋巴细胞图1A，图中所示的选通策略。(S1a)。虽然在被感染的肺中观察到的MAIT细胞可能来自于从循环中污染MAIT细胞(30)，考虑到小鼠循环中MAIT细胞的数量少(T细胞的<0.1%)，这不是一个合理的解释。19, 31)以及感染后肺部MAIT细胞的增殖能力(20)。因此，我们认为循环MAIT细胞只是扩大MAIT细胞的次要因素。为了确定在这些模型中通过MR1向MAIT细胞表达细菌抗原所需的APC来源，我们产生了三组BM嵌合小鼠：(1)将WT C57BL/6(CD 45.1)BM移植到受体MR1缺陷小鼠(CD 45.2)；(2)WT C57BL/6(CD 45.1)BM移植到受体WT同型小鼠(CD 45.2)，或(3)MR1缺陷BM(BM)。MR1−/−CD 45.2)移植到WT-C57BL/6小鼠体内(CD 45.1)。这些bm转移导致嵌合小鼠只能通过bm衍生细胞(wt→)将抗原呈现给mait细胞。MR1−/−)，通过BM-和非BM衍生细胞(WT→WT)(图1B)或仅通过非BM衍生细胞(MR1−/−→WT)(图1f)。用同型标记(CD 45.1或CD 45.2)追踪这些小鼠供体和受体来源的细胞。8周后，我们验证了嵌合小鼠肺部细胞的重建，其中>99%的CD3。−TCRβ−CD 45+细胞来源于供体BM(图5)。S1B)。
图1 细菌感染时，BM源和非BM来源的APCs都能驱动MAIT细胞在肺部积聚。(A)C57BL/6小鼠未感染或鼻内感染后第7天MAIT细胞频率(10只)6S.Typhimurium BRD 509(萨尔姆。)或104 龙舌兰 (腿。)。数据显示小鼠个体和均值±SEM。**P < 0.01, ****P < 0.0001, one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons. (B)(C)和(D)的BM嵌合体示意图。(C)频率和(D)WT→WT或WT→的MAIT单元的绝对数目MR1−/−嵌合小鼠未感染或第7天感染。鼻内感染10例6 S.Typhimurium BRD 509或104 龙舌兰. *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, multiple unpaired t测试一下。(E)肺CD 45.2+TCRβ+细胞MR1−/−10只或不含10只→WT嵌合小鼠5移植后2周过继转移C57BL/6 MAIT细胞，可见肺内MAIT细胞重建。(F)(G)和(H)的协议和BM嵌合体的原理图。(G)频率和(H)第7天转移的MAIT细胞的绝对数量。在……里面MR1−/−→WT嵌合小鼠，10只过继移植5WT-MAIT细胞，然后经鼻感染106 S.Typhimurium BRD 509或104 龙舌兰...NS，没有意义。****P < 0.0001, one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons. Also see fig. S1.
然后将BM嵌合小鼠经鼻感染。S.香菇或龙舌兰在感染后第7天检测肺组织中的MAIT细胞(P.I.)。后龙舌兰在WT→中，MAIT细胞以相似的方式扩张。MR1−/−小鼠和WT→WT对照(αβT细胞百分比或MAIT细胞绝对数量)(图1，C和D)，提示MR1在骨髓来源的APC上的表达对MAIT细胞的激活是足够的。然而，在感染了S.Typhimurium BRD 509，WT→肺内MAIT细胞明显减少MR1−/−嵌合小鼠在第7天。与WT→WT控件相比(图1，C和D)，表明mr 1在bm衍生细胞上的表达不足以使mit细胞完全激活。S.伤寒性肺部感染。WT→中两种细菌感染对非MAIT T细胞反应无显着性差异(P>0.05)。MR1−/−相对于WT→WT BM嵌合体(图1.S1C)。
为了确定非bm衍生细胞是否能为mait细胞激活提供apc功能，我们创建了(MR1−/−→WT)BM嵌合小鼠。然而，这些小鼠的肺内未检测到供体MAIT细胞(图1E)，符合MR1的要求+双阳性胸腺细胞在MAIT细胞发育中的作用32)。因此，为了检查只有非bm衍生细胞表达mr 1的mait细胞，我们过继地转移了从肺中分离出来的mait细胞。S.Typhimurium BRD 509感染WT(CD 45.2)小鼠(图1f)。这种转移使MAIT细胞在移植后2周与天真的C57BL/6小鼠相类似。图1E)。然后我们在鼻腔感染了这些老鼠S.Typhimurium BRD 509或龙舌兰NSW 150在……里面S.我们发现，受鼠伤寒病毒感染的小鼠肺内转移的αβT细胞有选择性的富集：按比例从~1增加到~30%。图1g)，MAIT细胞的绝对数量增加了近90倍(图1H)。相反，之后龙舌兰感染后，MAIT细胞比例无明显增加(图1g)，绝对MAIT细胞数的扩展是有限的(~6倍)。图1H)。为了进一步验证转移的MAIT细胞在这个模型中的使用，我们将MAIT细胞(从内源性MAIT细胞中携带不同类型的CD 45)转移到WT→中。MR1−/−嵌合体。这些老鼠被感染了S.香菇或龙舌兰移植后2周，用CD 45抗原标记检测移植物细胞和内源性MAIT细胞在第7天的聚集情况。转移的MAIT细胞以类似于内源性MAIT细胞(图1d对无花果。S1D)感染后。这些数据表明，非bm衍生细胞mr 1可以激活mait细胞。S.Typhimurium BRD 509，但不是龙舌兰感染，需要在骨髓来源细胞上表达MR1，才能使MAIT细胞增殖。
主动入侵S.鼠伤寒菌对其体内激活MAIT细胞的能力是必不可少的。
尽管上皮细胞启动和激活传统T细胞，提呈肽Ag已被其他人证实。33, 34)，令人意外的是，非bm衍生细胞似乎在驱动mait的反应中占主导地位。S.伤寒杆菌感染。了解为什么非bm衍生细胞需要在S.斑疹伤寒肺部感染，我们用.S.香菇SL 1344Δ入侵突变体，缺乏主动侵袭上皮细胞的能力(35)。在这种感染中，Ag的出现主要局限于能够吞噬细菌的专业的APC。36)。首先，我们测试了SL 1344的Δ。入侵在MR1依赖的体外激活试验中的突变体(37)证实其产生MAIT刺激抗原的能力。细菌培养上清S.香菇SL 1344Δ入侵和SL 1344同样能够激活表达MAITTCR的报告细胞系；Jurkat.MAIT(2, 37)，如CD 69的上调所检测到的(图2A)，表明SL 1344Δ在MAIT细胞Ag生产中没有缺陷。入侵变种人。SL 1344Δ的侵袭缺陷入侵突变型(35)在人和小鼠巨噬细胞和上皮细胞中均得到证实。因此，在与细菌共培养1小时后，我们发现人和小鼠上皮细胞所含的sl 1344Δ明显减少。入侵突变型集落形成单位(Cfu)与SL 1344对照相比，巨噬细胞株中的细菌载量无明显差异(P>0.05)。图2B).
图2 主动入侵S.鼠伤寒菌在体内对MAIT细胞的刺激起着至关重要的作用。(A)CD 69在Jurkat.MAIT细胞上的表达(与C1R.MR1细胞、5-op-Ru或过滤培养上清液共培养16小时)S.香菇SL 1344，SL 1344Δ入侵，或媒体控制(LB)。数据显示门控Jurkat.MAIT细胞的平均荧光强度(MFI)，三份样品的扫描电镜为误差条。***P < 0.001, ****P < 0.0001, one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparisons. The experiment was performed twice with similar results. (B人和小鼠细胞的细菌计数(10)6(人：BSB-Ⅱ；小鼠：肺上皮型1型(LET 1))96]或巨噬细胞[人：thp-1；小鼠：骨髓源性巨噬细胞(Bmdm)]来源于SL 1344(开环)或sl 1344Δ感染后1小时。入侵(闭合圆)沙门氏菌(MOI，10)。(C和D)αβT细胞(C)和细菌负荷(D)在第6天肺组织中所占的百分比。C57BL/6小鼠经鼻感染10只5 S.灰霉病菌SL 1344或SL 1344Δ入侵...综合数据显示，每组小鼠平均±SEM 7~9只。***P < 0.001, ****P < 0.0001, unpaired t测试一下。实验分别进行了两次，结果相似。
为了研究这种侵袭缺陷对MAIT细胞在体内积累的影响，我们在鼻腔感染SL 1344或SL 1344的C57BL/6小鼠体内。入侵第6天检测肺组织MAIT细胞。此外，我们还从肺匀浆中用CFU法测定了这些小鼠的细菌载量。与SL 1344相比，SL 1344Δ入侵突变株未能引起这些受感染小鼠肺部大量MAIT细胞的聚集。图2C)，尽管有相等的细菌负荷(图2D)。这些数据表明，活性细菌入侵对S.在体内，Typhimurium刺激MAIT细胞的最佳反应，这与我们的发现一致，即非BM衍生细胞是由这种兼性细胞内病原体感染时向MAIT细胞呈现抗原的重要APC。因此，这些数据表明，取决于病原体生物学，BM-或非BM-衍生细胞能够作为APC发挥作用，并以MR1依赖的方式激活MAIT细胞。
摘要icos在MAIT细胞中高表达，对mit细胞的最佳扩增和维甲酸相关的孤儿受体γt(rorγt)的表达至关重要。
在此之前，我们发现合成的5-op-Ru抗原不足以在体内激活MAIT细胞，而其他所需的刺激信号可以通过与tlr激动剂cpG、聚肌苷酸(Polycytidyic Acid)或pam2cys(Pam2cys)共同接种小鼠来提供。19)。在此，我们研究了MAIT细胞激活对共刺激分子(信号2)的直接需求，假设TLR激动剂可能不会直接激活MAIT细胞。相反，它们可以通过装甲运兵车间接地采取行动，或者通过增强MR1的表示(38)或通过刺激细胞因子的产生或协同刺激配体的上调。首先，我们研究了一系列共刺激分子在MAIT和非MAITTCRβ上的表达。+C57BL/6 WT小鼠肺细胞。与非MAIT T细胞相比，天真小鼠的MAIT细胞高表达ICOS。图3A)。此外，MAIT细胞表达CD 154(CD40L)和CD 27中间水平及与非MAIT T细胞相似的CD 28水平，而在肺MAIT细胞上未检测到CD 137(4-1BB)。因此，我们推测ICOS可能在MAIT细胞的共刺激中发挥重要作用。
图3 ICOS在MAIT细胞上有很高的表达，对促进MAIT细胞对感染的反应具有重要意义。(A典型的FACS直方图显示CD 154、CD 28、CD 137、CD 27和ICOS在未感染C57BL/6 WT小鼠的MAIT细胞、非MAIT T细胞和B细胞上的表达。(B第7天肺MAIT细胞频率。的CD 80−/−CD 86−/−, ICOS−/−，C57BL/6 WT小鼠，经鼻感染10只。6 S.Typhimurium BRD 509或104龙舌兰...数据显示小鼠个体和均值±SEM。*P < 0.05, ****P < 0.0001, one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons. (C)外地资产管制局代表的阴谋和(D)叠加图，显示表达T-bet和RORγt的MAIT细胞比例来自天真，S.Typhimurium BRD 509-感染，或龙舌兰-感染CD 80−/−CD 86−/−, ICOS−/−，C57BL/6 WT小鼠(7天P.I.)，指5只(天真)或8~9只(感染)小鼠的±SEM。另见图。S2.
为了进一步研究这些共刺激分子在细菌感染过程中是否是MAIT细胞最佳积累和激活所必需的，我们对基因敲除(KO)小鼠进行了研究。ICOS−/−老鼠和CD 80−/−/CD 86−/−双KO小鼠，后者缺乏CD 28通路)。WT(C57BL/6)，ICOS−/−，和CD 80−/−/CD 86−/−双KO小鼠经鼻感染S.Typhimurium BRD 509或龙舌兰NSW 150检测MAIT细胞和CD4+7天后肺内T细胞积聚(图3B还有无花果。S2、A和B)。与WT小鼠相比，我们观察到对感染有反应的MAIT细胞的比例和绝对数量显著减少。ICOS−/−两只老鼠S.香菇和龙舌兰感染。两组小鼠MAIT细胞数无显着性差异(P>0.05)。CD 80−/−/CD 86−/−老鼠(图3B还有无花果。S2，A和B)或CD4的数量+T细胞在WT与ICOS−/−小鼠肺部感染S.Typhimurium BRD 509或龙舌兰NSW 150(图1)S2、A和B)。
接下来，我们检测了关键转录因子T-bet和rorγt的表达，它们是T助手1(T)的驱动机制。H1)-和TH17种类型的答复(39, 40)，通过对MAIT细胞的响应，确定不同的共刺激信号是否会导致MAIT细胞表型差异。我们以前观察到感染后肺MAIT细胞T-bet表达增加。S.香菇或龙舌兰 (19, 20)。与我们以前的数据一致，在WT c57bl/6小鼠中，两者的比例都有所增加。+RORγt+和T-打赌+RORγt−感染后MAIT细胞(图3 C和D)。也观察到了类似的影响。CD 80−/−CD 86−/−老鼠。相反，在没有icos的情况下，rorγt的数目减少了。+T-打赌−MAIT细胞S.香菇或龙舌兰感染，按比例计算+RORγt−MAIT细胞增多(图3d还有无花果。S2、C和D)。这些数据表明，icos是MAIT细胞维持rorγt表达所必需的，在没有icos的情况下，更多的mit细胞向T方向倾斜。H1-类表型(MAIT-1)高表达T-bet，可能反映其他信号在发挥作用。
在肺部细菌感染过程中，要使MAIT细胞达到最佳的聚集和激活状态，就需要IL-23。
最佳MAIT细胞响应要求附加信号与TCR Ag识别并行(19)。然而，尽管先前的研究表明，细胞因子，包括白细胞介素-12和白细胞介素-18，可以以不依赖TCR的方式刺激MAIT细胞(8)，增强MR1依赖性MAIT细胞活化的细胞因子的需求和类型(22–25, 41)，尤其是在体内，人们对此了解较少。为了探讨MAIT细胞在体内激活的细胞因子需求，我们在经鼻感染的小鼠体内缺乏一个或多个单个细胞因子。S.我们分析了第7天肺内MAIT细胞的聚集情况。缺乏IL-18、IL-6或IFN-γ的小鼠，或IL-12p35−/−小鼠，缺乏IL-12和IL-35(42)，它们都能够安装类似WT小鼠的健壮的MAIT细胞反应(图4，A和B)。相反，两者IL-12p40−/−缺乏IL-12和IL-23的小鼠，以及IL-23p19−/−小鼠，缺乏IL-23(42–45)，与WT小鼠相比，小鼠肺MAIT细胞蓄积(T细胞百分比和绝对值)明显减少(图4，A和B)，表明缺乏IL-23会影响MAIT细胞在肺部的扩展。S.伤寒杆菌感染。减少MAIT细胞的积累IL-23p19−/−小鼠被感染时也被观察到。龙舌兰(无花果)中3、A和B)。相比之下，非MAITαβT细胞数在WT与WT之间无显着性差异。IL-23p19−/−老鼠(无花果)S3C)。此外，我们发现icos或IL-23缺乏对肺内自然杀伤(NK)T细胞、γδT细胞或固有淋巴样细胞(ILCs)数量无明显影响。军团菌-感染小鼠(图1)。S3C)。第7天肺细菌载量(CFU)无显着性差异(P>0.05)。ICOS−/−或IL-23p19−/−小鼠与WT小鼠比较，尽管IL-23p19−/−10天时小鼠负荷略高。(无花果)S3D)。
图4 IL-23是在肺部感染时MAIT细胞聚集和激活所必需的。S.香菇。(A)百分比和(B)从KO基因小鼠肺部分离出的MAIT细胞的绝对数量，其中10只在鼻内感染后缺乏指示的细胞因子。6 S.Typhimurium BRD 509(第7天P.I.)数据显示，每组3~15只小鼠平均为±SEM。****P < 0.0001 (all uninfected mice non-significant), one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons for infected mice. (C)有代表性的流式细胞仪图和叠加图显示MAIT细胞内T-bet和RORγt染色。S.伤寒菌IL-12p35−/−, IL-12p40−/−, IL-23p19−/−，和WT(C57BL/6)小鼠(第7天P.I.)。(D)流式细胞仪图和(E)肺TCRβ的百分比+淋巴细胞(非MAIT T细胞和MAIT细胞)通过细胞内染色法直接从WT(C57BL/6)肺外产生IL-17A，IL-23p19−/−，和伊-6−/−感染10只小鼠6 S.Typhimurium BRD 509(第7天P.I.)数据显示，每组8~9只小鼠平均为±SEM，单个小鼠为8~9只。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons. See also fig. S3.
ROR、γ、t和T-bet在天真的MAIT细胞中的表达似乎是相互排斥的。17, 31)，但鼻内感染S.香豆素诱导T-bet的表达，导致MAIT细胞表达这两种转录因子(19)。考虑到在扩展MAIT细胞时对IL-23的要求(图4，A和B)及其在推动天真的传统T细胞向T细胞分化中的已知作用。H17子集(46–54我们研究了IL-23在感染后如何改变MAIT细胞中转录因子的表达。感染时S.T-bet表达率较低(P<0.0 5)，表达T-bet的MAIT细胞比例较低。IL-12p35−/−和IL-12p40−/−小鼠与WT小鼠比较(图4c)。在……里面IL-23p19−/−小鼠，T-bet的比例+RORγt−细菌感染时MAIT细胞增多，而WT小鼠多同时表达T-bet和RORγt(图4c)。此外，我们还观察到MAIT细胞群在转录因子表达上的类似变化。IL-23p19−/−小鼠感染龙舌兰NSW 150(图1)S3E)。
在……里面S.用细胞内细胞因子染色法检测肺组织中约50%的细胞和12%的非MAITαβT细胞产生IL-17A。(图4、D和E). 伊-6−/−小鼠非MAIT T细胞明显减少，而MAIT细胞无明显减少，产生IL-17A(图4、D和E)。相反，IL-23p19−/−小鼠MAIT细胞数量较少(图4B，只有5%~15%的MAIT细胞产生IL-17A，与rorγt的低表达相一致。图4、C和E)。非MAIT T细胞需要IL-6和IL-23才能获得最佳的IL-17生产，与以前的报告一致(55) (图4、D和E)。总之，这些数据表明，IL-23，但不是IL-6或其他细胞因子测试，是必不可少的MAIT细胞在肺部积累和维持MAIT-17档案后细菌肺部感染。
外源性IL-23恢复MAIT细胞增殖能力IL-23p19−/−小鼠
为了证实感染后肺内MAIT细胞积聚过程中对IL-23的要求，我们研究了恢复IL-23是否能挽救感染后MAIT细胞的积聚。IL-23p19−/−老鼠。为此，我们对IL-23的p19和p40亚基进行了质粒构建，该质粒与免疫球蛋白(Ig)fc区[IL-23-ig(56)]至IL-23p19−/−小鼠鼻内感染前1天流体力学注射S.然后在第7天检测肺内MAIT细胞的积聚。IL-23-Ig质粒在小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中可检测到IL-23。S4A)，与预期的蛋白质表达动力学符合(57)。在……里面IL-23p19−/−给小鼠注射IL-23-Ig，而不是对照质粒，MAIT细胞的蓄积情况与第7天的WT小鼠相当。观察到(图5，A和B)。这些累积细胞的转录因子谱向ROR、γ、t和T-bet共同表达(MAIT 17/MAIT-1表型)，与WT小鼠观察到的转录因子谱相似(图5c)。这些数据表明MAIT细胞在IL-23p19−/−小鼠具有增殖和维持RORγt表达的能力，这取决于IL-23的存在。IL-23-Ig质粒DNA(而非对照质粒)也能提高MAIT细胞ICOS的表达。图5d).
图5 注入IL-23-Ig质粒可恢复MAIT细胞在IL-23p19−/−小鼠感染后。(A)绝对数字和(B)T细胞从WT和WT肺分离出来的MAIT细胞百分比IL-23p19−/−10只经鼻感染小鼠6 S.Typhimurium BRD 509(第7天P.I.)IL-23p19−/−感染前1d，用重组IL-23-Ig质粒10μg或水动力注射对照Ig。数据显示为±SEM和小鼠个体。***P < 0.001, unpaired two-tailed Student’s t测试一下。(C)T-bet和RORγt在上述小鼠肺MAIT细胞中的表达。图显示门控MAIT细胞来自每组一只具有代表性的老鼠。(D)相对ICOS的表达(与WT C57BL/6小鼠比较)，IL-23p19−/−或ICOS−/−用IL-23-Ig的10μg或对照-Ig质粒处理小鼠24小时.数据显示为±SEM和小鼠个体。***P < 0.001, ****P < 0.0001, one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons test. See also fig. S4.
MAIT细胞表达高水平的IL-23受体，并对IL-23作出直接反应。
为了确定细菌感染过程中IL-23是否也直接影响MAIT细胞，我们检测了IL-23受体(IL-23R)的表达。伊-23rGFP/+杂合子小鼠[绿色荧光蛋白(GFP)表达与IL-23表达相关的报告小鼠](58)。流式细胞仪检测肺αβT细胞表达IL-23R的细胞占85%以上。图6a)。在急性细菌感染(第7天)中，肺内积聚的MAIT细胞下调了IL-23R的表达，并在感染后长期恢复到~74%的表达。图6a)。接下来，我们过继转移wt mait细胞(来源于长期的肺部)。S.毒鼠)伊-23r−/−小鼠，作为一种只有转移的MAIT细胞才能对IL-23作出反应的模型，或者IL-23p19−/−老鼠，感染这些老鼠S.[医]香菇图6B)。感染后，过继转移的WT MAIT细胞在肺部积聚的范围更大(~143倍)。伊-23r−/−小鼠与IL-23p19−/−小鼠(~7倍)与内源性MAIT细胞增殖的比较伊-23r−/−小鼠(~15倍)(图6，B和C，以及无花果。(第5条)。内源性MAIT细胞IL-23p19−/−或伊-23r−/−小鼠同样扩张(分别为23倍和15倍)。这一发现表明，在细菌感染期间，IL-23的有效性和MAIT细胞上IL-23R的表达对MAIT细胞的最佳扩增是必不可少的，尽管其他细胞因子可能会引起较温和的反应。我们的数据表明，MAIT细胞表达高水平的IL-23R，并对IL-23产生直接反应，导致其在感染部位扩张。
图6 MAIT细胞表达IL-23R并直接响应IL-23。(A)tcrβ中的gfp表达(指示IL-23R表达)。+从肺分离出的细胞伊-23rGFP/+未感染小鼠或经鼻感染后10只小鼠6 S.Typhimurium BRD 509(第7天或第100天P.I.)(B)用CD 45同型标记技术进行MAIT细胞转移和追踪的原理图。图表显示MAIT细胞(CD 45)+TCRβ+MR1-5-OP-Ru-四聚体+)从受体小鼠的肺中分离出颜色编码的与供者/受体细胞相匹配的细胞。感染后MAIT细胞数增加一倍。(C)MAIT细胞总数(CD 45.2)+内源性和CD45.1+(过继转移的)从…的肺中分离出来的IL-23p19−/−或伊-23r−/−10只小鼠5MAIT细胞(从CD 45.1顺式标记小鼠中分离，连续7天S.)，2周后，经鼻感染10例。6 S.Typhimurium BR 509数据显示，在第7天时，标准化数据的平均值为±SEM，单个小鼠呈折叠变化。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, P>0.05，单因素方差分析与Tukey的多重比较检验.另见图。中5。
IL-23以mr1-Ag依赖的方式驱动MAIT细胞的增殖。
接下来，我们将测试IL-23是否是一个足够的共刺激信号，以促进MAIT细胞在体内对合成抗原的积累和激活。为了解决这个问题，我们在鼻内注射合成5-OP-RU前1天，将IL-23-Ig质粒DNA水动力地注入WT小鼠体内。我们检测到IL-23-Ig处理的小鼠肺中MAIT细胞在初始接种5 op-Ru后第7天明显扩张，但未用对照质粒。图7a还有无花果。S4B)。MAIT细胞的这种富集是以剂量(5-op-Ru)依赖的方式(图7a还有无花果。(S4B)，虽然单用IL-23-Ig对MAIT细胞的绝对数量有很小但显著的影响(图7a)。接种对肺内非MAIT T细胞的绝对数量无明显影响(图7b)。此外，IL-23-Ig或5-op-Ru单独作用于MAIT细胞，对T-bet有一定的上调作用，但当IL-23-Ig与5-op-Ru(图7c)因此，转录因子的表达谱，作为细胞因子产生的指标，类似于被感染的小鼠。S.[医]香菇图3C)。因此，IL-23提供了足够的共刺激信号来触发MAIT细胞在体内的扩增和激活，并使MAIT细胞向MAIT-17/1表型倾斜。
图7 IL-23和合成的5-OP-RU抗原足以诱导MAIT细胞在体内的活化和聚集，增强对感染的保护作用。(A)MAIT细胞的绝对数量和(B)非MAITTCRβ的绝对数目+Nve WT(C57BL/6)小鼠或10μg重组IL-23-Ig质粒或对照质粒经水动力注射(第0天)后，于第8天从肺内分离细胞，第0、1、2、4天经鼻腔接种5-OP-RU，数据显示为±SEM。(C)T-bet和RORγt在小鼠肺组织MAIT细胞中的表达(A)。图表显示来自每组一只具有代表性的老鼠的数据。(D)(E)所示的疫苗试验实验方案。感染后几天。(E)细菌CFU计数军团菌10例鼻内感染后在指定时间点的肺部感染4未经治疗的小鼠CFU(开放方块)或单独注射IL-23-Ig(开放方格)或IL-23-Ig或对照-Ig+5-OP-RU(四剂鼻内注射)(分别为封闭和开放圆圈)的小鼠CFU。数据显示为±SEM和小鼠个体。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons test. See also fig. S4.
接下来，我们试图确定这些发现是否可以与人类MAIT细胞重新组合。为此，我们用5-OP-RU刺激正常供者外周血单个核细胞(PBMCs)，在IL-2存在下，与不含IL-23的情况下，共刺激13天，使细胞增殖到足够的数量，并巩固其细胞因子谱进行分析。细胞内染色检测IL-17和IFN-γ的产生.在不存在IL-23的情况下，5-OP-RU诱导了较强的IFN-γ反应，而当5-OP-RU与IL-23联合作用时，MAIT细胞产生IL-17的量增加，产生IFN-γ的细胞比例降低(见图)。中6、A和B)。单用IL-23可诱导细胞因子的产生。因此，与小鼠MAIT细胞相似，银刺激过程中IL-23的存在促使人类MAIT细胞向MAIT-17型反应。
IL-23加5 op-Ru启动的MAIT细胞可增强对龙舌兰
为了确定5-OP-RU联合IL-23是否能增强MAIT细胞对细菌感染的保护性免疫，我们首先通过尾静脉注射(一次，第0天)和5-OP-RU(4次，1~4天)(MAIT细胞接种)对小鼠接种IL-23-Ig。4至5周后，这些小鼠，以及单独接受IL-23-ig或对照-ig dna和5-op-ru的对照组小鼠，接受10次鼻内攻击。4CFU龙舌兰在第5天和第7天用CFU法测定肺内细菌载量。(图7D)。对照组小鼠在第5天至第7天的细菌负荷显著下降，表明细菌清除率与我们以前在WT C57BL/6小鼠中的数据一致。20)。5-op-Ru与IL-23-Ig联合接种后，小鼠的细菌载量明显低于对照组(未治疗、单独接种IL-23-Ig或对照-Ig+5-op-ru)(图7e)。与对照组相比，接种IL-23-Ig+5-OP-RU的小鼠第5天的细菌负荷下降50倍，差异最明显。
讨论
我们的发现表明，MAIT细胞在体内的激活不仅依赖于MR1和抗原，而且还需要共刺激信号，炎症细胞因子IL-23增强了MAIT细胞的最终增殖。尽管MR1在低水平上普遍表达(11–13造血细胞和上皮细胞均能在体外激活MAIT细胞(29, 59)负责在体内向MAIT细胞呈递抗原的细胞来源尚未被描述。使用不同的WT↔组合MR1−/−我们在此证明，BM-和非BM衍生细胞都能驱动MAIT细胞的激活，但主要的APC类型是由细菌感染的性质决定的。龙舌兰吞噬后不主动侵入细胞，但在肺泡巨噬细胞中复制。60)。因此，龙舌兰仅限于骨髓来源的肺巨噬细胞，这些巨噬细胞为MAIT细胞的激活提供了必要的信号.相反，对于S.Typhimurium，活跃地感染多种细胞类型，包括上皮细胞(61)非骨髓源性细胞对MAIT细胞的激活作用大于BM源性APC。在此背景下，bm衍生apc驱动mait细胞活化的能力低下，这可能是由抑制机制进化而来的。S.[医]香菇62–64).
除了Ag外，T细胞的激活还需要一个次级的“共刺激”信号，我们发现ICOS(而不是CD 80或CD 86)对MAIT细胞的激活有显著的影响。这一发现与非MAIT T细胞相比，ICOS在MAIT细胞上的高构成性表达水平是一致的。在适应性免疫反应中，ICOS共刺激参与了许多其他过程，包括T滤泡辅助细胞的形成和增强或抑制T细胞。H1和TH2炎症反应，视病原体而定(65, 66)，以及记忆CD4对细胞因子产生的共刺激作用。+T细胞(67)。MAIT细胞积累显著降低ICOS−/−鼠后沙门氏菌或军团菌感染提示ICOS信号通路促进MAIT细胞增殖。这一发现与未受ICOS缺陷影响的非MAIT T细胞和ILC数形成对比。ICOS-L既可在BM衍生的APC上表达，也可在非BM衍生的细胞上表达(67–71)。MAIT细胞扩展的依赖性ICOS−/−小鼠感染沙门氏菌相比较军团菌可能反映ICOS作为共刺激信号对上皮细胞和BM衍生细胞的更重要作用。
与传统的天真T细胞形成对比(72)和CD1d限制不变的NK T细胞(73)在CD 28-CD 80/CD 86相互作用对激活至关重要的情况下，CD 80/86-CD 28信号对MAIT细胞的激活似乎并不重要，这可能与MAIT细胞称为“效应记忆”细胞(14–17)。其他共刺激分子(如CD 137和CD 154)在幼稚的MAIT细胞上表达较低，尽管有一定比例的人MAIT细胞在体外培养时上调了CD 137(4-1bb)的表达。结核分枝杆菌溶解物74)。因此，我们的研究不排除CD 137在感染过程中的作用。
在天真的小鼠中，大多数mit细胞表达rorγt，而rorγt和T-bet的表达是相互排斥的(17)，但感染后，大多数MAIT细胞表达这两种转录因子(19)。同时观察到ROR、γ、t、T-bet双阳性细胞。ICOS−/−小鼠，但MAIT-1的比例增加(T-bet)+RORγt−、TH)细胞，提示icos在感染过程中维持MAIT-17表型的作用，如常规的CD4。+和CD8+T细胞(66, 75)。ICOS激动剂通过增加炎症细胞因子和IL-23R表达(66, 75).
IL-23是白细胞介素17产生T的功能分化所必需的。H17细胞，通过转录因子信号转导和转录激活因子3(STAT 3)途径稳定其表型。76, 77)。我们的研究结果表明，IL-23也是MAIT细胞增殖和分化所必需的，外源性IL-23的加入完全重建了IL-23缺乏小鼠的MAIT细胞增殖和表型。STAT 3功能缺失突变导致人类MAIT细胞和其他细胞缺乏(78)。虽然没有在这里直接测试，但我们推测IL-23也通过STAT 3来推动MAIT-17细胞的分化。
MAIT细胞转移实验还表明，IL-23直接作用于MAIT细胞，与IL-23R在MAIT细胞上的高表达水平一致。14, 79)在以前的研究中，细胞因子对T细胞的长期存活起着至关重要的作用。H17细胞，合并T细胞H1表型，并授予全TH17致病功能潜能39, 80, 81)。与其他T细胞亚群的结果一致(82质粒DNA中的IL-23增强了ICOS在MAIT细胞上的表达，提示通过增强ICOS的表达对MAIT细胞的激活有间接作用。相反，不像CD4+ TH17个细胞(39, 83)MAIT细胞的发育不依赖于IL-6，与常规T细胞相比，MAIT细胞激活的调控有一个关键的差异。H17个细胞。MAIT细胞的扩增似乎与细菌抗原负荷无关，因为在WT感染高峰时CFU计数相似，ICOS−/−，和伊-23−/−老鼠。此外，感染后MAIT细胞的扩增不需要IL-12或IL-18，这与体外观察并不总是反映体内反应的事实一致。84)。然而，在IL-23缺乏的小鼠中，MAIT细胞的增殖水平要低得多，提示MAIT细胞可能有其他的激活途径，IL-23可能在MAIT细胞的最大激活过程中发挥协同作用。除了他们在清除细菌感染方面的作用外，我们先前的研究也证明了这一点(20)和其他人对不同的细菌(85–87)，也有人建议MAIT细胞保护屏障完整性(88)并具有组织修复表型(89)。在此阶段，MAIT细胞的扩张和病原体清除的机制尚不清楚。
用5-op-Ru联合IL-23增强小鼠早期细菌清除能力(最明显的是在第5天)，这与我们先前的研究显示的MAIT细胞接种效果一致，即我们用5-op-Ru和CpG为MAIT细胞进行了预接种。20)。相反，MAIT细胞缺陷对细菌负荷的影响在第10天最明显。龙舌兰感染(20)。因此，MAIT细胞的启动与MAIT细胞可以形成一群具有记忆样回忆特性的细胞的概念是一致的。了解在感染期间驱动MAIT细胞的信号是可能加强预防随后肺部感染的策略的基础。因此，我们的研究结果不仅证实了MAIT细胞在保护性免疫中的作用，而且提示在某些情况下，MAIT细胞的作用可能会被增强。因为MAIT细胞可以同时产生IFN-γ和IL-17，这两种细胞都被证明对清除军团菌感染(90–92在这种环境下，确定MAIT细胞促进细菌清除的机制是很重要的。
我们的数据表明，MAIT细胞的激活需求大致相似，但不同于其他T细胞。由MR1提出的AG是一个不可或缺的信号1，BM-和非BM-衍生细胞都可以作为APC，这取决于病原体。在共刺激受体(信号2)中，ICOS对MAIT细胞的最佳激活起着至关重要的作用。IL-23直接作用于MAIT细胞，也可能通过上调ICOS表达、促进细胞增殖和使MAIT细胞向MAIT-17/1方向倾斜而间接作用。联合接种IL-23-Ig和5-op-RU可以激活MAIT细胞，增强对细菌感染的保护，通过利用驱动这种先天T细胞亚群的分子信号，证明了调节MAIT细胞的治疗潜力。
材料和方法
学习设计
这项研究的目的是确定MAIT细胞在体内活化的要求，特别是在细菌感染的情况下。流式细胞术计数和鉴定MAIT细胞，用CFU计数法测定WT-C57BL/6小鼠和不同基因缺陷小鼠肺组织的细菌载量。感染后进行分析军团菌或沙门氏菌并以抗原和细胞因子作为质粒DNA启动后，在不同条件下体外培养人PBMC MAIT细胞。利用BM嵌合体和同源标记细胞过继转移来验证研究结果，并了解哪些细胞类型对MR1和细胞因子受体的表达很重要。在小鼠研究中，根据图中所描述的每个实验的统计检验能力选择样本大小，并在图图中列出独立实验的数量。根据机构伦理鉴定，在实验终点或人道终点对小鼠进行安乐死。研究人员在进行免疫接种和感染时被蒙蔽了眼睛，但没有对分析视而不见。不同组小鼠的年龄和性别相匹配。雄性小鼠和雌性小鼠均使用。
小鼠与感染
小鼠被饲养在彼得·多尔蒂感染和免疫研究所的生物研究设施中(澳大利亚，墨尔本)。MR1−/−用Vα19繁殖小鼠iCα−/−MR1−/−老鼠(93)(来自华盛顿大学圣路易斯医学院，圣路易斯，MO)与C57BL/6小鼠和F1小鼠杂交。用尾dna聚合酶链式反应检测基因型。MR1如先前所述的轨迹(19)。IL-23R GFP报告小鼠(伊-23r+/GFP)C57BL/6和纯合子F1小鼠。伊-23r绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白老鼠。为了产生BM嵌合体，我们用致死性照射(2×5.5灰色，间隔3小时)使受体小鼠耗尽骨髓来源细胞。供体骨髓细胞(10例)7)通过尾静脉注射给受体小鼠。然后，小鼠在感染前休息8周，以使其骨髓来源细胞完全重建。经过墨尔本大学动物伦理委员会的批准，6到12周的老鼠(BM嵌合体除外)被用于实验。
化合物、免疫原和四聚体
5-OP-RU如前所述(94)并在使用前将其稀释至所需的磷酸盐缓冲液(Pbs)浓度。小鼠和人MR1和β2-微球蛋白基因在大肠杆菌包涵体，如前面所述，重新折叠和纯化(2, 95)。如前面所述，生成了MR1-5-op-RU和MR1-6-FP四聚体(1)。CD1d-αGalCer四聚体-藻红蛋白(PE)由D.Godfrey(墨尔本大学)提供。
细菌菌株
文化龙舌兰在37°C条件下，在添加链霉素(30~50μg/ml)的酵母提取物(BYE)中培养~16h，180 rpm摇动，达到对数相[光密度为600 nm(OD)]。600)，0.2至0.6]。对感染菌，在预热培养基中再接种2~4小时(OD)。600，0.2至0.6)，并估计1个OD值600 = 5 × 108/ml，用含2%BYE的PBS冲洗和稀释足够的细菌，经鼻给小鼠。用链霉素琼脂平板对接种物进行接种，计数CFU，验证细菌接种量。
过继转移供体小鼠感染S.Typhimurium BRD 509，按先前所述进行培养(19)。SL 1344和SL 1344Δ入侵(χ4370；最初由R.Curtiss III提供，华盛顿大学生物系，圣路易斯，MO)生长在LB或含有适当抗生素的卢里亚琼脂板上。按上述方法对小鼠进行接种准备和鼻内感染。19).
培养细胞感染S.人和小鼠细胞(10例)6(人：BSB-II；小鼠：LET 1)96]或巨噬细胞(人：THP-1；小鼠：BMDM)来源于24孔板，一式三份，用Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(DMEM)冲洗一次，再悬浮在10%胎牛血清(FBS)DMEM中，与对数期细菌在一定的多重感染(MOI)下共同培养1小时。用含10%FBS和抗生素的DMEM冲洗3次，再悬浮于含庆大霉素(100μg/ml)的10%庆大霉素0.5ml中，在37℃下培养1.5h，杀灭细胞外细菌。然后用PBS清洗两次细胞，用0.1%洋地黄素0.2ml溶解，在含有适当抗生素的卢里亚琼脂平板上扩散，并在37℃下孵育一夜进行细菌计数。
鼻内感染
鼻内接种S.霸王龙，龙舌兰对异氟醚麻醉小鼠进行50μ1/nares抗原(76 pmol5-op-RU)的检测.CO对小鼠进行安乐死2感染后不同时间点窒息，经心脏注射10 ml RPMI 1640冷肺后再进行进一步处理。
制备单细胞悬液时，用手术刀将肺切成细片，用胶原酶Ⅲ(3mg/ml；Worthington，Lakewood，NJ)、脱氧核糖核酸酶(5μg/ml)和2%FBS在RPMI 1640中温和摇动90 min。细胞过滤(70μm)，用PBS/2%FBS洗涤。红细胞用低渗三氯化铵溶液在37°C下溶解5 min，约1.5×10。6流式细胞仪分析前，用MR1四聚体和抗体染色，洗涤、过滤(40μm)。
感染肺部细菌计数的测定
在含链霉素的BCYE琼脂(30μg/ml)上，计数感染小鼠(每组×5只)电镀匀浆后的肺内细菌载量。在有氧条件下，在37°C条件下，4天后进行菌落计数。
过继转移
由于在天真的C57BL/6小鼠中MAIT细胞频率较低，在过继转移实验之前，通过鼻内感染10只小鼠，使MAIT细胞数量增加。6CFUS.如上文所述，在50μ1的PBS中放置7天的Typhimurium BRD 509(19)。7天后处死小鼠，制备单细胞悬液，活tcrβ。+CD 45+MR1-5-OP-Ru四聚体+使用BD FACSAria III对细胞进行分类。共有10个。5将MAIT细胞经侧尾静脉注入受体小鼠体内。小鼠在转移后休息2周，以使MAIT细胞在随后的感染攻击前稳定下来。
MAIT报告细胞活化试验
MAIT细胞报告激活试验基本上按照以前的报告(2, 37)。将过表达MAIT TCR克隆AF-7(Jurkat.MAIT)的Jurkat细胞与化合物共同孵育，C1R细胞高表达MR1(CIR.MR1)16h。用流式细胞仪(FACS Canto II(BD Biosciations))分析前，用PE-Cy7结合抗CD3(1：300；UCHT 1，eBioscience)和APC结合抗CD 69(1：25；BD生物科学)染色。通过表面CD 69表达的增加来检测Jurkat.MAIT的活化。
体外人PBMC检测
健康献血者经墨尔本大学人类研究伦理委员会(1853263.3)批准后，从澳大利亚红十字会(ARCBS)获得人外周血单个核细胞(PBMCs)。在4个独立实验中，在重组人IL-23(20 ng/ml)存在或不存在的情况下，用0.1μM5-OP-RU刺激PBMC，第5天加入IL-2(10单位/ml)，5小时后用C1R-MR1再刺激5h。在过去的4小时内添加Breceldin A(BD生物科学)。活细胞(用水活/死染料，热费舍尔科学)染色后，用抗CD3(PE-CF 594)、抗CD8α(APC)、抗CD4(APC-Cy7)和抗-Vα7.2(BV 785)单克隆抗体(MAb)和MR1-5-OP-RU-链霉亲和素-PE四聚体染色，然后用抗-IL-17A(PE-Cy7)和抗IFN-γ(AF 700)单克隆抗体染色。染色细胞用LSRFortessa流式细胞仪(BD生物科学)进行分析。
抗体与流式细胞术
免疫小鼠CD3(145-2C11，PE-Cy7)，CD4(GK1.5，APC-Cy7)，CD 19(1D3，PerCP-Cy5.5)，CD 137[1AH2，异硫氰酸荧光素(FITC)]，CD 45.2(104，FITC)，IFN-γ(XMG1.2，PE-Cy7)，TCRβ(H57-597，APC，或PE)和IL-17A(TC11-18H10，PE)。抗CD8α(53~6.7，PE)，CD 45.1(A20，PE)，CD 27(LG.7F9，APC)，RORγt(B2D，APC)，T-bet(4B10，PE-Cy7)。对CD45.1(A20，FITC)，CD 28(E18，FITC)，CD 154(MR1，PE)，ICOS(7E.17G9，PE)，CD 86(PO3，PE)，TCRγδ(GL3，APC)，CD 127(A7R34，APC)，CD3(17A2，PerCPCy5.5)和血统鸡尾酒(FITC)购买。为阻断非特异性染色，将MR1-6-FP四聚体和抗FC受体(2.4G2)在室温下孵育15 min，在PBS/2%FBS中用Ab/四聚体鸡尾酒孵育。抗体染色中加入7-氨基放线菌素D(Sigma-Aldrich)。
抗人CD3(UCHT 1，PE-Alexa Fluor 594)，TCR-Vα7.2(3C10，APC)，CD 161(HP-3G10，PE-Cy7)，TNF-α(MAb11，太平洋蓝)和活力染料(ZombieHuang)。抗IFN-γ(25725.11，FITC)和CD 69(FN 50，PE)抗体来源于BD，抗CD3(UCHT 1，APC)来源于eBioscience。
在LSRII、LSRFortessa或CantoⅡ(BD生物科学)流式细胞仪分析前，用1%多聚甲醛固定细胞。细胞内细胞因子染色采用高尔基塞(BD生物科学)。以PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯)/离子霉素(分别为20 ng/ml和1μg/ml)在37℃刺激3h为阳性对照。表面染色前，在4°C下加入可固定活性染料(EBioscience)30 min。在室温下进行表面染色，用BD固定/渗透试剂盒(BD，Franklin Lake，NJ)或转录缓冲染色法(EBioscience)对细胞内细胞因子进行染色。用FLOJO 10软件进行流式细胞仪数据分析。MAIT信元的选通操作如前所述(20).
构建物、水动力注射和MAIT抗原传递
IL-23-Ig质粒(PEF-BOS-IL-23-IgG 3)和对照Ig(PEF-BOS-IgG 3)由瑞士Burkhard Becher提供.从质粒中表达的IL-23已被鉴定为(56, 97)。水动力注入如上文所述(98)，将预热小鼠置于预热锥形抑制装置中。将编码IL-23-Ig或对照载体质粒载体的10微克注射在1.6至1.8毫升的转运-EE流体力学传递液(MIR 5340，Mirus Bio LLC)中，时间为10s(99)。MAIT抗原(5-OP-RU；50μ1，1μM)分别于注射后4次(第0、1、2和4天)、2次(第0天和第1天)或1次(第0天)在鼻腔内注射。然后在第7天对小鼠进行安乐死，以检测MAIT细胞的数量和功能，或留一个月用于接种MAIT细胞以形成记忆。龙舌兰如前所述(20).
酶联免疫吸附法检测BALF中IL-23
用18毫米针和装有0.6毫升冷PBS的注射器进行BAL手术。针插入气管，PBS注射吸入三次，缓慢。每只小鼠获得约0.4ml的BALF，并保存在冰上。离心后收集上清液，在−80°C下保存，进行进一步实验。用小鼠IL-23QuantikineELISA(酶联免疫吸附法)试剂盒(R&D系统)根据制造商的指示测定BALF中IL-23的浓度。
统计分析
使用Prism GraphPad软件(版本7.0，La Jolla，CA)进行统计测试。组间比较使用学生的t两组间的检验和多组间的单因素方差分析(ANOVA)检验(视情况而定)。所有实验至少独立进行两次，结果相似。
