转录因子GATA 3是调节T辅助2(Th2)细胞分化和诱导Th2细胞因子(如IL-4、IL-5和IL-13)表达的主要调节因子。Th2细胞因子参与了对外来病原体(如寄生虫)的保护性免疫反应。然而，过度分泌Th2细胞因子会导致2型变态反应性炎症.因此，GATA 3抑制剂的应用为调节Th2细胞因子的产生提供了一种新的治疗策略。在这里，我们建立了一个新的高通量筛选系统，以抑制dna结合蛋白，如转录因子，并确定吡咯硫代甘氨酸是一种新的抑制剂GATA 3 DNA结合活性。Pyrrothiogatain抑制GATA 3和GATA家族其他成员的DNA结合活性。Pyrrothiogatain还抑制GATA 3与Sox 4的相互作用，提示它与GATA 3的DNA结合区相互作用。此外，吡咯硫代甘氨酸在不影响Th1细胞分化的情况下，明显抑制Th2细胞的分化，抑制Th2细胞因子的表达和产生。提示吡咯硫代甘氨酸通过抑制GATA 3的DNA结合活性来调节Th2细胞的分化和功能，这表明我们的药物筛选系统对于开发抑制转录因子DNA结合活性的新型小分子化合物是有效的。

转录因子是调节细胞外环境信号刺激下基因表达和细胞命运的关键分子。1,2...转录因子作为多个信号转导的最后一步，通过核转移、二聚和DNA结合调控基因表达。就转录因子的药理靶点而言，直接抑制这些事件有助于药物的发展。3...转录因子的主要生化性质是DNA结合和蛋白-蛋白质相互作用.然而，由于生物活性转录因子的重组表达和纯化具有挑战性，因此很难建立药物筛选系统来产生针对转录因子的抑制剂，因为没有它们的伙伴蛋白或目标dna，它们通常具有不稳定的结构。3,4...此外，除了核受体家族外，转录因子缺乏一个深疏水的口袋，可以进入调节其生物学功能的小分子化合物。4...因此，开发一种抑制转录因子的抑制剂仍是一个挑战，它被认为是治疗的有效靶点。

识别外源抗原后，幼稚的CD4+T细胞分化为多种效应辅助T细胞亚群，包括Th1、Th2、Th17和iTreg，它们在适应性免疫反应中起着关键作用，但它们有可能驱动免疫介导的疾病。5,6...过敏性哮喘是以嗜酸性粒细胞增多、杯状细胞增生和气道平滑肌收缩为特征的一种Th2细胞介导的疾病。7...这些病理事件是由于Th2细胞过度分化和活化所致。8，是Th2细胞因子的主要来源，如IL-4、IL-5和IL-13。9...因此，一种调节Th2细胞分化和功能的策略将为变态反应性疾病提供一种新的治疗策略。

GATA(GATA-结合蛋白)家族由GATA 1到GATA 6的六个成员组成。它们包含N端区的转活化区和C端区的锌指DNA结合区，并与特定的DNA序列(A/T)-GATA-(A/G)结合。GATA 3被认为是调控Th2细胞分化和产生Th2细胞因子的主要调节因子，它与广泛的Th2细胞因子基因位点结合在一起。10,11，而GATA 3则通过阻断Th1特异性基因的转录来抑制Th1细胞的分化。12,13,14,15,16...在Th2细胞因子基因中，IL-5和IL-13直接受GATA 3与相应启动子区的结合调控。5,17...重要的是，GATA 3在变态反应患者的变应性炎症细胞中被报道上调。18,19被认为是治疗过敏性炎症的有吸引力的治疗靶点。8.

本研究以GATA 3为模型，建立了转录因子高通量抑制剂筛选系统。该抑制剂筛选系统专门鉴定了抑制转录因子DNA结合活性的因素，并促进了一种新的GATA家族抑制剂--吡咯硫代氨基胍(Pyrrothiogatain)的研制。结果表明，吡咯硫代甘氨酸可抑制GATA 3的DNA结合活性。此外，吡咯硫代甘氨酸被抑制。离体Th2细胞分化和Th2细胞因子的分泌不影响Th1细胞的分化。

检测DNA-蛋白质相互作用的高通量检测方法的建立

在此之前，我们开发了一种药物筛选系统，根据小麦无细胞系统和α-Screen技术，生成一种抑制蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂。20,21，这是一种高通量的发光结合试验。我们鉴定了一种NF-κB抑制剂(DANFIN)。20和两种脱落酸受体激动剂(JFA 1和JFA 2)21...在本研究中，我们试图构建一个药物筛选系统，利用无细胞基础系统开发抑制DNA-蛋白质相互作用的抑制剂。作为模型，我们选择了GATA 3转录因子，因为GATA 3被认为是Th2细胞分化和产生Th2细胞因子的主调节因子。10,11而GATA 3与其dna序列的结合已经被报道。11...为了确定GATA 3蛋白的功能，我们利用小麦无细胞系统合成了带有N端标记的重组全长GATA 3蛋白。用免疫印迹法测定经离心后的全翻译混合物(W)和上清液(S)中GATA 3的含量。1A)，表明重组全长GATA 3是以可溶性形式合成的。

建立高通量检测系统，直接检测DNA与蛋白质的相互作用.(A)小麦无细胞体系合成的标记重组GATA 3(标志GATA 3)的免疫印迹分析。用抗标志M2抗体对离心后得到的全翻译混合物(W)和上清液(S)进行分析。(B)高通量生化DNA结合分析系统的原理图，用于检测GATA 3与靶DNA的直接结合。当标记的GATA 3在5个主要末端与生物素标记的DNA结合时，AlphaScreen珠产生发光信号。(C)GATA 3与其一致的DNA结合基序的结合分析。在不同浓度NaCl(100~150 mm)存在下，对标记GATA 3(1L)和生物素化DNA(10 NM)的粗翻译混合物进行了结合试验。以一个突变的GATA结合位点的寡核苷酸作为对照。(D)结合试验，如(C)在指示浓度的生物素化DNA存在下进行。一种含有标记GATA 3和150 mm NaCl的反应混合物，其制备条件与C)与1~10 NM生物素化DNA混合。(E)无标记GATA共识DNA竞争分析。与以下条件相同的结合试验D以生物素化DNA(4 NM)和无标记GATA共识DNA(0~250 nm)作为对照。(F)用AlphaScreen鉴定结合试验的质量。根据GATA 3与GATA一致DNA(阳性对照，n=20)或GATA结合位点突变体(阴性对照，n=20)的结合反应计算出‘Z’因子。在(C-E)，所有数据都表示为三个独立实验的个别点，误差条表示标准偏差。

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我们使用了AlphaScreen技术20,21检测GATA 3与靶DNA(T)的直接结合加塔(A)用生物素标记。1B)。我们用重组标志标记的全长GATA 3和生物素化GATA共识DNA(GATA DNA)和在不同NaCl浓度(100~150 mm)下GATA结合基序突变的阴性对照DNA进行结合试验。通过GATA 3与靶DNA的结合，获得了较高的发光信号。1C)。在100 mm和125 mm NaCl存在下，由于GATA 3与阴性对照DNA的非特异性结合而产生了相当大的发光信号，而在150 mm NaCl存在下，则破坏了阴性对照的发光信号。此外，在不同浓度的GATA DNA下进行了结合试验，其发光信号以剂量依赖性的方式增强(见图)。1D)。相反，负控制DNA产生了一个非常低强度的发光信号(<1500)，相当于背景强度水平。这些结果表明，该结合系统能够检测特异DNA与GATA 3蛋白的相互作用。

为进一步验证结合实验是否能检测生物素化DNA与GATA 3蛋白相互作用的抑制作用，采用序列相同的补充非标记DNA进行竞争实验。因此，通过添加非标记的GATA共识DNA，可以观察到发光信号强度的剂量依赖性下降(图1)。1E)。而GATA 3的DNA结合活性不受突变体DNA补充的影响。这些结果表明，该方法可以检测GATA3-DNA相互作用的抑制作用.

接下来，我们研究了该方法是否适用于20个独立阳性反应和阴性反应的高通量筛选，以及一个Z‘因子，被称为高通量筛选的准确性和质量指标，用于验证。Z‘因子为0.88。1F)，表明这种无细胞的蛋白质-DNA相互作用试验可用于高通量筛选。

用小麦无细胞药物筛选系统鉴定GATA 3抑制剂

我们使用图中所示的检测方法进行了高通量筛选。1目的：鉴定GATA 3 DNA结合活性抑制剂。药物筛选的结果在图中总结为流程图。2A...在对9，600种化合物的首次筛选中，我们发现了105个化合物，当化合物浓度为10μm时，抑制率>20%(图1)。2B)。我们进行了第二次筛选，以排除假阳性化合物。如图所示。2C一种化合物能特异性地抑制GATA3-DNA结合，而不影响α筛选和rela-DNA相互作用。我们鉴定了这种化合物(3-(2，5-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)thiophene-2-carboxylic酸)为吡咯硫代甘氨酸(吡咯和含GATA 3抑制剂的硫代呋喃)(如图所示)。2A)。用电泳迁移率转移法(EMSA)验证了吡咯硫代盖坦对GATA3-DNA相互作用的抑制作用。GATA3-DNA结合产生的移带强度以吡咯硫代甘氨酸剂量依赖方式(50~100μm)降低(图5 0~10 0μm)。二维空间)，表明吡咯硫代甘氨酸抑制GATA3-DNA相互作用。

用小麦无细胞药物筛选系统鉴定GATA 3抑制剂。(A)高通量筛选的流程图，以确定抑制GATA 3结合活性的3-(2，5-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)thiophene-2-carboxylic酸。3-(2，5-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)thiophene-2-carboxylic酸命名为吡咯硫代甘氨酸(吡咯和含GATA 3抑制剂的硫氟醚)。(B)使用9，600种化合物的第一个屏幕的结果。在测定中，每种化合物的最终浓度为10毫克。C第二次筛选结果显示吡咯硫代甘氨酸的抑制率。在不同浓度的吡咯硫代甘露聚糖(0~10μm)存在下，进行GATA 3 DNA结合活性的抑制实验。以生物素化标志肽为对照，对α-筛选法中化合物的干扰进行了测定。此外，以rela与其靶DNA的结合试验作为GATA 3的对照。(D)在不同浓度吡咯硫代甘氨酸(0~100 M)存在下，GATA 3的电泳迁移率转移试验(EMSA)及其含有寡核苷酸的一致基序。GATA 3一致寡核苷酸标记32用放射自显影法检测P。(EMTS法检测吡咯硫代氨基胍的细胞毒性。用不同浓度的吡咯硫代甘氨酸(0~100 M)培养Jurkat细胞3天，进行MTS试验。(F)用萤火虫荧光素酶报告基因转染HEK293T细胞伊-5GATA 3表达质粒存在(+)或缺失(−)时，启动子+肾荧光素酶报告。然后，这些细胞不受刺激(Med)。或刺激(Stim.)与佛波酯PMA(30 ng/mL)在吡咯硫代甘氨酸(0~30 M)存在下。荧光素酶活性与肾荧光素酶活性有关。在(B、D、E)，所有数据都表示为三个独立实验的个别点，误差条表示标准偏差。

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其次，进行细胞毒性试验，以评估吡咯硫代加氨酸是否可用于细胞检测。用不同浓度的吡咯硫代甘氨酸(0~100 M)培养Jurkat细胞3d，用MTS法测定细胞活力。如图所示。2E，吡咯硫脲对细胞活力无影响。GATA 3诱导伊-5基因通过GATA一致基序直接结合到IL-5启动子上5...因此，我们用荧光素酶报告法研究吡咯硫代甘露聚糖是否抑制GATA 3依赖的IL-5启动子的激活。22,23...如图所示。2F吡咯硫代加因明显抑制GATA 3依赖的IL-5启动子的转录激活，提示吡咯硫代甘氨酸抑制GATA 3在细胞内的DNA结合活性。这些结果表明，小麦无细胞筛选得到的吡咯硫代甘氨酸对GATA 3的功能有抑制作用。

吡咯硫代氨基胍对其他GATA家族蛋白DNA结合活性的影响

我们接下来用无细胞系统和AlphaScreen技术评估了吡咯硫代甘氨酸对其他GATA家族蛋白DNA结合活性的抑制作用。报道了GATA 1至GATA 6中的6个GATA蛋白。11，我们试图利用无细胞系统合成它们的全长蛋白质。Gata蛋白，除GATA 6外，均以可溶性形式成功合成。3A)和四个GATA蛋白，GATA 2到GATA 5，具有相似的DNA结合活性(图1)。3B)。由于GATA 1蛋白不能与同一DNA探针结合，因此被排除在进一步的分析之外。Pyrrothiogatain抑制GATA 2与GATA 5的DNA结合活性(图5)。3C其IC 50值约为50μm，EMSA也得到了相似的抑制结果(图1)。三维空间)。这些数据表明吡咯硫代甘氨酸是GATA家族蛋白的泛抑制剂.

吡咯硫代氨基胍对GATA家族蛋白DNA结合活性的影响。(A)标记重组GATA家族蛋白(GATA1-GATA6)的免疫印迹分析。用抗标记M2抗体分析整个翻译混合物(W)和上清液(S)。(B)AlphaScreen法检测GATA家族与包含GATA一致结合序列的DNA之间的结合，使用与图中相同的协议。1F. (C)在不同浓度吡咯硫代甘氨酸(0~200 M)存在下，对GATA家族蛋白(GATA2-GATA5)DNA结合活性进行抑制试验。结合活性由相对的AlphaScreen信号表示。(D)结合GATA家族蛋白(GATA2-GATA5)在吡咯硫代甘氨酸(0~100 M)存在下的EMSA结果。Gata与标记的DNA结合32用放射自显影法检测P。在(B、C)，所有数据都表示为三个独立实验的个别点，误差条表示标准偏差。

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Pyrrothiogatain抑制GATA3-Sox4相互作用

据报道，GATA 3蛋白与Sox 4直接相互作用。22...接下来，我们研究了吡咯硫代甘氨酸是否中断了GATA 3与Sox 4之间的相互作用。如图所示。4A免疫印迹分析表明，小麦无细胞体系合成了N端生物素化全长Sox 4蛋白。用AlphaScreen系统分析生物素标记的Sox 4与标志GATA 3的相互作用。4B)。相互作用表明生物素化的SOX 4与标志GATA 3直接相互作用。4C)，但不带标志-DHFR，一种阴性对照。用AlphaScreen检测到吡咯硫代氨基胍的剂量依赖性降低GATA3-SOx4相互作用(图1)。4D)和免疫共沉淀。4E)。提示吡咯硫代甘氨酸也能抑制GATA 3蛋白与蛋白质的相互作用。

Pyrrothiogatain抑制GATA3-Sox4相互作用。(A)用小麦无细胞体系合成的生物素融合重组Sox 4(Biotin-Sox 4)的免疫印迹分析。用抗生物素抗体分析整个翻译混合物(W)和上清液(S)。(B)检测GATA 3与SOX 4直接结合的结合试验示意图。当标记的GATA 3与生物素结合时，AlphaScreen珠就会产生发光信号。(C)GATA 3和Sox 4的结合试验。利用AlphaScreen技术对发光信号进行检测。用标志-DHFR作为对照。(D)不同浓度吡咯硫代甘氨酸(0~100μm)对GATA 3和Sox 4结合的抑制作用。根据AlphaScreen信号计算结合活性。(E用免疫沉淀法检测在吡咯硫代加胺(0~100 M)存在下，重组GATA 3与Sox 4的结合情况。用小麦细胞体系合成了GATA 3和标志标记Sox 4，并用抗标记亲和琼脂糖凝胶进行免疫沉淀实验。在(C，D)，所有数据都表示为三个独立实验的个别点，误差条表示标准偏差。

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Pyrrothiogatain抑制Th2细胞分化及Th2细胞因子的产生

众所周知，GATA 3诱导Th2细胞分化。11...由于吡咯硫代甘氨酸对Jurkat T细胞的存活率没有影响(图1)。2E)研究吡咯硫代甘氨酸对Th2细胞分化的抑制作用。总CD4+在IL-2条件下分离培养T细胞，在吡咯硫代甘氨酸存在或不存在的条件下培养5d，用细胞内染色法检测T细胞的分化状态。吡咯硫代半乳糖(Pyrrothiogatain)处理可抑制IL-4-、IL-5-和IL-13产生细胞的产生。1(A)产生IFN-γ的Th1细胞数量增加。此外，酶联免疫吸附试验(ELISA)证实IL-4、IL-5、IL-10和IL-13的合成和mRNA表达下降。1B)和RT-qPCR(补充图)。1C)。同时检测到IFN-γ的产量和mRNA表达增加。GATA 3的表达在mRNA或蛋白水平上均未受影响(附图)。1C，D)。先前的一份报告指出，GATA 3可能使Tbx 21，它是Th1细胞的主调节器，通过直接绑定Tbx 21轨迹16...如所料，表示Tbx 21用吡咯硫代氨基胍治疗后增加(补充图)。1C).

为明确吡咯硫代甘氨酸对Th2细胞分化的影响，在Th 2条件下，在吡咯硫代甘氨酸存在或不存在的条件下纯化培养5天，用细胞内染色法检测Th2细胞的分化状态。吡咯硫代氨基胍可抑制IL-4-、IL-5-和IL-13产生的Th2细胞。5A)。ELISA法和RT-qPCR法分别证实IL-4、IL-5和IL-13 mRNA表达下降。5B、C)。然而，GATA 3的表达在mRNA或蛋白水平上均不受影响(图1)。5C，D)。在Th1条件下IFN-γ和IL-2产生Th1细胞的数量随吡咯硫代甘氨酸的增加而略有增加(补充图1)。2A，B)。提示吡咯硫代甘氨酸可选择性地抑制Th2细胞的分化。接下来，我们治疗了离体用吡咯硫代甘氨酸诱导分化的Th2细胞，观察吡咯硫代甘氨酸对Th2细胞因子产生的影响。总CD4+细胞在Th2条件下培养5天，然后在吡咯硫代甘氨酸存在或不存在的情况下，再刺激Th2细胞16h，如图所示。5E，吡咯硫代氨基胍处理可降低IL-4、IL-5和IL-13的生成.最后，我们研究了吡咯硫代氨基胍在OVA诱导的2型气道炎症小鼠模型中的作用。我们预计吡咯硫代甘氨酸可能对Th2依赖的过敏性炎症有积极的治疗作用。而吡咯硫代氨基胍对OVA致敏小鼠支气管肺泡灌洗液中炎性细胞的数量无明显影响(附图)。3A,B).

Pyrrothiogatain能抑制Th2细胞的分化和Th2细胞因子的产生。(AIL-5/IL-13、IL-4/IFN-γ和IL-2/IFN-γ在幼稚CD4中的细胞内染色+T细胞在Th2条件下，在吡咯硫代甘氨酸(30和80M)存在或不存在的情况下培养5天。(B酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Prothiogatain处理的Th2细胞产生的细胞因子(A)。(C用RT-PCR方法对吡咯硫代氨基胍处理的Th2细胞进行定量RT-PCR分析(A)。(D)幼稚CD4中GATA 3的免疫印迹分析+T细胞在Th2条件下，在吡咯硫代甘氨酸(80 M)存在或不存在的情况下培养5天。(E用固定化抗TCRβ单抗刺激Th2细胞在吡咯硫代甘氨酸(0~100 M)存在或不存在时作用16h。ELSA法测定培养上清液中IL-4、IL-5和IL-13的含量.在(B), (C)和(E)，所有数据都表示为三个独立实验的个别点，误差条表示标准偏差。

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综上所述，这些结果表明吡咯硫代甘氨酸抑制了Th2细胞的分化和Th2细胞因子的产生。离体，而不影响GATA 3的表达。

Pyrrothiogatain抑制GATA 3与Th2细胞因子基因位点的结合

据报道，GATA 3与Th2细胞因子基因位点结合，如IL-4V。A增强剂24，IL-4内含子增强子25，保守GATA 3-响应元件(CGRE)26和IL-5启动子27Th2细胞中的区域。我们研究了吡咯硫代甘氨酸是否抑制GATA 3与Th2细胞因子基因位点的结合。幼稚CD4+T细胞在Th2条件下，在80 M吡咯硫代甘氨酸存在或不存在的条件下培养2天，然后用抗GATA 3抗体进行染色质免疫沉淀。如图所示。6A，吡咯硫代甘氨酸抑制GATA 3与IL-4V的结合。A增强子、IL-4内含子增强子、CGRE和IL-5启动子区域。提示吡咯硫代甘氨酸可抑制Th2细胞中与Th2细胞因子基因位点结合的GATA 3 DNA。

Pyrrothiogatain抑制与Th2细胞因子基因位点结合的GATA 3 DNA。(A)Th2细胞的GATA 3结合位点如示意图所示。幼稚CD4中GATA 3染色质免疫沉淀分析+T细胞在Th2条件下，在吡咯硫代甘氨酸(80 M)存在或不存在的情况下培养2d。所有数据用三个独立实验的平均值表示，误差条表示标准偏差。

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在本研究中，我们建立了一个药物筛选系统，利用无细胞系统开发抗转录因子抑制剂。尽管有一些研究报道了针对转录因子的各种高通量抑制剂筛选的发展。28,29,30，我们的筛选系统显示了几个优点。在许多药物靶向转录因子的案例中，生化和细胞检测都会出现方法学问题。在生化分析中，很难纯化具有dna结合活性的转录因子，也很难用几种化合物来验证这种活性，以确定其生化功能。3,4，因为许多转录因子含有不稳定的结构区域，没有伙伴蛋白或目标dna。4...此外，gta 3 dna结合域还包含一个具有非结构化区域的灵活链接器。31...针对转录因子的细胞药物筛选，采用荧光素酶-报告法筛选，以转录活性为指标。30...然而，基于细胞的分析很有可能产生意想不到的化合物，间接地影响转录因子的功能。3...我们的小麦无细胞药物筛选系统不需要蛋白质纯化，可以直接检测转录因子的DNA结合活性。因此，我们的筛选系统对于开发靶向转录因子的化学化合物是非常有用的。

利用新开发的筛选系统，我们从9600个小化合物的化学文库中鉴定了抑制GATA 3 DNA结合活性的吡咯硫代甘氨酸(Pyrrothiogatain)。Pyrrothiogatain可抑制Th2细胞的分化和Th2细胞因子的产生。5A，B)在mRNA和蛋白水平上对GATA 3的表达没有任何影响(如图所示)。5C，D)。在Th1细胞分化过程中，GATA 3可抑制IFN-γ的产生和Th1特异性基因的表达。12,13,14,15,16...由于吡咯硫代甘氨酸促进了基因表达和干扰素-γ(补充图)的产生。1这些结果也强烈地暗示了GATA 3在细胞中的作用受到抑制。此外，对GATA 3结合位点的全基因组分析表明，GATA 3可能参与沉默Tbx 21表达式直接绑定Tbx 21轨迹16...结果表明Tbx 21用吡咯硫代甘氨酸(附图)诱导表达。1C)。提示吡咯硫代甘氨酸是一种调节Th-子集分化的化合物，抑制Th2细胞分化，同时诱导Th1细胞分化。

据报道，GATA 3与Th2细胞因子基因位点结合，如IL-4V。A增强剂24，IL-4内含子增强子25和CGRE26...IL-4VA增强子和IL-4内含子增强子作为GATA 3结合位点是IL-4产生的调控区.此外，CGRE还能通过GATA 3结合诱导IL-13的产生。在本研究中，我们证实吡咯硫代甘氨酸抑制GATA 3与这些Th2细胞因子基因区的结合。结果表明，吡咯硫代甘氨酸通过抑制GATA 3与Th2细胞因子基因位点的结合而抑制Th2细胞的分化。

作为一种靶向mRNA的GATA 3抑制剂，DNA酶切割GATA 3 mRNA已被开发用于治疗过敏性哮喘。32,33...我们预计吡咯硫代甘氨酸可能对Th2依赖的过敏性炎症有积极的治疗作用。而吡咯硫代氨基胍对OVA致敏小鼠支气管肺泡灌洗液中炎性细胞的数量无明显影响(附图)。3A,B)。提示吡咯硫代氨基胍可改善Th2依赖性变应性炎症的抑制活性、对GATA 3的亲和力和(或)生物利用度。

我们研究了吡咯硫代甘氨酸是否对GATA家族蛋白的DNA结合活性有抑制作用.AlphaScreen和EMSA分析表明，吡咯硫代加氨酸能抑制GATA2-GATA5的DNA结合活性。这些结果表明，吡咯硫代甘氨酸影响GATA家族的DNA结合域，因为DNA结合域在GATA家族中具有较高的氨基酸序列同源性。此外，吡咯硫代甘氨酸还可以抑制gta 3和sox 4之间的相互作用，可能是通过与gta 3的dna结合域相互作用而实现的。22...尽管吡咯硫代加氨酸对GATA 1和GATA 6的DNA结合活性的抑制作用不能被评估，但我们的实验结果表明吡咯硫代加氨酸可能抑制了GATA家族蛋白的DNA结合活性。

转录因子的过度表达和功能障碍导致多种人类疾病，如癌症和自身免疫性疾病。1...因此，通过基因表达调控细胞分化和命运的转录因子的鉴定可以被认为是一个潜在的药理靶点。34...基因表达的调控不是控制转录因子，而是通过抑制上游信号转导作为一种治疗策略。然而，针对信号转导蛋白的药理策略缺乏特异性，有可能产生偏离目标的有害事件。3...因此，开发与转录因子直接相互作用的药物显得尤为重要。总之，我们开发了适合开发抗转录因子DNA结合活性抑制剂的小麦无细胞药物筛选系统。我们的药物筛选系统导致了GATA家族抑制剂吡咯硫代甘氨酸(Pyrrothiogatain)的发展，该抑制剂调节Th-子集的分化，表明我们的药物筛选系统对于开发抑制转录因子DNA结合活性的新型小化合物是有效的。

质粒构建

将从哺乳动物基因组中获得的cDNA克隆的开放阅读框亚克隆到小麦无细胞蛋白合成系统的PEU基表达载体中，或克隆到pcDNA3.1中，用于哺乳动物细胞的表达。

小麦无细胞蛋白合成及免疫印迹分析

离体根据制造商的说明，用WEPRO1240表达试剂盒(无细胞科学)通过双层方法进行转录和翻译。生物素标记是用前面描述的方法进行的。35...具体来说，在翻译过程中，由小麦无细胞体系合成的生物素连接酶(Bira)被添加到底层，并在0.5μM D-生物素(Nacalai Tesque)存在下孵育。用抗FALG-HRP抗体(M2，cat#A 8592，Sigma，1：4000)和抗AGIA-HRP抗体免疫印迹法分析离心后的全部裂解液和上清液。36.

利用AlphaScreen技术进行DNA结合试验

在384孔α平板(PerkinElmer)上进行蛋白质-DNA结合实验，在AlphaScreen缓冲液(100 mm Tris-HCl(pH8.0)、150 mM NaCl、0.1%吐温20、1mg/mL BSA)和5 L生物素化寡核苷酸(0~10μm终浓度)中加入10μL标记蛋白。将平板在26°C下孵育1h，将含有0.4g/mL抗DYKDDK抗体(1E6，Wako)的检测混合物中的10μL、0.1 L链霉亲和素结合的α-噬菌体供体珠和0.1μL蛋白A-结合的α-Screen受体珠在AlphaScreen缓冲液中混合，在26°C下孵育1h，然后用AlphaScreen信号检测程序(Perkinelmer)视觉设备检测α-Screen信号。

使用了下列寡核苷酸：

GATA 3一致DNA，5‘-生物素-CACTTGATAAAGTGATACTCT-3’；

mt，5‘-生物素-CACTTCTCTCTCTCT-3’。

药物筛选与验证

在基于AlphaScreen的化学图书馆筛选中，我们使用了由药物发现计划(东京大学，日本东京)建立的9，600种合成化学品。所有化合物(10 Mm)在DMSO中溶解，预分配到384井Alphaplate(250 nL/井)。用FlexDrop配药器(Perkinelmer)将含1L旗标记GATA 3蛋白的10只诱饵蛋白混合物配伍到Alphaplate-384平板(猫#6005350)中，并将Alphaplate-384平板(Perkinelmer)中的5L生物素化DNA(最终浓度为4 NM)混合在Alphaplate-384平板上。然后在26℃下孵育1h，孵育1h后加入10 L检测混合物，再在26℃下孵育1h，用AlphaScreen信号检测程序(PerkinElmer)对α屏幕信号进行检测。

在不同浓度吡咯硫代加温(0~200 M)存在下，对GATA 2和GATA 5进行了IC 50测定。所得数据用GraphPad棱镜8.0版的4参数非线性回归进行拟合.

吡咯硫代甘氨酸(3-(2，5-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)thiophene-2-carboxylic酸)

Pyrrothiogatain(化学文摘社编号：477888-48-5)是从依纳明(CAT#en300-51104)和圣克鲁斯(CAT#sc-352288A)购买的。

电泳迁移率测定

电泳迁移率变化试验如前所述。20...简单地说，四个GATA家族蛋白(GATA 2至GATA 5)与a32P标记GATA结合DNA探针在4°C存在或不存在吡咯硫代甘氨酸(0~100μm)时，作用20 min。在4%聚丙烯酰胺凝胶上，从游离寡核苷酸中分离出dna-蛋白复合物，然后，32用Fla 7000号台风(GE Healthcare)检测P标记的DNA探针.

MTS法

用5%CO在37℃培养Jurkat细胞2在RPMI 1640培养基(CAT#72400047；热费雪)中，是否存在吡咯硫代甘氨酸(0~100μm)。用CellTiter 96测量细胞活力®水溶液细胞增殖试验(CAT#G 3582；Promega)根据制造商的协议。

荧光素酶报告试验

IL-5启动子的活性如前面所述。22,23...简单地说，HEK293T细胞共转染萤火虫荧光素酶报告子(pGL3-IL-5启动子)、肾素荧光素酶质粒(renilla luciferase，pcDNA 3.1)和转化LTI Regent(Cat#MIR 2304，Mirus)的表达载体(pcDNA3.1)。转染后6h，分别用吡咯硫代氨基胍(0~30 M)和PMA(30 ng/mL)作用18h。用双荧光素酶报告系统(CAT#E 1910，Promega)测定荧光素酶活性。

免疫沉淀

免疫共沉淀分析GATA 3和SOX 4。在含吡咯硫代甘氨酸(0~100 M)的条件下，用重组标志GATA 3和AGIA-Sox 4与10 L抗旗标M2亲和琼脂糖凝胶(CAT#A 2220，Sigma-Aldrich)在4°C旋转2 h，进行标记gta 3的免疫沉淀，并对琼脂糖凝胶进行3次洗涤，然后用抗标记M2抗体和抗AGIA-HRP免疫印迹法检测免疫沉淀蛋白。36.

CD4+T细胞分化培养

C57BL/6小鼠从日本东京Clea日本公司购买。总CD4+用FITC抗小鼠CD4抗体(Cat#100510，RM 4-5，BioLegend)和抗FITC-微球(Cat#130-097-050，Miltenyi Biotec)制备小鼠脾T细胞。幼稚CD4+T细胞(CD 44)低层、CD62L高)用MojoSort小鼠CD4 T细胞分离试剂盒(猫#480033)制备。生物素化抗CD 44(猫#103004，IM7)和抗CD 25抗体(猫#102004，PC 61)是从BioLegend购买的.CD4+T细胞(7.5×10)5用固定化抗TCR-β单抗(3g/mL，H57-597，BioLegend)加抗CD 28单抗(1.0g/mL，CAT#40-0281，TONBO生物科学)刺激2d，然后在类似条件下进一步扩增3天。IL-2条件：IL-2(10 ng/mL，Pepro Tech)；Th2条件：IL-2(10 ng/mL，Pepro Tech)，IL-4(1ng/mL，pepro Tech)和抗IFN-γ单抗(2.5g/mL，CAT#40-731，TONBO生物科学)。Th1条件：IL-2(10 ng/mL，Pepro Tech)，IL-12(1ng/mL，Pepro Tech)，抗IL-4 mAb(2.5g/mL，CAT#40-731，TONBO生物科学)。培养细胞进行细胞内染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR).所有的动物实验都得到了爱希米大学动物保护管理小组的批准。所有的动物护理都是按照Ehime大学的指导方针进行的。

细胞因子和转录因子的细胞内染色

这个离体分化CD4+用固定化抗TCR-β单抗(3mg/ml，H57-597，BioLegend)刺激T细胞6h。细胞固定于4%多聚甲醛(Cat 163-20145，wao)，渗透缓冲液(50 mmNaCl，5mmEDTA，0.02%NaN)。3，0.5%TritonX-100)。然后用抗IL-4-PE(Cat#504103，BioLegend，1：50)，抗IL-5-APC(猫#504305，BioLegend，1：50)，抗IL-13-PE(Cat#12-7133-41，eBiosience，1：50)，抗IFN-γ-fITC(Cat#562019，BD生物科学，1：500)和抗IL-2-APC(Cat#503809，BioLegend，1：50)对细胞进行染色。GATA 3细胞内染色采用Foxp 3/转录因子染色缓冲液试剂盒(CAT#TNB-0607，TONBO)。流式细胞仪用Gallios流式细胞仪(贝克曼库尔特)和FACS口径仪(BD生物科学)进行流式细胞仪检测，结果用Flowjo软件程序(TreeStar，Ashland，OR，USA)进行分析。

ELISA法

CD4+用固定化抗TCR-β单抗(3g/mL，H57-597，BioLegend)刺激T细胞培养5d，培养16h后恢复培养上清液。The amount of cytokines in the recovered supernatants was determined with ELISA using the following antibodies and reagents：anti-IL-4 mAb(Cat#554387，BD Biosciences)，biotin-anti-IL-4 mAb(Cat#554390，BD Biosciences)，anti-IL-5 mAb(Cat#554393，BD Biosciences)，biotin-anti-IL-5 mAb(Cat#554397，BD Biosciences)，anti-IFN-γmAb(Cat#551216，BD Biosciences)，biotin-anti-IFN-γmAb(Cat#554410，BD Biosciences)，anti-IL-2 mAb(Cat#554424，BD Biosciences)，生物素-抗IL-2mAb(Cat#554426，BD生物科学)，链霉亲和素辣根过氧化物酶(Cat#434323，Invitrogen)和TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒(CAT#1721066，BioRad)。IL-13采用小鼠IL-13双酶联免疫吸附试验(Cat#DY 413，R&D系统)检测IL-13细胞因子水平。所有的抗体和试剂都是根据制造商的协议使用的。

定量RT-PCR

用三试剂(分子研究中心，Inc.)分离总RNA。反转录和qRT-PCR分别用转录因子第一链cDNA合成试剂盒(CAT#04379012001，Roche)和FastStart必需的DNA绿色母细胞(CAT#06402712001，Roche)进行。qRT-PCR primers were used as follow；IL-4：5′-GATCGGCATTTTCAACGAG-3′(forward)，5′-CGAGCTCACTCTCTGTGGTG-3′(reverse)；IL-13：5′-ACCCAGAGGATATTGCATGG-3′(forward)，5′-TGGGCTACTTCGATTTTGGT-3′(reverse)；IFN-γ：5′-ATCTGGAGGAACTGGCAAAA-3′(forward)，5′-TTCAAGACTTCAAAGAGTCTGAGGTA-3′(reverse)；IL-2：5′-GCTGTTGATGGACCTACAGGA-3′(forward)，5′-TTCAATTCTGTGGCCTGCTT-3′(reverse)；GATA 3：5‘-TTATAAGCCCACAAGCGAAG-3’(前进)，5‘-TGGGGTGTCTGACAGTT-3’(反向)；和Tbx 21：5‘-TCACACACACAGAG-3’(前进)，5‘-AAACATCCTCCTGTAATGGCTTGTG-3’(反向)。

染色质免疫沉淀试验

采用Magna芯片染色质免疫沉淀试剂盒进行芯片分析，根据制造商的协议(默克-米利波)。采用抗GATA 3抗体(CAT#AF 2605，R&D系统)进行染色质免疫共沉淀。对Th2细胞因子基因位点和罗氏通用探针的特异性引物为：V。Asite in the IL-4 enhancer：5′-GCCTGTTTCCTCTCAGCATT-3′(forward)，5′-TGATAAAAGTGACTTGAAGGTTGG-3′(reverse)，probe#4；IL-4 IE：5′-CCCAAAGGAGGTGCTTTTATC-3′(forward)，5′-AAATCCGAAACTGA GGAGTGC-3′(reverse)，probe#75；CGRE：5′-CTCTCCTGGTGGCGTGTT-3′(forward)，5′-CTTTGCGCACCCTTGAAC-3′(reverse)，probe#53；IL-5p：5‘-TCATTATGAATTGAGTTTAACA-3’(前进)，5‘-GATGCTTTTGAGCAC-3’(反向)，探针#43；

每次实验的统计分析和重复次数

采用双尾非配对t检验(Microsoft Excel，USA)计算统计显着性.差异有统计学意义(p<0.05)。全离体试验至少重复了三次。