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免疫印迹法(immunoblotting)

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发表时间:2019-11-22 10:59

免疫印迹法(immunoblotting)

1 原理

首先将抗原样品加在凝胶板上,进行单向或双向电泳,使抗原分离成各种单一成分;然后取

固定化基质膜(如硝酸纤维膜,NC)与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其他

外力作用下,使凝胶中的各种单一抗原组分转移到印迹纸上,并且固相化。最后再应用免疫

复盖液技术,如免疫同位素探针或免疫酶探针等,对抗原固定化基质膜进行检测和分析。该

法实质上是将凝胶电泳、固定化技术和免疫检定技术融为一体而创立的一种实验检测技术。

免疫印迹法是近几年发展起来的一项分析抗原、抗体的新技术。目前,免疫印迹法已成功应

用于生物医学各个领域,如细菌蛋白质、细菌脂多糖、病毒、寄生虫、变应原、自身抗原、

免疫复合物、补体及细胞表面蛋白等抗原的分析、单特异抗体的纯化、免疫球蛋白快速分析

及单克隆抗体筛选等。

免疫印迹法具有以下优点:①湿的固定化基质膜柔韧,易于操作;②固定化的生物大分子

可均一的与各种免疫探针接近,不会象凝胶那样受孔径阻隔;③免疫印迹分析只需少量试

剂;④孵育、洗涤的时间明显缩短;⑤可同时制作多个拷贝,用于多种分析和鉴定;⑥

结果以图谱形式出现可长期保存;⑦免疫探针可通过降低pH值等方法,象抹去录音磁带一

样将探针抹掉,再换用第二探针进行分析检测;⑧不仅可鉴定抗原样品中各成分的免疫原

性,还可测出分子量。

2 材料和方法

材料:

(1) 凝胶贮液,见表311。[HJ1]

311Tris甘氨酸(laemmli)变性(SDS)不连续电泳贮液

[HJ*8]

溶液配制

1AcrBis375∶10或375∶05A

cr. 375g,Bis. 1或05g加水至100ml,20℃贮存

2下层胶(分离胶)缓冲液15mol/L TrisHCl,pH值88Tris 36

6g, 1mol/L HCl 48ml, 加水至100ml,4℃贮存

3上层胶(浓缩胶)缓冲液05mol/L TrisHCl,pH值68Tris 605g, 1m

ol/L HCl 48ml, 加水至100ml,4℃贮存

4TEMED,05%(V/V)TEMED 05ml,加水至100ml,避光4℃贮存

5SDS,20%(W/V)SDS 20g,加水至100ml,20℃贮存

6过硫酸铵,15%过硫酸铵15g,加水至100ml,新鲜配制

7分离胶上层覆盖液SDS 01g, 加水至100ml,溶于喷雾瓶中

8样品处理液05mol/L TrisHCl(pH值68)625ml,2巯基乙

5ml,甘油10ml, SDS 23g,01%溴酚蓝1ml,加水至100ml,用该溶液对抗原作适当稀

释,煮沸1~2min

9电极缓冲液Tris 6g,甘氨酸288g,20%SDS 5ml加水至100ml

10固定液磺基水杨酸173g,三氯醋酸575g,加水至500ml

11染色液冰乙酸100ml,甲醇500ml,蒸馏水400ml,考马斯亮蓝1~2g

20℃染色45~60min或加温染色10min

12脱色液10%(V/V)乙酸。换液数次,至无色

注:配制15%~20%凝胶,Acr∶Bis为375∶05或375∶025

(2) 垂直板电泳槽,普通稳流稳压电泳仪。

(3) 硝酸纤维素滤膜(NC)或硝酸纤维素混合素酯膜(上海医药工业研究所研制)。

(4) 转移电泳槽,转移电泳仪(高电流)。

(5) 25mmol/L Tris192mmol/L甘氨酸转移电泳缓冲液(pH值83):Tris6g,甘氨酸288g

,甲醇或异丙醇400ml(或不含),加水至2000ml。

(6) 免疫覆盖液试剂

①兔免疫血清(第一抗体),羊(或驴)抗兔IgGHRP结合物(第二抗体);

②33二氨基联苯胺底物溶液,以TrisHCl(pH值76)缓冲液配制,含003%H2O2

③洗涤液为含005%Tween20的PBS(pH值74);稀释液为含01%BSA、005%Tween20

PBS;封闭液为含3%BSA的PBS。

方法:

(1) 抗原分离:采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗原,其方法为稍加修改

Laemmli不连续电泳缓冲系统。电泳贮液及凝胶制备详见表311和表312。

312Tris甘氨酸

(laemmli)变性(SDS)不连续电泳凝胶制备

凝胶贮液(ml)

下层胶(分离胶)Acr最终浓度

72%90%120%150%200%

上层胶(浓缩胶)

1AcrBis溶液575729

612016008

2下层胶或上层胶缓冲液75757575752

5

3SDS,20%溶液015015015015015005

4TEMED,05%242424242408

5蒸馏水1345120967232515

6过硫酸铵,15%07507507507507507

注:将凝胶贮液1~5混匀,抽气2min,加入凝胶贮液6。分离胶顶部滴

01%SDS溶液,使分离胶液面保持水平,置37℃聚胶30~60min;吸出分离胶覆盖液,加

入上层胶,置37℃聚合60min。电泳时间为3~4h,电流强度为30~40mA。

315“凝胶三明治”示意

1多孔塑料板2海棉垫3滤纸4NC膜5凝胶

(2) 抗原印迹:切取抗原分离胶,置转移电泳缓冲液中平衡10~20min。将固

定化基质膜(以NC为例)、滤纸、海棉垫预先用转移电泳液浸湿,按图315术式装配成“

凝胶三明治”,

然后插入转移电泳槽中。“三明治”各层间要求无气泡存在,并且NC的暗面侧贴于凝胶。将

电泳槽中注满电泳液,使之完全浸没凝胶夹板。位于凝胶侧的电极接负极,NC侧的电极接正

极。电流强度为200~300mA。电泳时间随洗脱抗原的分子量大小而不同。小分子量抗原洗脱

需电泳1~2h;大分子量抗原洗脱,需电泳6h或更长时间。

(3) 抗原检定:切取供“对照”用的一条抗原固定化NC,用考马斯亮蓝染色1

5min,脱色

,作抗原定位检查和各抗原带的分子量测定;NC的剩余部分用于免疫学分析,操作程序(以

酶染色法为例):①抗原印迹后,取出NC,用PBS(pH值74)漂洗2min;

②将NC放入封闭液内,置37℃淬灭1~2h,用稀释液对兔免疫血清(第一抗体)作适当稀释

(1∶100),覆盖NC,37℃孵育1~2h,用洗涤液洗涤3次,每次10min;

③对羊(或驴)抗兔IgGHRP结合物(第二抗体)作适当稀释(1∶2000),覆盖NC,置37℃孵育1

2h,洗涤同前;

④用3,3二氨基联苯胺底物溶液覆盖NC,室温显色20~30min,蒸馏水漂洗,中止反应;

⑤结果分析,混合抗原经免疫印迹分析后,在NC上呈现数条棕红色的抗原带。根据抗原的含

量或免疫原性的差异,抗原带的颜色深浅也有所不同。免疫酶染色的结果与考马斯亮蓝染色

结果对照,比较其各自呈现的染色带,确定出抗原的分子量。

3 注意事项

(1) 凝胶贮液不宜存放过久。

(2) 在向分离胶表面加入01%SDS覆盖液时,应沿玻璃壁缓慢流下;切忌成坠滴入,以免破

坏分离胶液面及造成顶部凝胶浓度降低,影响样品的迁移与分离。

(3) 在装配“凝胶三明治”时,NC一经与凝胶接触,就不能再行移动。

(4) 长时间电转移时,电泳槽需设有散热装置或在冰箱内进行。

(5) 影响免疫酶染色法的诸因素可参照有关章节。

二、影响电泳的因素

带电质点之所以能在电场中移动,以及具有一定的移动速度,这是受其本身所带的电荷、电

场强度、溶液的pH值、离子强度以及电渗等因素影响的。

(一) 带电质粒的性质即颗粒所带电荷的量、颗粒大小及形状等。带电荷

越多、分子越小,泳动速度越快。

(二) 电场强度电场强度是单位厘米的电位差。电场强度越大,带电质点

游动速度越快,反之则越慢。

(三) 电泳缓冲溶液的pH值溶液的pH值决定于带电质点的解离程度,也决

定了带电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言,pH值离等电点越远,颗粒所带的

电荷越多,泳动速度也越快,反之则越慢。

蛋白质在酸性溶液中易变性,而在偏碱性溶液中比较稳定,所以蛋白质电泳大多用pH值82

88的巴比妥或硼酸缓冲液,在这种pH值的溶液中,血清蛋白一般都带负电荷。

(四) 电泳缓冲溶液的离子强度溶液的离子强度越高,颗粒的泳动速度越

慢,反之则越快。血清蛋白质电泳时,一般最适的离子强度在0025~0075mol/L之间。

离子强度太低,缓冲液的电泳能力下降,扩散现象严重,使分辨力明显降低;离子强度太高

,将有大量的电流通过琼脂板,由此而产生的热量使板中水分大量蒸发,严重时,可使琼脂

板断裂而致电泳失败。

(五) 电渗作用电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼

脂中含有SO4-

,带负电荷,造成静电感应,致使附近的水带正电荷,而向负极移动。所以电泳时有两种力

,即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷,向负极移动,则因电渗作用向负极移动得更

快,如果物质向正极移动,所带电荷少,则电泳力抵不过电渗力,则也向负极移动,血清中

γ球蛋白就是如此。所以在做电泳时,要选择电渗作用小的物质(如琼脂糖)作为支撑物

,以减少电渗作用对电泳的影响。但是有的电泳技术(如对流免疫电泳)也正是利用了电渗

作用而进行设计的。

(六) 吸附作用即介质对样品的滞留作用。它导致了样品的拖尾现象,而

降低了分辨率。纸的吸附作用最大,硝酸纤维膜(NC)的作用较小或无,故NC是电泳的良好支

撑物。

(七)电泳时间电泳时间与迁移率成正比。


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