免疫电泳(immunoelectrophoresis,IE)
1原理免疫电泳是指利用凝胶电泳，结合免疫扩散，以提高对混合组分分辨率的一种免疫化学分析技术。相应的抗原、抗体相遇后，比例恰当时，即出沉淀线。由于样品的游动图型呈放射状向外扩散，相应血清呈直线状扩散，于是二者相遇形成的沉淀线呈弧状。该方法可用来研究：抗原和抗体的相对应性；测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率；根据蛋白质的电泳迁移率、免疫特异性及其他特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质；鉴定抗原或抗体的纯度。
2材料和方法
(1)电泳仪：一般要求电泳仪的电压能为0～500V，而电流从0～100mA即可。
(2)电泳槽：电泳槽宜用闭合式，防止由于电泳过程中产热，而使其琼脂凝
胶中水份过度蒸发。作为电泳板的白金丝，必须与电泳槽等长，而槽中的缓冲液必须充分盖过电极，量要足够。
(3)电泳缓冲液：常用pH值86、离子强度为0075mol/L的巴比妥缓冲液。
其配法如下：
巴比妥276g
巴比妥钠1545g
蒸馏水加至1000ml
先将巴比妥放于已盛有300ml蒸馏水的三角烧瓶中加热熔化，再加入700ml蒸镏水，并加入巴比妥钠，溶后即可使用。也可先将巴比妥溶于1000ml蒸馏水中，然后再加入巴比妥。
(4)15%缓冲琼脂：称取琼脂粉15g放入100ml巴比妥缓冲液中，高压或煮沸溶化。
(5)操作方法：①取玻片一张，做好标记，然后按下图式样放上细玻璃棒(70×2mm)1根；
②把已溶化的15%巴比妥缓冲琼脂浇注在玻片上，每张25ml～30ml。注意勿使玻棒全部埋入琼脂中，应露1/3，浇注时不要使玻棒移动；
③打孔加样，按图形(图311)打孔(孔径1～2mm)，孔离玻棒不宜太远或太近，以4mm为宜，用毛细滴管把抗原滴入孔中，然后进行电泳；
④电泳，把琼脂板放入电泳槽的支架上，两端分别贴上用2～4层已浸透缓冲液的滤纸或滤布，同槽内的缓冲液架桥相连。滤纸的宽度要同琼脂板的宽度一致，不宜过窄或过宽。加样的一端接负极，另一端接正极。电压按玻片长度3～6V/cm为准(也可按电流计算，即玻片宽度2～4mA/cm)，一块26×76cm的玻片，用42～45V的端电压，端电压是用万用电表测量琼脂板两端所得的实际工作电表压，并不是电泳仪表指针所示的电压。电泳时间为1～2h；⑤加入抗体，电泳完毕，用柳叶刀沿玻璃棒两侧划开琼脂，取出玻棒(用小镊子取出)，即成为抗体槽，用毛细管滴加抗体，注意勿使抗体溢出；
⑥加毕抗体后，将琼脂板放入有盖浸有湿纱布的搪瓷盘中，置37℃恒温箱中扩散24h之后，取出，观察结果；
⑦染色，将琼脂板放生理水中浸泡24h，中间换液数次，取出后，用005%氨基黑10B染色5～10min，然后以1mol/L冰醋酸脱色至背景无色为止；
⑧保存标本的染色方法，取出琼脂板，浸泡于生理盐水中1～2天，以除去未起反应的蛋白质，再放置蒸馏水中脱盐4～5h，放固定液(60%酒精98ml、冰醋酸2ml)中2h，然后用绸布或滤纸打湿后，覆盖于琼脂板上，置37℃24h干燥后，再以蒸馏水打湿绸布，揭去。再放在氨基黑10B染色液(氨基黑10B05g，1mol/L醋酸500ml、01mol/L醋酸钠500ml)或偶氮胭脂红染色液中染色10～30min，取出以5%～10%冰醋酸脱色，至背景无色为止，用水冲几次，吸干水分，保存备用。
3结果
(1)常见的沉淀弧形：
由于经电泳后，分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散，而相应的抗体呈直线扩散，因此形成的沉淀线一般多呈弧形，常见的弧形如下：
①交叉弧，表示两个抗原成分的迁移率相近，但抗原性不同；
②平行弧，表示两个不同的抗原成分，它们的迁移率相同，但扩散率不同；
③加宽弧，一般是由于抗原过量所致；
④分枝弧，一般是由于抗体过量所致；
⑤沉淀线中间逐渐加宽，并接近抗体槽，一般由于抗原过量，在白蛋白位置处形成；
⑥其他还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。
(2)沉淀弧的曲度：匀质性的物质具有明确的迁移率，能生成曲度较大的沉淀弧。反之有较宽迁移范围的物质，其沉淀弧曲度较小。
(3)沉淀线的清晰度：沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关，也与抗体的来源有关。抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗血清的特点是形成沉淀线宽而淡，抗体过量对沉淀线影响较小，而抗原过量时，沉淀线发生部分溶解。马抗血清所形成的沉淀线致密，清晰，抗原或抗体过量时，沉淀线易溶解、消失，而且易产生继发性的非特异性沉淀线，因此，使用的抗原和抗体的比例要适当。
(4)沉淀弧的位置：高分子量的物质扩散慢，所形成的沉淀线离抗原孔较近，而分子量较小的物质，扩散速度快，沉淀弧离抗体槽近一些。抗原浓度高沉淀弧偏近抗体槽。反之，抗体浓度高，沉淀弧偏近抗原孔。
4注意事项
(1)免疫电泳法较他它电泳的优点在于具有特异性沉淀弧，即使电泳迁移率相同的组分也能检出，因此抗原数目可用独立弧来断定，缺点是免疫血清不能包括所有组分的抗体，其实这也是免疫化学方法的共性。
(2)在加入抗原时，为了观察方便起见，可于样品中加一滴电泳指示剂(聚蔗糖025ml，巴比妥缓冲液10ml，偶氮胭脂红005g)，这样便于随时掌握电泳的位置而决定结束电泳的时间。
(3)在观察免疫电泳结果时要注意，有些沉淀出现较早，消失很快。
(4)由于琼脂的质量与规格不同，将影响标定各抗原的位置。为此，最好用标准抗原或国际通用琼脂定位，作为鉴定时的参考指标。
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