导言 中性粒细胞是人体免疫监视和宿主防御的重要组成部分，因为它们有能力轻易消灭入侵的病原体。然而，由于中性粒细胞具有相当大的破坏能力和对健康组织造成损害的潜力，因此对中性粒细胞内平衡进行严格调控是至关重要的。中性粒细胞内平衡是通过粒发生、骨髓储存和释放、血管内增强以及随后的清除和破坏之间的良好平衡来维持的。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)/csf 3是稳定状态下粒细胞生成的主要调节因子，缺乏G-CSF受体的小鼠表现为严重的中性粒细胞减少。 1 4 )。在压力或炎症性侮辱之后，G-CSF和一系列其他的介质，如ELR + CXC趋化因子增加，功能进一步促进粒细胞生成和中性粒细胞向组织( 5 6 )。然而，这是至关重要的，这种中性粒细胞炎症是严格调控和有效解决，并恢复平衡状态。越来越多的人越来越理解中性粒细胞在平衡和炎症过程中在调节自身周转中所起的重要作用( 7 8
过度活跃和持续的中性粒细胞反应与一系列慢性疾病的病理有关，包括慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化和哮喘。在哮喘方面，中性粒细胞数量增加与疾病的严重程度、肺功能受损、对皮质类固醇反应减弱、恶化和死亡有关( 8 14 )。然而，临床对中性粒细胞炎症的控制令人失望，未能改善疾病的病理。 15 21 )。一个潜在的解释是，寻求减少中性粒细胞炎症的策略可能无意中破坏中性粒细胞的调节功能。
在本研究中，我们证明了在家庭尘螨(HDM)小鼠过敏性气道疾病的动物模型中，慢性、系统性中性粒细胞的耗竭会意外地导致T助手2(T)的加重。 H 2)炎症，粘液分泌增加，气道阻力增加。中性粒细胞衰竭动物炎症加重的主要原因是G-CSF浓度明显增加，这是由于凋亡的中性粒细胞未能在周围触发负反馈白介素23(IL-23)-IL-17-G-CSF调节轴，这是传统设计的限制中性粒细胞产生和从骨髓中动员的结果。在我们的变应性气道疾病模型中，累积的G-CSF通过促进T，在早期直接增强过敏原致敏。 H 2细胞因子由2型固有淋巴样细胞(ILC2s)产生，作用于骨髓祖细胞，促进单核细胞增多。这种单核细胞增多导致单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)抗原表达增强.因此，我们强调G-CSF在促进ILC 2功能和抗原表达方面的作用，以及更广泛的中性粒细胞在负调节2型变应性气道炎症中的作用。
结果 HDM给药引起小鼠肺和气道中性粒细胞炎症 我们建立的过敏性气道疾病HDM模型(图)。(S1a)( 22 )引起混合粒细胞炎症，并伴有明显的中性粒细胞减少。在这个模型中，中性粒细胞数量和百分比在肺中的明显增加(图1)。(分别为S1、B和C)和气道(图3)。在HDM暴露1周后，分别观察到S1、D和E，并持续至3周，此时嗜酸性粒细胞是最明显的粒细胞(图)。(1、B至E)。在hdm处理的动物中观察到的中性粒细胞炎症的升高与经典elr表达水平和蛋白浓度的增加相一致。 + CXC趋化因子CXCL 1/KC(图1)S_1，F~H)和中性粒细胞造血调节因子G-CSF(图1)。(S1，I至K)。中性粒细胞衍生蛋白酶髓过氧化物酶(MPO)S2，A和B)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9；图1)。S2，C和D)常被用作中性粒细胞炎症的临床替代物，并且发现暴露于hdm的小鼠肺和气道中的水平会升高。虽然MPO水平与中性粒细胞浸润有关，但当中性粒细胞减少时，气道MMP-9水平继续升高，这可能反映了这种蛋白酶的多种细胞来源。
中性粒细胞耗竭加重T H 2暴露于HDM小鼠的炎症与气道重塑 为探讨中性粒细胞在我们过敏性气道疾病模型中的作用，给小鼠注射抗Ly6G(1A8)中性粒细胞耗竭抗体( 23 )。采用不同的1A8剂量方案，评价HDM暴露小鼠中性粒细胞耗竭的最佳策略(图二)。(S3A)，以及以前报告的( 24 采用流式细胞术门控法检测中性粒细胞，使其与Ly6G表达无关。(S3B)，中性粒细胞定义为CD11b + CD11c 罗氏 ，F 480 − ，和Ly6C 中间型 ...单次腹腔注射100μg的1A8就足以完全减少肺内中性粒细胞的数量(图)。S3，C和E)，气道(图1)。S3，D，E)，血(图3)。和脾(图3)。S3G)单次HDM暴露后24小时，骨髓中有中性粒细胞数(图1)。S3H也部分减少。在HDM变应性气道疾病模型的整个3周期间，使用这种给药方案( 图1A 还有无花果。在肺的所有时间点，中性粒细胞数量持续下降( 图1B )、航空公司( 图1c )和血(无花果。与免疫球蛋白G2a(IgG2a)同工型控制抗体(2A3)处理的小鼠比较。然而，骨髓中性粒细胞的耗竭在以后的时间点并不明显(图)。(S3K)。抗Ly6G1A8抗体已成为耗尽中性粒细胞的首选策略。 23 )，由于这些细胞具有选择性表达( 25 26 )。Ly6G表达的中性粒细胞特异性进一步得到CatchupLy6G报告小鼠的支持，尽管本研究中少数嗜酸性粒细胞的转基因活性较低。 27 )。在我们的手中，Ly6G在淋巴细胞和单核细胞上基本上没有表达，但是在骨髓、血液和肺中的嗜酸性粒细胞中检测到低水平的磷酸缓冲液生理盐水(Pbs)和HDM处理的小鼠(图)。(S4，A至C)。然而，1A8在HDM处理的小鼠中选择性地耗尽了中性粒细胞，对嗜酸性粒细胞数量和淋巴细胞数量没有影响，而在HDM/1A8处理的动物中，单核细胞却意外地增加(图1)。(S4，D至F)。然而，在PBS小鼠中，1A8可观察到肺嗜酸性粒细胞数量略有减少(图1)。(S4F)。
图1 经HDM暴露3周后，嗜中性粒细胞耗竭的小鼠出现2型炎症反应增强. (A Balb/c小鼠每周3次腹腔注射HDM或PBS，每次给药前24小时腹腔注射中性粒细胞消耗抗体100μg，1A8，或同类型对照抗体2A3。在24小时、1周和3周时间点(每次在最后一次暴露24小时后)，收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(Ŧ)。肺内中性粒细胞总数( B )和航空公司( C )流式细胞仪检测。( D )用台盼蓝排斥法检测HDM暴露3周后肺组织细胞总数。( E 代表H&E染色的小鼠肺切片经PBS或HDM染毒3周后，用2A3或1A8处理。( F 3周时用流式细胞术测定肺组织嗜酸性粒细胞数。CD4数 + T细胞表达T1ST2( G )或IL-13( H PBS/HDM暴露3周后，用流式细胞仪检测肺组织中PBS/HDM浓度。( I HDM/PBS暴露3周后，用ELISA法测定血清中HDM特异性IgE和IgG 1的浓度。图中显示了两个独立实验的数据，每组四到六只老鼠。结果为均值±扫描电镜。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 using Mann-Whitney statistical test.
用HDM暴露3周，建立了过敏性气道疾病的临床特征。 22 )。此时，尽管1A8处理的hdm小鼠的中性粒细胞数量显著减少，但这些动物的肺部细胞总数实际上有所增加( 图1d )，而气道中的总数量略有增加，尽管与对照动物相比并不显著(图5)。(S5A)。经苏木精和伊红染色肺切片观察，发现HDM暴露的中性粒细胞耗竭小鼠肺部炎症增加。 图1E )。接下来，我们试图确定在HDM治疗过的嗜中性粒细胞耗竭小鼠中必须增加的群体的性质，以解释尽管中性粒细胞丢失，但总炎症增加的原因。暴露于HDM的嗜中性粒细胞衰竭小鼠肺内嗜酸性粒细胞增多( 图1f )和气道(无花果。与对照组相比，用HDM治疗的小鼠，虽然在气道中同样没有达到意义。此外，CD4的数量 + TH 两个肺中有2个细胞( 图1 G和H )和气道(无花果。HDM给药3周后，嗜中性粒细胞耗竭小鼠的S5C较对照组显著升高(P<0.01)。与大T保持一致 H 2 HDM暴露3周后，中性粒细胞耗竭动物的炎症反应明显增加，血清2型抗体水平均显著升高(图二)。(S5D)和HDM-特定( 图1i IgE和IgG 1较2A3对照组升高。H&E染色肺切片观察( 图1E )暴露于HDM暴露的嗜中性粒细胞耗竭小鼠的许多气道被黏液堵塞。因此，1A8处理后，hdm暴露小鼠主要气道粘蛋白的肺组织表达增加。 MUC5AC (无花果)S5E)，伴随着气道MUC5AC蛋白的增加(图)。S5F)相对于2A3/HDM动物。IL-13是我们的过敏性气道疾病模型中上皮型MUC5AC产生的主要诱导剂，因此，白细胞介素-13在嗜中性粒细胞缺乏的小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中浓度升高(图1)。(S5G)，与增广T保持一致。 H 2在这一组内的反应。此外，BALF IL-13浓度与HDM组MUC5AC蛋白水平呈显著相关(图二)。(S5H)。随着气道阻塞和黏液堵塞，中性粒细胞耗竭的HDM治疗动物的基础气道阻力比2A3/HDM对照组增加(图二)。S5I)，气道阻力与BALF MUC5AC浓度相关(图1)。(S5J)。然而，中性粒细胞耗竭后HDM暴露小鼠肺功能的变化仅限于基线气道阻力，与2A3/HDM小鼠相比，其气道高反应性与2A3/HDM小鼠相比，无明显差异(P>0.05)。(中6)。
白细胞介素2衍生T细胞早期增高 H 2种细胞因子支持在嗜中性粒细胞缺乏的小鼠体内观察到的2型增强型炎症。 鉴于中性粒细胞耗竭对抗原特异性T细胞反应和2型抗体生成的显著影响，我们质疑中性粒细胞在hdm暴露后早期调节过敏原致敏的潜在作用。 图2A )。T型 H 2种细胞因子在致变应性气道疾病变应原模型中的2型炎症及相关抗体反应中起着重要作用。 28 )。相应地，原型T的水平 H 2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13在HDM暴露1周后，与对照组相比，在BALF中的两种蛋白水平均显著升高(P<0.0 5)。 图2B )和 IL4 , IL5 ，和 IL 13 从气道派生的单元中的消息(图)。S7A)。这种表型在肺组织中是保守的，尽管不那么明显，在蛋白质水平(图)。S7B)和成绩单(图二)。(S7C)。我们接下来要找出T升高的细胞来源。 H HDM暴露1周时，中性粒细胞耗竭动物中有2种细胞因子。肺上皮(CD 45) − 埃帕姆 + )，内皮细胞(CD 45) − 埃帕姆 − CD 31 + )和白细胞(CD 45) + )用荧光活化细胞分选法(FACS)从PBS或HDM小鼠中分离1周(图1)。S8A)检测T基因的表达 H 2细胞因子。 IL4 , IL5 ，和 IL 13 仅在白细胞中检测到信息，并在HDM攻击时增加(见图)。(S8B)。白细胞介素2和CD4 + TH 2细胞被经典地认为是T的主要来源 H 过敏性气道疾病变应原模型中的2种细胞因子(英文) 28 )，以及对IL-13 GFP报告小鼠的评估( 29 )给予HDM 1周，显示ILC2s是此细胞因子在早期时间点的主要来源(图)。(第8c条)。
图2 增广T H 2白细胞介素2(ILC2s)在嗜中性粒细胞耗竭小鼠体内产生细胞因子1周。 (A Balb/c小鼠每周3次腹腔注射HDM或PBS，每周3次，每次给药前24小时腹腔注射中性粒细胞耗竭抗体(1A8)100μg，或同类型对照抗体2A3(2A3)。在最后一次给药后24小时，收集BALF(Ŧ)。( B 用ELISA法检测BALF中IL-4、IL-5、IL-13蛋白的浓度.在一些实验中，CD4 + 用流式细胞术(FACS)在末次HDM暴露后24h从气道中分离T细胞和ILC2s(每点从3只小鼠中分离)，进行mRNA基因表达分析。( C )相对表达 伊-4 , 伊-5 , 伊-13 ，和 GATA 3 用qPCR方法检测HDM小鼠BAL中T细胞和ILC2s的表达。在同一时间点，IL-13的数目 + ILC2s和IL-5 + ILC2s( D IL-13和IL-5在ILC2s中的几何表达式( E )用流式细胞仪检测BAL。图中显示了两个独立实验的组合数据，每个实验中每组4到6只老鼠(B、D和E)，或者来自一个实验，其中每个数据点代表三只独立小鼠(C)的细胞集合。结果为均值±扫描电镜。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 using Mann-Whitney statistical test.
随后，ILC2s和CD4 + 用流式细胞仪分离T细胞。S9)来自航空公司( 图2C )和肺(无花果)。对照组和嗜中性粒细胞耗竭小鼠用hdm攻击1周，并检测编码T基因的表达情况。 H 2细胞因子。在这个早期时刻，CD4 + T细胞是白细胞介素4(IL-4)的主要来源，在中性粒细胞缺乏的动物肺组织中，T细胞的表达显著升高(图二)。(第10段)。相反，IL-2是IL-5和IL-13的主要来源( 图2C 还有无花果。在中性粒细胞缺乏的动物的气道ILC2s中，它们的水平显著升高( 图2C )，与这些小鼠BALF中这些细胞因子水平的显著升高相一致。支持这些发现，T的主转录调节因子 H 2细胞因子gta-3在肺CD4中的mRNA表达增强。 + T细胞(图1)S10)和气道ILC2s( 图2C )来源于嗜中性粒细胞耗竭的小鼠。细胞内细胞因子染色和流式细胞分析支持这些说法，因为，而肺和气道的ILC2s总数(图)。S11A)和比例(图1)。S11、B和C)和编号( 图2D 还有无花果。白细胞介素2产生白细胞介素13或白细胞介素5的S11，D至F在嗜中性粒细胞缺乏的动物中没有持续升高，以细胞为基础产生的细胞因子数量(按几何平均数判断)显著升高( 图2e 还有无花果。(S11，D至F)。
HDM暴露中性粒细胞耗竭小鼠骨髓祖细胞池中moDC升高及其抗原表达的研究 除了T H 2树突状细胞(DC)的环境、抗原取样和呈递是变应原致敏和建立变态反应气道疾病模型中2型适应性反应的关键。伴随着ILC 2衍生T的增加 H 中性粒细胞耗竭小鼠1周的细胞因子对肺Ly6C的影响显著。 低层 和Ly6C 高 单核细胞( 图3A )。虽然这种增加在给予hdm的嗜中性粒细胞耗竭的小鼠中最为明显，但在嗜中性粒细胞缺乏的pbs处理的动物中也很明显。单核细胞标记CD 115染色的精确切肺切片(PCLSS)显示，HDM注射中性粒细胞贫化动物肺中单核细胞数量的增加是明显的。S12A)。随后，嗜中性粒细胞耗竭的动物也出现肺moDC增加，这在给HDM治疗1周的动物中再次表现得最为明显( 图3B )。出乎意料的是，这种表型并不局限于modc，肺CD11b明显增加。 + 常规发展中国家(CDCS)和CD 103 + CDCS(图1)S12B)在嗜中性粒细胞缺乏的小鼠体内也观察到。
图3 暴露于HDM的中性粒细胞耗竭小鼠表现出更强的单核细胞增多、DC数和抗原呈递. BALB/c小鼠经鼻给予HDM或PBS，每周3次，连续1周。在每次注射hdm/pbs前24小时，小鼠腹腔注射中性粒细胞消耗抗体100μg，1A8，或同类型对照抗体2A3。在最后一次HDM/PBS暴露后24小时，收集肺组织。( A )被鉴定为Ly6C的肺单核细胞亚群 低层 和Ly6C 高 流式细胞仪计数。( B )流式细胞仪检测肺moDC的数量。机动部队的数目( C )和CD 86 + MODC( D )流式细胞仪计数MLN。在一些实验中，最后剂量的hdm与100μg的lexa Fluor 488标记的OVA( E )，并在最后一次暴露后24h收集MLN(Ŧ)。( F )OVA的数目 + 流式细胞仪计数MLN中的moDC。图中的数据来自两个独立实验，每组四到六只老鼠(A到D)，或者一个实验，每组五只小鼠(F)。结果为均值±扫描电镜。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 using Mann-Whitney statistical test.
DC的激活和迁移到引流淋巴结和随之而来的过敏原特异性T细胞反应的启动是过敏原敏化的组成部分。在HDM模型中，moDC和CD11b + CDCs是将抗原转运到引流纵隔淋巴结(MLN)中不可或缺的部分。 28 30 )。总和已激活的模数转换器数目( 图3 C和D )和CD11b + CDCS(图1)S12、C和D)在嗜中性粒细胞耗竭的HDM动物的MLN中增加.为了确定暴露于hdm的中性粒细胞贫化动物的抗原表达是否增强，2A3和1A8处理的小鼠被注射hdm 1周，alexa Fluor 488标记的卵清蛋白(Ova)与最后剂量的变应原( 图3e )。OVA数 + 中性粒细胞耗竭小鼠的moDC在MLN中也显著升高( 图3f )，证明它们能有效地将抗原运送到局部淋巴结。尽管OVA也出现了同样的趋势 + CD11b + CDCS(图1)S12E)，中性粒细胞耗竭动物的增加未达到统计学意义。支持在HDM处理的中性粒细胞缺乏的小鼠体内抗原提呈增加，这些动物的MLN T细胞表达了更高水平的激活标记物ICOS(图1)。S12F)和PD1(图1)。S12G)并表现出较强的增殖(图5)。(S12H)。因此，在增强T中增强抗原表示 H 2在HDM暴露后1周致敏过程中，嗜中性粒细胞减少的动物体内观察到的细胞因子环境有利于T的升高。 H 2晚期见炎症。
为了理顺中性粒细胞缺乏的小鼠肺中单核细胞数量和随后产生的modc的积累，我们评估了经典单核细胞趋化因子ccl 2和cx的肺浓度。 3 CL1暴露于HDM后1周。尽管HDM导致CCL 2和Cx浓度增加 3 CL1，这些趋化因子在缺乏中性粒细胞的小鼠中没有进一步升高，因此不能解释在这些动物身上观察到的组织单核细胞增多(图)。S13A)。PCLS分析显示，在中性粒细胞缺乏的HDM暴露动物中，单核细胞的血管内池增加。S12A)。因此，流式细胞仪分析显示中性粒细胞的减少导致血液中Ly6C的增加。 低层 和Ly6C 高 PBS和HDM处理动物的单核细胞( 图4A )-因此，在局部趋化因子梯度的作用下，提供了更大的单核细胞循环池，使其向肺内渗出。随后，我们质疑骨髓祖细胞池的改变是否可以解释中性粒细胞耗竭后单核细胞数量的系统性变化。相应地，单核细胞-树突状细胞祖细胞(MDPs)的百分比 31 32 )，定义为CD 115。 + ，系系 − ，c-Kit + ，以及Flt-3 + (无花果)在HDM暴露1周后，小鼠骨髓中S13B含量明显升高(P<0.01)。 图4B )。近年来，人们认为MDPs分化为常见的树突状细胞祖细胞(CDPs)。 32 )，这是第一个承诺的DC前体细胞产生CDC亚群，也被证明是普遍升高的中性粒细胞耗竭的小鼠。因此，CDPs的百分比被定义为CD 115。 + ，系系 − ，c-Kit − ，Flt-3 + 、CD11b − ，和CD11c − (无花果)在嗜中性粒细胞缺乏的动物中，S13B也被证明是升高的( 图4B )。因此，中性粒细胞的减少导致骨髓中MDPs和CDPs的增加，最终导致肺中单核细胞和DC的数量增加。
图4 由于IL-23-IL-17-G-CSF轴失调，嗜中性粒细胞耗竭的小鼠骨髓中单核细胞和DC祖细胞的数量增加。 BALB/c小鼠经鼻给予HDM或PBS，每周3次，连续1周。在每次注射hdm/pbs前24小时，小鼠腹腔注射中性粒细胞消耗抗体100μg，1A8，或同类型对照抗体2A3。在最后一次HDM/PBS暴露后24小时，收集BALF、肺组织、血液和骨髓。( A )Ly6C的数目 低层 和Ly6C 高 流式细胞术测定血液中单核细胞的含量。( B 流式细胞术检测骨髓中MDPs和CDPs的含量。( C 用ELISA法测定血清、肺组织匀浆及BALF中G-CSF的浓度.表达 参3 (G-CSF基因)； D ), IL 17 (E )，以及 IL 23 (F )用qPCR法检测全肺组织。( G )图示组织中性粒细胞通过调节IL-23-IL-17-G-CSF轴限制造粒的负反馈途径。图显示了两个独立实验的数据，每组四到六只老鼠。结果为均值±扫描电镜。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 using Mann-Whitney statistical test.
嗜中性粒细胞耗竭小鼠IL-23-IL-17-G-CSF轴失调 接下来，我们试图确定是什么介质驱动了中性粒细胞缺乏的动物骨髓中增强的祖细胞池，以及随后肺单核细胞和树突状细胞的增加。用蛋白质组轮廓仪阵列半定量评价HDM给药1周后对照组和中性粒细胞耗竭小鼠血清中细胞因子、趋化因子和蛋白酶的变化。虽然通过蛋白质组剖面分析观察到不同介质的差异水平，但在中性粒细胞缺乏的动物中，G-CSF的明显增加是特别值得注意的(图一)。(第14段)。鉴于G-CSF受体CSF3R在MDPs和CDPs( 33 )据报道，使用G-CSF促进粒细胞生成的中性粒细胞患者单核细胞增多( 34 )。随后，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清、肺组织匀浆和BALF G-CSF水平，结果表明，pbs-和hdm处理的小鼠中性粒细胞含量均明显升高( 图4c )。G-CSF浓度的增加不仅反映了中性粒细胞消融后G-CSF的内化减少，因为肺。 参3 在嗜中性粒细胞缺乏的小鼠中，基因表达增强。 图4D ).
以前的研究表明G-CSF的表达受到IL-17的显著控制。 35 37 )，白细胞介素-17(IL-17)来源于组织内T细胞群，在稳态过程中对G-CSF的调节起核心作用( 38 39 )。值得注意的是，蛋白质组分析显示，HDM暴露的中性粒细胞缺失动物的IL-17水平有所升高(图一)。(第14段)。因此，事实证明 IL17A 嗜中性粒细胞耗竭小鼠肺组织表达明显升高，HDM暴露后肺组织表达增强( 图4e )。从HDM处理的动物肺中分离到的T细胞和ILC2s的表达分析表明，T细胞是IL-17的主要来源，而从中性粒细胞耗竭的小鼠中产生的细胞因子更多(图)。S15A)。这得到了流式细胞术的支持，两者都是CD4。 + αβT细胞和γδT细胞来源于嗜中性粒细胞耗竭的小鼠，给药1周后产生更多的IL-17(图1)。中15、B和C)。IL-23是IL-17表达的一种强有力的调节因子，在稳态过程中，巨噬细胞和树突状细胞吞噬迁移、凋亡中性粒细胞，抑制其固有的IL-23的产生。 38 39 )。因此，我们质疑嗜中性粒细胞缺乏的小鼠的中性粒细胞不能到达肺是否会导致IL-23浓度的增加，从而合理地增加白细胞介素-17，并最终导致G-CSF的增加。因此， IL 23 结果显示，hdm对嗜中性粒细胞缺乏的动物肺组织中的表达有明显的促进作用(1周)。 图4f )。流式细胞仪分析显示居民CD11c + 巨噬细胞和modc是hdm治疗小鼠白细胞介素23的主要来源，白细胞介素23的数量增加。 + MODC存在于中性粒细胞缺乏的动物中(见图)。(S15D)。此外，CD11c + 从中性粒细胞耗竭的hdm暴露小鼠产生的巨噬细胞和moDC在每细胞基础上产生的白细胞介素-23比从HDM/对照抗体处理的动物产生的更多(图一)。S15、E和F)。因此，外周反馈系统的破坏，通常由肺浸润的、凋亡的中性粒细胞调节，导致我们的1A8小鼠的G-CSF水平升高( 图4g ).
G-CSF中和降低单核细胞增多和T升高 H 2中性粒细胞耗竭HDM小鼠细胞因子水平观察 接下来，我们试图确定在我们的HDM模型中，G-CSF的中和是否会阻止骨髓祖细胞和组织单核细胞在中性粒细胞缺乏的动物身上的增强。用2A3/1A8和抗G-CSF中和抗体/对照( 图5A )。中性粒细胞集落刺激因子(G-CSF)使HDM暴露动物中性粒细胞显著减少( 图5B )，强调这一中介在此模型中定义中性粒细胞减少方面的突出作用。肺Ly6C升高 低层 和Ly6C 高 图5c )经抗G-CSF治疗后，在HDM处理的小鼠中观察到的单核细胞完全消失.此外，抗G-CSF还可降低骨髓MDPs和CDPs的百分比( 图5d )在嗜中性粒细胞耗竭的小鼠中，暴露于HDM中1周，达到2A3处理的动物所观察到的水平。因此，由于中性粒细胞减少，G-CSF升高，导致骨髓祖细胞增多，循环和组织单核细胞增多。令人放心的是，当白细胞介素-17在HDM暴露的中性粒细胞耗竭小鼠中中和时，该表型大部分被重新调整，从而验证了这种细胞因子在确定G-CSF水平方面的重要性(图)。S16A)和相应的组织中性粒细胞的变化(图)。S16B)和单核细胞(图1)。S16C)和骨髓祖细胞。(S16D)。
图5 G-CSF中和增强的单核细胞、骨髓祖细胞和T细胞 H 2细胞因子在中性粒细胞耗竭的HDM小鼠体内观察到。 (A Balb/c小鼠，每周3次，每周3次，连续1周。在每次给药前24小时，分别用100μg中性粒细胞耗竭抗体1A8或同工型对照抗体2A3治疗小鼠。为了中和G-CSF，小鼠在每次给药前24小时腹腔注射100μg抗G-CSF或同类型对照2A3。在最后一次给药后24小时，收集支气管肺泡灌洗液、肺组织和骨髓(Ŧ)。肺及气道中性粒细胞数目( B )和肺Ly6C 低层 和Ly6C 高 单核细胞( C )流式细胞仪检测。( D 流式细胞术检测骨髓中MDPs和CDPs的含量。( E 用ELISA法测定BALF、IL-4、IL-5、IL-13的浓度.( F 采用流式细胞术检测肺组织IL-13的几何均值。图中的数据来自两个独立实验，每组四到六只老鼠。结果为均值±扫描电镜。* P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 using Mann-Whitney statistical test.
在此之前，我们发现暴露于hdm的嗜中性粒细胞耗损小鼠的T细胞显著增加。 H 2细胞因子水平在HDM暴露1周时，可归因于白细胞介素2(ILC2s)在每细胞基础上增加产量。经抗G-CSF治疗1周后，小鼠白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-13水平明显降低(P<0.05)。 图5e )。同样，T的数量 H 白细胞介素2(ILC2s)产生的2种细胞因子，以白细胞介素13为例，经流式细胞术检测，经抗粒细胞集落刺激因子(抗G-CSF)处理后，细胞因子水平明显降低(P<0.01)。 图5f )-一种经抗IL-17治疗后再次保守的表型(图1)。(S16E)。
重组G-CSF能增强ILC2T H 2细胞因子产生 接下来，我们质疑G-CSF是否具有调节ILC2T的能力。 H 2 HDM暴露动物细胞因子的产生和骨髓祖细胞的扩增对缺乏中性粒细胞的小鼠是独特的，在免疫功能完全正常的动物中是否也能发挥同样的作用。因此，HDM暴露小鼠被注射重组G-CSF 1周( 图6a )。给HDM暴露小鼠注射重组G-CSF不仅能增加组织中的中性粒细胞( 图6B 同时也增加了组织单核细胞( 图6c )和骨髓祖细胞( 图6d )，如中性粒细胞耗竭后所见。此外，hdm驱动的BALF IL-4、IL-5和IL-13增加( 图6e )和ILC2 T H 2细胞因子产生( 图6f )经重组G-CSF处理后，进一步增强。因此，G-CSF是白细胞介素2功能和单核细胞数量的生理调节因子。
图6 联合应用重组G-CSF可增加HDM诱导的中性粒细胞、单核细胞、骨髓祖细胞的数量和IL 2的细胞因子反应。 (A BALB/c小鼠经鼻给予PBS或HDM，每周3次，连续1周。在整个研究过程中，小鼠还每日分别腹腔注射10 0ng重组G-CSF(50μ1)和2μg重组G-CSF(2 0 0μ1)或相应的PBS对照组。在最后一次给药后24小时，收集支气管肺泡灌洗液、肺组织和骨髓(Ŧ)。肺及气道中性粒细胞数目( B )和肺Ly6C 低层 和Ly6C 高 单核细胞( C )流式细胞仪检测。( D 流式细胞术检测骨髓中MDPs和CDPs的含量。( E 用ELISA法测定BALF、IL-4、IL-5、IL-13的浓度.( F 用流式细胞仪检测BAL、ILC2s对IL-13的几何均值。图中显示的数据来自一个实验，每组4到6只老鼠。结果为均值±扫描电镜。* P < 0.05 and **P < 0.01 using Mann-Whitney statistical test.
接下来，我们质疑G-CSF能否直接作用于ILC2s，促进细胞因子的产生。以往RNA测序数据挖掘表明，ILC2s表达G-CSF受体CSF3R( 40 41 )，并通过流式细胞术(FACS)从气道分离ILC2s，证实了这一点。 CSF3R (图7a ). CSF3R 从气道分离的T细胞中完全不表达( 图7a )，将早期观察到的白细胞介素-5和白细胞介素-13的主要来源是白细胞介素2而不是CD4的观点合理化。 + T细胞IL-33是ILC2s的一种强有力的调节因子，是一种为期一周的鼻内重组IL-33给药模型( 图7b )在没有抗原特异性T的情况下诱导大量的ILC 2数目。 H 2细胞反应。从重组IL-33处理小鼠气道中分离到的ILC2s再次表达。 CSF3R 在这些动物的T细胞中再次缺失( 图7c )。重组G-CSF与重组IL-33联合应用于小鼠气道( 图7b )，它扩大了 IL5 和 IL 13 用定量聚合酶链式反应(QPCR)判断气道内白细胞介素2(ILC2s)的表达，而T细胞不表达。 图7D )。此外，将重组G-CSF与IL-33联合应用可提高BALF中IL-5和IL-13的浓度( 图7e ).
图7 G-CSF增强T H 2 IL-33-扩张气道CSF3R-表达ILC2s产生细胞因子。 BALB/c小鼠皮下注射HDM，每周3次，连续1周。在最后一次给药后24小时，收集BAL。( A )mRNA的相对表达 CSF3R 用流式细胞仪(FACS)从HDM暴露小鼠BAL中分离T细胞和ILC2s。( B BALB/c小鼠每周3次，每次1μg重组IL-33，共1周。末次给药后24小时收集BAL。( C )mRNA的相对表达 CSF3R 用流式细胞仪(FACS)从白细胞介素33(IL-33)染毒小鼠BAL中分离T细胞和ILC2s。在一些实验中，将100 ng重组G-CSF与IL-33(B)和CD4联合使用。 + 于末次给药后24h，用流式细胞术(FACS)从气道中分离T细胞和ILC2s，进行基因表达分析。( D 用qPCR方法检测T细胞和BAL来源的ILC2s中IL-4和IL-13的相对表达。( E 用ELISA法测定BALF中IL-5和IL-13的浓度.图中显示的数据来自一个实验，每组4到6只老鼠。结果为均值±扫描电镜。* P < 0.05 and **P < 0.01 using Mann-Whitney statistical test.
以验证G-CSF能够直接增加T H 2从重组IL-33小鼠气道中分离到ILC2s、ILC2s产生的细胞因子(图二)。S17A)或来自健康献血者的外周血( 图8a )，然后用或不加G-CSF刺激。用小鼠白细胞介素2(ILC2s)观察，人白细胞介素2(ILC2s)表现出G-CSF受体的稳健表达， CSF3R (图8B )。G-CSF刺激小鼠和人ILC2s释放的IL-5和IL-13明显高于培养基处理的对照组(图5)。S17B和 图8c IL-4、IL-17、干扰素-γ(IFN-γ)和IL-12的水平不高，IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平极低，且具有可比性.因此， IL5 和 IL 13 G-CSF刺激的人白细胞介素2s及T水平均显著升高。 H 2主转录调节剂 GATA 3 (图8d )。表达 IL4 和 IL 17 信息是无法察觉的。同样， IL4 , IL5 ，和 GATA 3 G-CSF刺激的小鼠ILC2s转录本呈剂量依赖性增强(图二)。(S17C)。因此，G-CSF是一种以前未被识别的T型增强剂。 H 2白细胞介素2(ILC2s)产生的细胞因子，再加上增强的G-CSF驱动的moDC抗原提呈，促进了HDM暴露后3周中性粒细胞耗竭小鼠的2型炎症反应。
图8 G-CSF直接增强T H 2人白细胞介素2(ILC2s)产生细胞因子。 (A 从外周血中分离人白细胞介素2(IL-7，5 ng/ml)和IL-33(15 ng/ml)，加入含重组G-CSF(100 ng/ml)的培养基或培养基中培养72h。( B )相对表达 CSF3R 72小时后用qPCR进行检测。( C 用多重细胞因子法检测IL-5和IL-13在培养上清中的水平，并以供体特异性折叠变化的形式表达。( D )表达 IL5 , IL 13 ，和 GATA 3 72小时后用qPCR进行评估，G-CSF治疗后出现供体特异性皱襞改变。结果为均值±扫描电镜。* P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 using a paired t 测试一下。
讨论 过度兴奋或持续的中性粒细胞反应与一系列炎症性疾病的病理有关，因此中性粒细胞是一个很有吸引力的治疗靶点。然而，寻求改善中性粒细胞炎症的治疗策略并没有充分考虑到这些细胞可能发挥的调节作用。在本研究中，我们证明在过敏性气道疾病的HDM模型中中性粒细胞的减少会引起IL-23-IL-17-G-CSF调节反馈通路的紊乱。累积的G-CSF随后促进变应原致敏，加重2型炎症、上皮重塑和肺功能.这是由G-CSF促进T的能力介导的。 H 2气道ILC2s产生细胞因子，并驱动单核细胞增多和随后的moDC介导的抗原提呈(图)。(第18段)。
我们证明了G-CSF在CSF3R上起作用。 + ILC2s促进细胞内IL-5和IL-13的产生.IL-4水平在体内也以G-CSF依赖的方式升高，但来源于csf3r。 − CD4 + T细胞可能可归因于报道的ILC2s促进CD4产生IL-4的能力。 + T细胞( 42 44 )。白细胞介素2(ILC2s)是2型炎症的早期效应者，可感知细胞因子和组织内稳态破坏时从近端环境诱发的应激信号，并对其作出反应。 45 )。因此，这是合理的，一个先天的介质，如G-CSF可以发挥作用，以增强ILC 2的功能。我们还揭示了G-CSF促进骨髓MDPs和CDPs扩增的能力，以及随后的单核细胞增多症。为了理顺这一效应，G-CSF曾被证明能推动骨髓中粒细胞巨噬细胞祖细胞区(GMPs)的扩张。 46 )。GMPs位于MDPs和CDPs的上游发育阶段，因此可能是后者在中性粒细胞缺乏的动物中积累的原因。历史rna-seq数据集的数据挖掘( 47 )提示GMPS、MDPs和CDPs均表达CSF3R，支持G-CSF能够促进这些祖细胞增殖的观点。虽然G-CSF被经典地认为是一种强有力的造粒调节因子，但据报道G-CSF能刺激中性粒细胞患者单核细胞的产生和释放( 48 50 )。在我们的过敏原致敏小鼠中，这些扩大的单核细胞群增加了modc的数量，这与以前的文献一致。 28 30 )，将抗原运送至引流MLN和活化T细胞-这可能是ILC 2衍生的IL-13升高的进一步许可。 42 )。因此，在白细胞介素2来源的2型细胞因子升高的背景下，增强的抗原提呈促进了CD4的增加。 + TH 2细胞在过敏原暴露后3周。同样，升高的IL-4水平将促进B细胞反应和类切换，这是HDM特异性IgE和IgG 1水平增加的基础。
鉴于在本研究中G-CSF的作用尚未确定，因此有必要重新评估G-CSF在哮喘背景下的更广泛的意义。据报道，哮喘患者BALF中G-CSF水平高于健康对照组( 51 )和不稳定哮喘患者的血清( 52 )。与我们目前的发现相关，G-CSF在不稳定的哮喘中与IL-5同时增加( 52 )，而G-CSF治疗增加了循环DC的数量，这些DC具有产生T细胞的最佳T细胞能力。 H 2种细胞因子( 53 )。因此，这也是适当的背景，我们的发现，在感觉到的作用中性粒细胞在哮喘。普遍的共识是，主要根据间接的临床数据，中性粒细胞在哮喘的情况下是有害的，预示着更坏的预后( 8 10 14 )。根据我们目前的发现，中性粒细胞也是间接抑制T的一种补偿机制。 H 2通过负性调节G-CSF的生物利用度，在变态反应性疾病中发生炎症反应.根据这一假设，中性粒细胞的过继转移最近被证明可以减弱T。 H 2小鼠过敏性气道疾病模型的反应( 54 )。我们在小鼠中发现中性粒细胞负调节2型炎症的数据得到了以前报道的一例周期性急性哮喘患者的支持，在这种情况下，中性粒细胞的周期性贬值与嗜酸性粒细胞大量增加、血清IgE水平和哮喘恶化有关( 55 )。此外，嗜酸性粒细胞增多是许多与中性粒细胞减少有关的原发性免疫缺陷性疾病的公认特征。 56
我们的研究证明了复杂的调节反馈途径，定义了中性粒细胞的周转，以及将中性粒细胞作为哮喘治疗方式的内在挑战。任何影响中性粒细胞在稳定状态下迁移到组织中的能力的干预都有可能改变G-CSF的水平。因此，缺乏CXCR 2的小鼠( 39 )或特定的粘附分子( 38 )显示G-CSF基线水平升高。因此，用于改善哮喘中性粒细胞炎症的治疗策略可能无意中增加G-CSF水平并增强T。 H 2炎症。因此，值得注意的是，CXCR 2拮抗剂AZD 5069不仅降低了健康志愿者的外周血中性粒细胞，而且导致血清G-CSF浓度显著升高( 57 )。同样，AZD 5069减少了持续性哮喘患者的肺、痰和血中性粒细胞数量，但再次显著增加了G-CSF的表达( 57 58 )。此外，CXCR 2拮抗剂SCH526123减少了重症哮喘患者的痰中性粒细胞，但同时增加了痰嗜酸性粒细胞的百分比( 15 )。因此，增加G-CSF水平导致T增加是可行的。 H 2炎症可能是CXCR 2拮抗剂临床试验结果令人失望的原因之一。针对中性粒细胞炎症的替代方法与减少G-CSF代偿性增加相结合，可能在临床上更有益处。或者，我们是否会有更好的策略来促进组织中中性粒细胞的凋亡( 59 61
总之，我们证明在过敏性气道疾病小鼠模型中中性粒细胞的减少会导致IL-23-IL-17-G-CSF反馈回路失调。随后积累的G-CSF通过直接增强ILC2T来增强过敏原的敏化作用。 H 2细胞因子的产生和作用于骨髓祖细胞，驱动单核细胞增生症，进而导致moDC抗原表达增强。这些研究具有基本的生物学意义，因为它们显示了G-CSF以前未被认识到的作用和翻译意义，因为它们突出了中性粒细胞间接抑制过敏性气道炎症的能力，有可能使以前中性粒细胞靶向治疗策略的失败合理化。
材料和方法 学习设计 这项研究的主要目的是确定中性粒细胞在控制过敏性气道疾病炎症和病理中的重要性。在所有实验中，使用适当的对照组，并将小鼠安置在相同的环境条件下，并与年龄相匹配。成年雌性小鼠随机分为不同实验组。作者对细胞计数和组织学分析视而不见。每组小鼠的数量是根据模型系统之前的大量经验通过功率计算确定的，并在各自的图图中定义。每个实验的独立复制数是在各自的图图中定义的。没有样本或动物被排除在数据分析之外。
用人分离的白细胞介素2(ILC2s)测定G-CSF对白细胞介素2(ILC 2)功能的直接影响。采集了3名男性和2名女性献血者的血液。献血者的数量是根据以往的血液来源的ILC 2培养方法的经验来确定的。作者对上清液细胞因子分析和mRNA表达分析视而不见。所有研究伦理和病人同意均已到位，并在“人ILC 2培养”一节中作了进一步详细说明。
实验动物 8到12周龄的雌性Balb/c小鼠是从Envigo购买的(英国亨廷顿)。所有小鼠随机分为实验组。IL 13-EGFP小鼠由A.N.McKenzie(剑桥医学研究委员会分子生物学实验室)提供，随后在家中繁殖( 29 )。小鼠被保存在特定的无病原体条件下，并提供蒸压食物、水和被褥.所有老鼠实验都是根据“伦敦帝国学院实验动物使用指南”中的建议进行的，并附有“动物研究：活体实验报告”指南。根据1986年“动物(科学程序)法”，所有的动物程序和照料都严格符合英国内政部的指导方针，并得到英国内政部的批准。
过敏性气道疾病小鼠模型 BALB/c小鼠经鼻3次，每周3次，每周3次，皮下注射25μg HDM提取物[DerP 1(10.17μg/L)，每个内毒素含量9个单位；格里尔实验室]。对照组在相同时间点经鼻给予50μ1无菌PBS。所有小鼠于最后剂量HDM或PBS 24小时后处死。
重组IL-33与G-CSF的应用 小鼠经鼻给药1μg重组IL-33蛋白(热费舍尔科学)，每周3次，每次50μ1次。在一些实验中，小鼠每天在50μl的PBS(或PBS车辆控制)中同时给予100 ng重组G-CSF(美国新泽西州PeproTech)。必要时，将IL-33与G-CSF混合应用于小鼠治疗.收获在最后剂量IL-33后24小时进行。
在其他实验中，小鼠经鼻给药1周(详见上文)，每天用2.5μg重组G-CSF腹腔注射2 0 0μ1(或PBS载体对照)，10 0ng G-CSF经鼻注入5 0μ1的PBS(或PBS载体对照)。在最后剂量G-CSF/HDM后24小时进行收获。
体内中性粒细胞耗竭 为减少中性粒细胞，BALB/c小鼠腹腔注射100μg抗Ly6G(克隆1A8，BioXcell)于200μl。对照组小鼠在2 0 0μ1中接受100μg的同型控制抗体(克隆2A3，BioXcell)。在过敏性气道疾病模型中，小鼠在每次HDM或PBS治疗前24小时分别注射相应的抗体。
体内G-CSF中和 通过腹腔注射100μg抗小鼠G-CSF抗体(R&D系统)，实现G-CSF的中和.分别腹腔注射100μg同型控制抗体(克隆2A3，R&D系统)。在适当的情况下，分别与中性粒细胞耗竭小鼠的抗Ly6G抗体(克隆1A8，BioXcell)或对照小鼠的同型对照抗体(克隆2A3，BioXcell)混合。在每次HDM或PBS鼻内暴露前24小时注射抗体。
体内IL-17中和 通过腹腔注射20μg抗小鼠IL-17A抗体(R&D系统)，达到对IL-17的中和作用。分别腹腔注射20μg的异种控制抗体(克隆2A3，R&D系统)。在适当的情况下，分别与中性粒细胞耗竭小鼠的抗Ly6G抗体(克隆1A8，BioXcell)或对照小鼠的同型对照抗体(克隆2A3，BioXcell)混合。在每次HDM或PBS鼻内暴露前24小时注射抗体。
荧光标记OVA的应用 OVA(Invivgen)是使用Alexa Fluor 488荧光载体标记的，按照制造商的指南使用Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒(Thermo Fisher Science)。小鼠经鼻给药1周，在最后一次给药后，用10 0μg的阿列克索氟-488标记的去甲肾上腺素(OVA)灌胃给小鼠。
肺功能测量 在小鼠服用hdm 3周的研究中，使用Flexi通风口系统(SCIREQ)测量麻醉小鼠和气管切开小鼠的动态阻力、弹性和顺应性，以响应增加浓度(0、3、10、30和100 mg/ml)的甲胆碱(Sigma-Aldrich)，如前所述( 62
细胞回收与分离 小鼠经心脏穿刺取血，2 0 0μ1血立即溶于ACK缓冲液[0.15 M氯化铵，1 M碳酸氢钾，0.0 1mmEDTA(pH 7.2)]中5 min，然后在80 0℃离心。 g 细胞在0.5ml完全培养液(R10F；RPMI+10%热灭活胎牛血清)中再悬浮5 min。用离心法从多馀凝血中分离血清(5000 min，8 min)。 g )。支气管肺泡灌洗(BAL)，三次充气，每次用0.4ml的PBS经气管插管。然后将BALF收集起来，并在800时离心。 g 取BAL上清液5 min，在−80°C冷冻。剩余的细胞颗粒再悬浮在0.5ml的R10F中。
右肺的副叶、中叶和上叶在液氮中快速冷冻，然后保存在−80°C，直到需要。将左叶切成细片，在37°C下孵育30 min，培养液中加入解放酶(0.15 mg/ml；Sigma-Aldrich)和脱氧核糖核酸酶(DNase)(25μg/ml；1型，Sigma-Aldrich)。细胞经70-μm筛破裂后在800℃离心后恢复正常。 g 持续5分钟。在室温下对ACK缓冲液中的红细胞进行3 min的溶解，然后在800℃进行最后一次离心。 g 在2ml的R10F中再悬浮5 min。
每只小鼠的股骨均被摘除，并从软组织附着物中分离出来，每个股骨的远端末端被切断。用含0.1%(w/v)叠氮钠和1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS 1ml冲洗股骨两端。经70-μm筛过滤后，细胞被仔细分散，然后在800℃离心。 g 持续5分钟。在室温下对ACK缓冲液中的红细胞进行3 min的溶解，然后在800℃进行最后一次离心。 g 在2ml的R10F中再悬浮5 min。
小鼠的脾脏通过70-μm筛破裂，悬浮液在800℃离心。 g 持续5分钟。用ACK缓冲液进行红细胞溶解3 min，800℃离心。 g 在细胞颗粒再悬浮于2ml R10F前5 min。
MLN在解放酶(0.15 mg/ml；Sigma-Aldrich)中消化30 min。细胞经70-μm筛破裂后在800℃离心后恢复正常。 g 持续5分钟。细胞颗粒随后再悬浮在2ml的R10F中。
白细胞和基质细胞的FACS 用1.5ml的消散酶II(5mg/ml；Sigma-Aldrich)充气小鼠的肺，然后使其自然塌陷。低熔点琼脂糖[0.5毫升的1%(w/v)]然后缓慢地注入肺部，并立即通过将肺部装在冰中固化。然后取肺，在消散酶液中孵育40 min。肺组织转移到Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(25 mm；热费舍尔科学)和DNase I(50μ/ml；Sigma-Aldrich)中，消化后的组织被从上气道“戏弄”，并在温和搅拌下孵育10分钟。消化后的肺组织通过70μm筛(Bd Labware)被打成单细胞悬液，然后在800℃离心。 g 持续5分钟。对ACK缓冲液中的红细胞进行3 min的溶解，然后在800℃下进行最后一次离心。 g 在2ml的R10F中再悬浮5 min。细胞悬液用抗小鼠CD 45-perCP(过氧化物酶叶绿素蛋白)、抗小鼠EpCAM-PE(藻红蛋白)和抗小鼠CD 31-apc(异生藻蓝蛋白)染色如下所示，以及群体(内皮细胞：CD 45)。 − CD 31 + 埃帕姆 − 上皮细胞：CD 45 − CD 31 − 埃帕姆 + ；造血细胞CD 45 + CD 31 − 埃帕姆 − )在BD FACS LSR Aria III型分选机上进行FACS分离。分离的细胞被离心800 g 在RLT缓冲液(Chiagen)的350μl中再悬浮5 min，在−80°C中进行实时聚合酶链反应(见下文)。
T细胞和ILC2s的流式细胞术 单细胞悬液来源于肺组织和BAL，如上述“细胞恢复和分离”部分所述。对气道T细胞和白细胞介素2(ILC2s)的检测，每个数据点需汇集3只小鼠的BAL。细胞悬液用抗小鼠CD4-fITC(异硫氰酸荧光素)、抗小鼠CD 45-percp、抗小鼠icos-pe-cy7以及表s2中详细列出的T细胞受体β(tcrβ)-apc、cd5-apc、CD 19-apc、tcrγδ-apc、CD11b-apc、CD11c-apc、NKp 46-apc、fcεrr-apc、gr-1-apc、f4/80-apc、ter-119-apc)和群体(T细胞：linl)染色。 + CD 45 + CD4 + ；ILC2s：LIN − CD 45 + CD4 − ICOS + KLRG 1 + )在BD FACS LSR Aria III型分选机上进行FACS分离。分离的细胞被离心800 g 在RLT缓冲液(Chiagen)的350μl中再悬浮5 min，在−80°C中进行实时聚合酶链反应(见下文)。
人ILC 2培养 健康非过敏男性血液( n =3)和女性( n =2)年龄在24至40岁之间的志愿者，经Brompton、Harefield和国家心肺研究所伦理委员会批准，经书面知情同意收集。所有实验均按照批准的准则进行。每名供者经静脉穿刺取血(50 Ml)，置入1 ml EDTA(0.5M；Thermo Fisher Science)。全血ILC 2按照制造商的指示使用RosetteSep人ILC 2富集试剂盒(干细胞技术，英国)进行浓缩。然后用抗人谱系鸡尾酒FITC(Thermo Fisher Science)、抗人CD 45-PerCP(Thermo Fisher Science)和抗人CRTH 2-BV 421(BioLegend)抗体染色30 min，再用BD LSR Aria III细胞分类器(BD生物系统)进行分类。ILC2s被确认为林。 − CD 45 + CRTH 2 + ...分离的ILC2s在含DMEM和10%胎牛血清(FCS)、IL-7(5ng/ml；PeproTech)和IL-33(10 ng/ml；PeproTech)的培养基中培养2周。细胞分裂后，在对照组或加G-CSF(100 ng/ml；PeproTech)的培养基中培养72h。刺激后取细胞上清液进行蛋白质分析，用3 5 0μ1的RLT缓冲液对细胞进行裂解。
小鼠ILC 2培养 按“重组IL-33和G-CSF”部分的详细内容，给小鼠注射1μg重组IL-33(热费舍尔科学)1周。在最后的IL-33剂量后24小时，提取肺组织，获得“细胞恢复和分离”部分所述的单细胞悬液。ILC2s按“T细胞和ILC2s的FACS”一节所述进行分类。分选后，将分离的ILC2s立即镀入含DMEM+10%FCS和IL-7(5ng/ml；PeproTech)的含IL-33(10 ng/ml；PeproTech)或缺乏IL-33的培养基中。分别补充G-CSF(10 ng/ml)或G-CSF(100 ng/ml)72小时。72h后收集上清液，用ELISA法测定IL-5和IL-13，并将细胞溶于RLT缓冲液的3 5 0μ1中进行RNA分析。裂解细胞进行mRNA表达检测。 IL5 , IL 13 ，和 GATA 3 .
流式细胞术 用PBS活/死近红外-死区细胞染色试剂盒(分子探针，Invitrogen)染色10 min，用抗CD 16/CD 32 FC受体阻滞20 min。在含0.1%(w/v)叠氮钠和1%(w/v)BSA的PBS中，用2%(v/v)多聚甲醛固定。所有样本立即在BD LSRFortessa细胞分析仪(BD生物系统)上采集，并使用BD FACSDiva(BD生物系统)进行分析。如表S2所述，单元格由标记定义。
细胞内细胞因子染色用佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(pma；40 ng/ml；Sigma-Aldrich)和离体霉素(3μg/ml；默克·米利孔)在37°C和0.5%CO的完整培养基中刺激肺组织和BAL的单细胞悬液(10μg/ml；Sigma-Aldrich)。 2 三个小时。然后进行细胞外标记染色，并按上述规定固定。细胞经含0.05%(w/v)叠氮钠、1%(w/v)BSA和1%(w/v)皂甙(Sigma-Aldrich)的皂甙缓冲液[PBS]渗透，其中含有抗小鼠IL-13-PE、抗小鼠IL-5-BV421、抗小鼠IL-4-FITC、抗小鼠IL-17A-Alexa Fluor 700和/或抗小鼠IL-23-PE-Cy7。Ki-67染色用抗小鼠Ki-67-Alexa Fluor 488抗体孵育.30 min后，用皂素缓冲液冲洗一次，在含0.1%(w/v)叠氮钠和1%(w/v)BSA的PBS中冲洗一次，并立即在BD LSRFortessa细胞分析仪上获得数据。
细胞因子分析 PBS浓度为50 mg/ml时，小鼠肺上、中叶均质。肺匀浆离心10 min(800 Min)。 g )，取上清液进行细胞因子分析。测定肺匀浆、BALF、血清和小鼠ILC 2上清液中MMP-9、MPO、CCL 2、Cx的浓度。 3 CL1，G-CSF(DuoSet，R&D系统)，IL-13(Thermo Fisher Science)，IL-4和IL-5(BD制药公司)，在相关情况下，采用ELISA法.
用LEGENDPlex人T对人ILC 2细胞上清液进行细胞因子检测。 H 细胞因子试剂盒。样品的制备按照制造商的指示进行，并记录在BD LSRFortessa流式细胞仪(BD生物系统)上。
免疫球蛋白浓度测定 用标准化夹心ELISA法测定稀释血清中的总IgG 1和IgE(BD生物科学，UK)。在稀释血清中测定过敏原特异性IgE和IgG 1，如上文所述( 63
气道粘蛋白浓度的测定 Balf MUC5AC蛋白是使用先前描述的协议( 64 )。简单地说，BALF被放置在96井板上(英国康宁)，并允许在37°C下蒸发一夜。然后用2%的BSA清洗并阻塞2小时。用生物素化的抗Muc5ac抗体(400 ng/ml；热Fisher科学)测定Muc5ac蛋白。
定量逆转录PCR 全肺用RLT缓冲液(前胶原)匀浆，用RNeasePlus微型试剂盒提取总RNA。反转录(RT)随后进行了大容量cDNA反转录试剂盒(Thermo Fisher Science)。[在RLT缓冲液(Chiagen)中]，用RNeasePlus微量试剂盒(Chiagen)提取总RNA，用GoScript反转录酶试剂盒(Promega)进行RT。采用Taqman基因表达测定法(Thermo Fisher Science)检测小鼠的相对表达量。 参3 , CSF3R , CXCL 1 , IL4 , IL5 , IL 13 , IL 17 , IL 23 , GATA 3 ，和 MUC5AC mRNA表达及归一化为 GAPDH ...同样，人类的相对表达 IL5 , IL 13 ，和 GATA 3 表达式被规范化为 GAPDH ...在VIIa 7实时PCR系统(Thermo Fisher Science)上进行定量RT-PCR.数据从两个技术复制中获得，并以ΔΔ中的折叠变化表示。 C T 或基因的相对表达量(计算为1000×Δ) C T 2 ).
精确切割肺切片 对照组和中性粒细胞耗竭小鼠经鼻给予HDM治疗1周.最后给药24小时后，将抗小鼠CD 31-Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Science)、抗小鼠CD 115-PE(BioLegend)和抗小鼠Ly6G-Alexa Fluor 488(浓度为50μg/ml)静脉注射于采收前约5 min。抗小鼠CD 115-PE(BioLegend)、抗小鼠Ly6G-Alexa Fluor 488(BioLegend)和抗小鼠CD11c-BV421(50μg/ml)抗体也在气道内进行染色。取小鼠，暴露气管，用1毫升2%低熔点琼脂糖(ThermoFisher Science)充气肺。当琼脂糖凝固后，用Bio-Rad-H1200Viatome(法国Bio-Rad)分离右肺叶并切割至300μl厚。肺片立即在R10F中冲洗两次。为确保组织驻留细胞染色，在室温下用抗小鼠CD 115-PE(BioLegend)、抗小鼠Ly6G-Alexa Fluor 488(BioLegend)、抗小鼠Ly6G-Alexa Fluor 488(BioLegend)和抗小鼠CD11c-BV 421(50μg/ml)抗体孵育30 min。全染色肺片用R10F冲洗三次，然后装在成像μ板上。在倒置SP5共焦显微镜下，用20×物镜获得图像(英国莱卡)。这些图像随后使用Imaris软件8.1进行了分析和准备(Bit平面，牛津仪器，英国)。
肺切片H&E染色 HDM/PBS暴露3周后，进行组织学评估( 62 )。右肺下叶用10%中性福尔马林固定24h。取肺石蜡包埋，切至4μm厚。切片后用H&E染色，以评估全身炎症和气道形态。
统计分析 用非参数Mann-Whitney检验(双面)和棱镜软件(GraphPad Software Inc.)计算统计显着性。人ILC 2实验的统计学意义 t 测试一下。用方差分析(ANOVA)和Bonferroni校正法计算小鼠ILC 2实验的统计学意义。除另有说明外，结果被描述为手段±SEM。用Spearman秩检验计算相关性的统计显着性 P 价值观和 r 在各自的图表上注明的值。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 were considered significant and are referred to as such in the text.
