阿尔茨海默氏病（AD）和新皮质路易体病（LBD）是最常见的神经退行性痴呆，尚无有效的治疗方法。阐明致病机理和确定新的治疗靶点至关重要。狐猴酪氨酸激酶2（LMTK2）参与几种生理和病理细胞过程。因此，在死后脑组织上使用发色和荧光LMTK2免疫组织化学技术在AD和新皮质LBD样品中进行了神经病理学表征，并将它们与年龄匹配的对照（CNT）进行了比较。LMTK2免疫阳性仅限于神经细胞质。与CNT和新皮层LBD相比，包括tau阳性缠结神经元的神经元在每个皮层的AD中均显示出发色和免疫荧光标记减少。进行数字图像分析以测量各组的平均免疫阳性。在测量每个单个神经元的灰度等级LMTK2信号强度之后，为每个组计算平均灰度值。CNT与AD的平均灰度值与新皮质LBD与AD的平均灰度值之间存在显着差异。新皮层LBD的适度降低表明共存AD病理的影响。我们提供了减少AD中神经元LMTK2免疫标记的神经病理学证据，对发病机理有影响。新皮层LBD的适度降低表明共存AD病理的影响。我们提供了减少AD中神经元LMTK2免疫标记的神经病理学证据，对发病机理有影响。新皮层LBD的适度降低表明共存AD病理的影响。我们提供了减少AD中神经元LMTK2免疫标记的神经病理学证据，对发病机理有影响。

痴呆症正在我们衰老的社会中挑战健康问题。阿尔茨海默氏病（AD）和新皮质路易体病（LBD）是痴呆症的最常见原因，占病例的75％至80％1。为了开发更有效的疾病修饰治疗，分子，生化和遗传改变（“组学”）应当被更好的探索2，3，4。AD的神经病理学特征是细胞外β淀粉样斑块和细胞内聚集性神经原纤维缠结（NFT）的沉积5。尽管新皮层LBD是一种α-突触核蛋白病，其特征是α-突触核蛋白形成路易小体和路易神经突的病理性聚集和细胞内沉积，但也经常观察到共存的AD型NFT病理。NFT的主要成分是磷酸化微管相关蛋白tau。头参与的生理细胞功能无数诸如微管的稳定化，轴突运输，突触传递或解折叠蛋白应答的活化6，7，8，9。在病理情况下，高磷酸化的tau 10通过隔离正常的头和其他微管相关的蛋白质，导致微管拆卸11易自聚集和有毒。NFT负担与存活的神经元数量成反比，表明神经原纤维病变在变性变化和凋亡细胞丢失中具有关键作用12。尽管tau过度磷酸化在发病机理中起着至关重要的作用，导致许多激酶的病理活性的主动事件仍有待阐明。细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）和糖原合酶激酶3β（GSK3β）是两种主要的tau激酶。此外，CDK5可以间接抑制GSK3β的活性，但直到Manser 等人才知道该现象的确切机制。。确定了狐猴酪氨酸激酶2（LMTK2）作为上述两个tau激酶13之间的信号传导途径的缺失环节。LMTK2是膜锚定蛋白激酶家族14的成员。它具有重要的相互作用伙伴，例如CDK5 / p35复合物，蛋白磷酸酶1的催化亚基（PP1C），囊性纤维化跨膜电导调节剂（CFTR）和肌球蛋白VI。由于存在较大的LMTK2相互作用基因组，因此该蛋白与几种重要的生理功能和疾病（表1）有关，包括AD 15也就不足为奇了。 。但是，尚无人类神经病理学研究。为了填补这一空白，在这项研究中，对人AD和新皮层LBD脑样本进行了LMTK2的显色和荧光免疫组织化学（IHC）表征。应用数字图像分析来测量实验组的平均免疫标记。

所有程序均在伦敦金斯学院精神病学和神经科学研究所的伦敦MRC神经退行性疾病脑库机构伦理委员会（18 / WA / 0206）的伦理学批准下进行，并且获得了痴呆症研究脑（BDR）项目的批准。 （08 / H0704 / 128 + 5）。从所有受试者中获得了尸检，神经病理学评估和研究参与的知情同意，并对数据进行了匿名化。根据标准标准进行了组织学和免疫组织化学研究以及神经退行性疾病的神经病理学评估的禁区服用。

建立了三个实验组。观察到的大脑区域是中额回（Brodmann区域9）。在疾病组中，我们选择了6–6例AD和新皮质LBD伴有严重的神经退行性改变（分别为Braak VI期和弥散性新皮质）。在这些情况下，痴呆症可以在一生中诊断出来并通过神经病理学证实，而对照组（CNT）组中有6个年龄相匹配的患者样本（死于非神经系统原因），而神经退行性病变没有明显改变。实验组中有11名女性和7名男性相似分布。所有患者均超过60岁，AD的平均验尸延迟为38（±11.8 SEM）小时，CNT的平均验尸延迟为47.1（±8.6 SEM）小时，新皮层的LBD病例为43.3（±7.8 SEM）小时（补充表   S1）。

显色免疫组织化学（CHR-IHC）

常规对7μm厚的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片进行脱蜡处理，以降低酒精浓度（2×5分钟二甲苯，5分钟无水酒精，5分钟96％（v / v）酒精，5分钟） 80％（v / v）酒精，5分钟70％（v / v）酒精）在含有3％（v / v）H 2 O 2的甲醇中阻止内源性过氧化物酶活性，并在微波炉中（5分钟，800瓦，2×5）在三（羟甲基）氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TRIS-EDTA； 10 mM TRIS碱，1 mM EDTA，pH = 9.0）抗原提取缓冲液中进行热处理。最低250瓦）。用含有10％（v / v）正常山羊血清（Agilent / Dako）的20 mMol TRIS缓冲盐水（Sigma-Aldrich，TRIS Buffer Saline 20×溶液，20 mMol Tris，pH = 7.4）封闭非特异性抗体结合位点。 。将切片与LMTK2一抗（KPI-2，克隆H-9，SantaCruz Biotechnology）在4°C孵育过夜。在第二天，将样品与山羊抗小鼠生物素化的二抗（Agilent / Dako）在室温下孵育一个小时。免疫组织化学检测使用VECTASTAIN®Elite®ABC HRP试剂盒（Vector实验室）进行–根据制造商的规程准备和使用。施加发色底物3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）试剂（Sigma-Aldrich 10 mg片剂）4分钟，然后用哈里斯苏木精进行核染色（30秒）。将切片在酒精浓度增加的情况下脱水（5分钟：70％（v / v）酒精； 5分钟：80％（v / v）酒精； 5分钟：96％（v / v）酒精； 5分钟无水酒精； 5分钟（二甲苯）5分钟，然后使用ClearVue™Coverslipper（Thermo Fisher Scientific）进行安装和盖玻片。一抗和二抗在20 mMol TRIS缓冲盐水中的稀释度分别为1:50和1：200。某些步骤（抗原回收，一抗和二抗，ABC试剂盒）是20 mMol TRIS缓冲盐水。为了质量控制，还制备了不使用一抗的IHC“阴性”玻片。

免疫荧光免疫组化（IF-IHC）

几个步骤与上述详细的CHR-IHC方案重叠（脱蜡，抗原修复，一抗），而IF-IHC反应则不需要其他步骤（内源性过氧化物酶封闭，生物素化的二抗，色原底物）。工作溶液是磷酸盐缓冲盐水（Biocare Medical，PBS Plus 10x溶液，pH = 7.3）。将切片与荧光染料偶联的二抗（山羊抗小鼠IgG H＆L-594，Abcam）一起在室温下孵育一个小时。在工作溶液中，二抗稀释度为1：200。使用Vector®TrueVIEW™自发荧光猝灭试剂盒（Vector实验室）去除非特异性自发荧光。盖玻片和核染色是使用带有DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole;

CHR-IHC评估

使用Virtual Slide Microscope VS120（奥林巴斯公司）以相同的照明强度，曝光时间和相机设置扫描幻灯片。神经病理学家（TH）评估了LMTK2的细胞特异性，亚细胞定位以及与疾病特异性病理变化（β-淀粉样斑块和NFTs）的关系。

IF-IHC的数字分析

使用配备20x / 0.5 420350–9900 EC Plan-Neofluar物镜，Coolcube 1 m S / N：003274的Axio Imager Z2显微镜进行免疫荧光显微镜检查。60N-C 1″ 1,0×。426114相机和适当的滤镜组（Carl Zeiss AG）。对于数字分析，我们使用了Isis荧光成像平台（MetaSystems Hard＆Software GmbH）。在中等放大倍率（20倍）下以相同的照明强度，曝光时间和相机设置随机拍摄5张照片/案例。用ImageJ软件进行数据处理。一堆中打开了图像（90张），以确保对每个图像使用相同的设置同时执行所应用的修改。将阈值设置为1–255后，对二进制图像执行侵蚀功能以过滤神经元的边缘。“分析粒子”模块测量了所识别物体的平均灰度值。为了确保每个评估的粒子都是神经元，使用了不同的过滤器：1）根据大小自动选择；2）随后对每个粒子进行手动选择，以去除由软件识别的不是神经元（例如血管）的对象。通过汇总单个细胞的结果，确定每种情况下的平均灰度强度。然后，还计算了CNT，AD和新皮层LBD组的平均灰度强度。2）随后对每个粒子进行手动选择，以去除由软件识别的不是神经元（例如血管）的对象。通过汇总单个细胞的结果，确定每种情况下的平均灰度强度。然后，还计算了CNT，AD和新皮层LBD组的平均灰度强度。2）随后对每个粒子进行手动选择，以去除由软件识别的不是神经元（例如血管）的对象。通过汇总单个细胞的结果，确定每种情况下的平均灰度强度。然后，还计算了CNT，AD和新皮层LBD组的平均灰度强度。

统计分析

为了统计分析荧光IHC信号的灰度强度，使用了SigmaPlot 12.0软件（Systat Software Inc.）。进行了Shapiro-Wilk正态性检验，等方差检验，方差单向分析（ANOVA）和所有成对比较（Holm-Sidak方法），以确定结果的统计学意义。此外，还进行协方差分析（ANCOVA），以评估死亡年龄或验尸延迟对结果的影响。使用SPSS 25软件（IBM Corp.）进行测试，因变量是IF-IHC结果，固定因素是疾病和性别，协变量是死亡年龄和验尸延迟。

免疫组织化学显示强烈的神经元特异性细胞质反应。胶质细胞和神经元核为阴性（图   1）。在AD中，细胞外β-淀粉样斑块未显示阳性反应（图2，图   A）。在带有缠结的神经元和形态正常的细胞中，平均LMTK2免疫阳性均弱。但是，NFTs显示出稍强的反应（图   2. B板）。实验组的免疫阳性之间的差异是肉眼可察觉的（图   3）。基本上，与CNT和新皮层LBD相比，AD中的LMTK2免疫反应较弱。在每个皮质层中都可以检测到这种趋势（补充图   S1）。荧光图像上分析的神经元数量为1272。图   4描绘了CNT，AD和新皮层LBD组的汇总平均灰色强度。尽管实验组中个别病例的平均强度值有所不同（CNT，AD和新皮层LBD的平均强度值分别在13.6-19、10.8-13.4和12.8-16.4之间），但它们的标准偏差往往几乎相同，从而为统计分析。单向方差分析显示具有荧光（p <0,001）IHC的CNT，AD和新皮质LBD组的平均灰度强度在统计学上有显着差异。所有成对比较均显示CNT-AD（p <0.001）和新皮层LBD-AD（p = 0.014）组之间的统计学显着性差异（图   4））。在CNT与（相对于）新皮层LBD的比较中，没有明显的结果。根据ANCOVA测试，死亡年龄（p = 0.100）和验尸延迟（p = 0.718）都不会显着影响IF-IHC的结果。

狐猴酪氨酸激酶2（LMTK2）在人脑组织中的神经元特异性。该图描绘了灰色（左侧）和白色（右侧）之间的边界（虚线）。神经元显示出细胞质免疫阳性（插入A），而在神经胶质细胞中则无法检测到阳性反应（插入B）。[通过3,3'-二氨基联苯胺（DAB）色原显色蛋白质。核复染色为苏木精。比例尺：100 µm]。

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狐猴酪氨酸激酶2（LMKT2）与阿尔茨海默氏病（AD）特定病理变化之间的关联。图（A）在β-淀粉样蛋白斑块（黑星）中没有LMTK2免疫反应。小图（B），在带有缠结的神经元（在左侧）和形态正常的神经元（在右侧）中，平均LMTK2免疫阳性同样弱。但是，神经原纤维缠结显示出稍强的反应（黑色箭头）。[通过3,3'-二氨基联苯胺（DAB）色原显色蛋白质。用苏木精复核。比例尺：20 µm]。

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与新皮质路易体病（LBD）和对照脑相比，阿尔茨海默氏病（AD）中狐猴酪氨酸激酶2（LMTK2）的标记减少。在对照和新皮层的LBD中，分别使用生色（棕色）技术（面板A，B）和荧光（红色）技术（面板E，F），LMTK2的免疫阳性性比AD（面板C，G）更强。还展示了IHC阴性玻片（未应用抗LMTK2一抗）（图D，H）。[通过3,3'-二氨基联苯胺（DAB）色原和AlexaFluor®594荧光染料观察蛋白质。核复染分别为生色和荧光载玻片上的苏木精和4'，6-二mid基-2-苯基吲哚（DAPI）。比例尺：50 µm]。

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对照（CNT），阿尔茨海默氏病（AD）和新皮质路易体病（LBD）组的荧光狐猴酪氨酸激酶2（LMTK2）免疫组化（IHC）强度图。显示了荧光信号的平均灰度强度。CNT-AD（p <0.001（***））和新皮层LBD-AD（p <0.05（*））之间有统计学上的显着差异，而CNT和新皮层LBD组之间的比较未显示显着结果。[颜色代码：黄色列= CNT；蓝色列= AD，灰色列= LBD]。

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根据文献，我们发现在神经组织中LMTK2的表达定位于神经元的细胞质，而细胞核和神经胶质细胞则为阴性16。AD中的β-淀粉样蛋白斑块未累积LMTK2，表明它不参与这些蛋白质聚集体的形成。有趣的是，在带有AD缠结的神经元和形态正常的细胞中，平均胞质免疫反应也表现出类似的弱点，这表明LMTK2的减少是受NFT影响的大脑区域的普遍特征。这种改变可能是发病机理的早期事件，其发生在并预测形态变化的出现之前。相反，NFT本身显示出稍强的LMTK2阳性。可以通过以下解释：一方面LMTK2可能是NFT的目前未描述的组成部分，另一方面，NFT的浓缩蛋白聚集体可能累积LMTK2，即使该酶的平均胞质表达在缠结中相对较低。轴承神经元。17。在我们的研究中，我们证明了与新皮质LBD和年龄匹配的CNT相比，AD样品中LMTK2免疫阳性降低。统计测试显示，CNT-AD组和新皮层LBD-AD组的平均灰度强度之间存在显着差异，而在CNT-新皮层LBD比较的情况下，尽管LBD的免疫阳性率降低，但结果没有统计学意义。与CNT相比，新皮质LBD中平均免疫阳性率适度降低可能是由于AD型病理的频繁共存引起的 18。该观察结果表明，降低的LMTK2表达可能是AD-（或tauopathy-）特异性改变，并且可能不直接与α-突触核蛋白病相关。根据我们的研究结果，最近的全基因组基因表达研究发现，在疾病进展过程中，转基因tau（Tau P301L）小鼠模型的皮质和海马区中LMTK2表达下降[43]。此外，在补充工作中，Morotz等人。最近通过蛋白质印迹分析发现了人类AD样品中LMTK2水平的降低19。由于他们调查了我们许多患者的冷冻组织样本，因此他们的研究证实了我们的结果。但是，它们既不能提供形态学分析，也不能提供LBD分析。因此，我们的研究提供了死后人类AD和新皮质LBD组织中LMTK2的第一个神经病理学特征。

尽管对LMTK2信号的分析超出了本研究的范围，但基于最近的细胞生物学和动物模型研究，降低的LMTK2水平改变了可能导致神经退行性变的三个重要细胞机制：（i）轴突运输，（ii）tau过度磷酸化，（iii）凋亡15（补充图   S2）。

轴突运输中断

作为极化细胞，神经元需要协调的轴突运输，以向其树突和轴突提供由体细胞产生的必需大分子。在生理条件下是LMTK2参与细胞内分子运输的协调20，21。但是，这种组织良好的机制的任何缺陷都可能导致细胞内细胞器和蛋白质的病理性积累。众所周知，轴突运输受阻是几种神经退行性疾病的发病机制中的早期事件22。最近的一篇论文描述了与Kinesin-1相关的轴突转运有关的LMTK2介导的通路13。作为一个主要的马达蛋白驱动蛋白1在亚细胞器，细胞内囊泡和信号蛋白的轴突运输至关重要的作用23，24，25。该蛋白质具有沿着微管移动的两条重链和两条轻链-负责货物的结合。Kinesin-1轻链（KLCs）的磷酸化是至关重要的调控机制23。GSK3β可以转移磷酰基向KLC2直接，导致货物的释放和抑制驱动蛋白1-依赖性转运26，27，28。曼瑟和同事最近描述CDK5如何影响通过LMTK2-PP1C相互作用这一信号通路27，29CDK5 / p35复合物作为LMTK2的上游激活剂在丝氨酸1418上使其磷酸化。在这种情况下，LMTK2可以磷酸化PP1的催化亚基，从而导致磷酸酶活性降低。最后，这些步骤有助于增加对GSK3β丝氨酸9的抑制磷酸化。因为，supressedGSK3β是不能抑制KLC2这个信号传导途径的支撑货物结合到子单元13，29。一个由驱动蛋白1输送的大分子是针对decapentaplegic同源物2（Smad2的）母亲13，30。Smad2是转化生长因子-β（TGF-β）核质信号通路的重要成员31。siRNA诱导的LMTK2沉默可破坏Kinesin-1介导的Smad2轴突运输，进而抑制TGF-β核信号转导32。混乱的TGF-β/ Smad2的途径有报道在阿尔茨海默氏病32，33。这些发现得出结论，降低的LMTK2水平可能会改变生理性轴突运输，从而促进神经变性。

Tau过度磷酸化

Tau过度磷酸化是AD 34的病理标志。在这个过程中CDK5和GSK3β的作用在几个研究中，研究35，36，37，38。在生理上，CDK5被辅因子p35 39激活。下的神经元应激产生的p35和p25的P10的裂解增加钙蛋白酶激活结果40，41。CDK5 / p25的复合物具有延长的半衰期/活性，导致下游靶标的超磷酸（例如TAU）38，42，43，44。如我们先前所述，CKD5 / p35可通过LMTK2介导的途径间接减毒GSK3β。然而，在缺乏LMTK2信令PP1的可以从GSK3β抑制除去磷酰基13，29。增强的GSK3β活性与tau蛋白35的过度磷酸化高度相关。我们认为在AD中上游调节剂CDK5与p25的异常偶联以及进一步未知的机制导致LMTK2的活性和表达降低，这导致GSK3β的过度活化并最终导致高磷酸化的tau和NFT的形成。

细胞凋亡

孔蒂 等。最近已经表征了潜在的LMTK2介导的凋亡调控45。在他们的研究中，siRNA诱导的LMTK2沉默降低了抗凋亡B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）和超大型B细胞淋巴瘤（Bcl-xL）的水平，并提高了促凋亡Bcl-2相互作用的水平细胞死亡的介体（Bim）。这些细胞显示出对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）和某些化学治疗剂的敏感性增加。改变的Bim和Bcl-2水平导致从PP1C和GSK3β丢失LMTK2-诱导抑制45。此外，在AD脑样本中也观察到Bim表达增加，而升高的Bcl-2水平似乎可以抵抗AD相关的细胞应激。46，47。研究人员组考虑神经变性为“神经元癌” 48，49，50。虽然神经元丧失增殖能力，某些有害刺激（例如过度氧化应激，β淀粉样蛋白的积累，等等）可诱导异常细胞周期重新进入 51，52，53，54，55。然而，这种不正常的处理是由不同的促凋亡机制终止 54，56。据推测，有害刺激会触发其他组织的不受控制的增殖和癌症形成，从而可能导致中枢神经系统广泛的神经元死亡。LMTK2在几种恶性肿瘤中的作用已得到讨论。降低在前列腺腺癌观察为其他常见以及LMTK2表达恶性肿瘤，例如肺或皮肤癌57，58，59，60，61，62，63。由于LMTK2参与凋亡因子的复杂调控，我们可以将其视为抑癌蛋白。因此，LMTK2的下调可能通过神经元稳态失调而促进肿瘤形成和神经退行性变。

研究的优势包括在两个最常见的人类神经变性痴呆症中提供LMTK2的第一个组织病理学特征。我们已经描述了LMTK2的细胞特异性，细胞内定位，皮层分布以及与标志性神经退行性变化（缠结神经元，β淀粉样斑块）的关联。我们已经证明，与CNT患者相比，新皮层LBD中LMTK2免疫阳性没有明显改变。此外，我们验证了补充蛋白质组学和细胞生物学研究的结果，证实了AD中蛋白质的水平显着降低。与一线病理检查不可行的定量分子生物学方法（即Western blot，qPCR）相比，所使用的IF-IHC是一种容易获得，相对便宜且快速的技术。

研究的局限性：在当前的工作中，我们还没有进行进一步的定量分析（即Western blot，qPCR）。然而，在补充工作中，Morotz等人。通过Western blot分析19验证了部分相同的CNT和AD病例LMTK2表达降低。最后，尽管病例数（n = 6 /组）相对较低，但实验组中的免疫阳性趋势（无明显异常值），AD，新皮层LBD和CNT组之间的显着差异，大量分析的神经元补充的蛋白质印迹数据进一步强有力地支持了我们的发现。

这项研究提供了人类AD和新皮质LBD样本中LMTK2的第一个神经病理学特征。除了先前未描述的形态特征外，我们还发现与CNT或新皮层LBD组相比，AD中的LMTK2免疫阳性显着降低。根据我们的研究结果，LMTK2的降低是AD（或tauopathies）特有的，而与CNT相比，LBD中免疫反应的适度降低可能是由于频繁共存的AD型病理所致。这些与细胞生物学和动物模型研究的证据一致。LMTK2可能通过三种机制促进AD的神经变性：轴突运输受阻，tau过度磷酸化和增强的细胞凋亡。由于AD的可用治疗方法症状明显，疗效有限，需要发现新的治疗靶标。最近的研究已经确定了LMTK2基因启动子中的2-O-Tetradecanoylphorphor-13-乙酸盐（TPA）响应元件。合成蛋白激酶C激活剂TPA刺激该区域增加了LMTK2的表达64在理论上对AD有益。但是，需要进一步的研究来阐明LMTK2在神经变性中的作用以及作为AD的治疗靶标。